T細胞活化的核因子（NFAT）是一類轉(zhuǎn)錄因子，在T細胞受體激活后負責調(diào)節(jié)淋巴細胞中細胞因子的表達。NFATc2是NFAT家族中的一員。NFATC2約占靜止期T細胞中總NFAT的80%～90%，主要參與調(diào)節(jié)細胞因子如干擾素γ、白細胞介素4、IL-5 和IL-13的表達。NFAT蛋白在靜止期T細胞中以磷酸化蛋白的形式存在于細胞質(zhì)中，一旦T細胞通過T細胞受體被激活，T細胞內(nèi)的鈣離子水平持續(xù)升高進而使鈣離子依賴性的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶激活。活化的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶進一步使NFAT蛋白發(fā)生去磷酸化，并移位至細胞核，從而驅(qū)動細胞因子和細胞表面受體等靶基因的表達。NFAT蛋白隨后被糖原合酶激酶-3重新磷酸化并轉(zhuǎn)移回細胞質(zhì)。除了在淋巴細胞中起到關(guān)鍵作用外，NFAT蛋白在心肌細胞和骨骼肌細胞中也廣泛表達，對心肌和骨骼肌的發(fā)育發(fā)揮重要的作用。

首先，重視預算編制，在預算編制中，重點關(guān)注經(jīng)費支出數(shù)據(jù)，確保這類數(shù)據(jù)編制的合理性和有用性。其次，預算執(zhí)行過程中，加強對經(jīng)費開支數(shù)據(jù)的監(jiān)控和審核，針對實際經(jīng)費開支情況與預算數(shù)進行對比分析，查找原因，及時提出改進建議。最后，重視預算管理，有條件的事業(yè)單位，比如自收自支型事業(yè)單位，可以將經(jīng)費開支情況與績效考核相掛鉤，嚴格經(jīng)費管控，對經(jīng)費超標行為嚴厲打擊，防止資金浪費。

有研究發(fā)現(xiàn)，NFATc2抑制T輔助細胞（Th2）分泌Th2細胞因子，減輕Th2介導的過敏性免疫反應，同時抑制NFATC2會削弱Th2的反應，從而緩解化療藥物天冬酰胺酶引起的超敏反應。更有學者指出，NFATc2是人類黑色素瘤的潛在治療靶點。目前國內(nèi)外有關(guān)NFATC2的研究主要聚焦在NFATC2調(diào)節(jié)T細胞功能以及NFATC2在腫瘤篩查中診斷價值，然而有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控NFATC2轉(zhuǎn)錄表達的研究鮮有報道，NFATC2在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控仍然不明確。有研究初步證實轉(zhuǎn)錄因子RUNX2 是NFATC2 基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子，但RUNX2如何上調(diào)NFATC2基因的表達以及RUNX2在NFATC2基因上的具體結(jié)合位點尚不清楚。RUNX2對NFATC2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍需進一步明確。

圖3為設(shè)計線寬為100 μm,方阻數(shù)為20的NiCr薄膜電阻的實際線寬。由圖3可見,制備的薄膜電阻的線寬精度≤±5%。

因此，為更好地闡明NFATc2 表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，本研究通過構(gòu)建人NFATc2基因啟動子的熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒pGL3-NFATc2-promoter，并轉(zhuǎn)染到人胚腎上皮細胞293F中驗證其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，進一步運用點突變技術(shù)突變轉(zhuǎn)錄因子RUNX2潛在結(jié)合位點探究二甲雙胍和脂多糖（LPS）對NFATc2轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

293F細胞株、pGL3-basic質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒、細菌脂多糖LPS、二甲雙胍由本實驗室保存?；蚪MDNA提取試劑盒、感受態(tài)細胞DH5α、凝膠回收試劑盒、超保真DNA聚合酶、一步法克隆試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染脂質(zhì)（Gibco）。限制性內(nèi)切酶Ⅰ和d Ⅲ（NEB）。瓊脂粉（Agar）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出粉（Yeast Extract）（Oxoid）。引合成與測序由北京擎科生物科技有限公司完成。所用儀器：PCR 儀（Bio-Rad）；電泳儀（北京百晶）；凝膠圖像分析儀Tanon-2500（上海天能公司）；Spectra MAX M5酶標儀（Molecular Device）；超微量蛋白核酸分析儀Biodrop（英國柏楉）。

1.2 細胞培養(yǎng)和DNA提取

所有實驗結(jié)果均重復3次。應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用兩獨立樣本檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

在納入的10篇研究[2-11]中，均報道了治療的疾病控制率，樣本量共620例：替吉奧組309例，卡培他濱組311例。各研究間具有同質(zhì)性（P=0.98，I2=0%），采用固定效應模型。結(jié)果顯示，替吉奧組與卡培他濱組在疾病控制率上無明顯差異，無統(tǒng)計學意義[OR=1.18，95%CI：（0.84，1.66），P=0.34]，見圖 1。

其次，這種思維差異體現(xiàn)在句子的時間順序和邏輯順序上。英語的語法中存在時態(tài)，可以通過動詞形式的變化來表現(xiàn)動作發(fā)生的先后順序，同時還可以使用大量分詞和從句，用法靈活，可前可后。而漢語中不存在英語中的那些手段，敘事多靠并列結(jié)構(gòu)，所以更加依賴句中各成分之間的順序，尤其是漢語中的時間順序和邏輯順序。其中，較為典型的邏輯順序差異就是：英語句中習慣“先果后因”，而漢語卻喜歡“先因后果”。因此，在英譯漢時，我們就需要在理解句意的基礎(chǔ)上，按照事情發(fā)生的先后順序或者根據(jù)事件中所包含的邏輯順序，適當?shù)卣{(diào)整譯文的順序，使其更符合漢語思維，如下例：

1.3 PCR擴增人NFATC2基因啟動子片段和回收純化

在USCS基因數(shù)據(jù)庫中查找人NFATC2基因的啟動子序列，選取長度為2170 bp（-2155 bp～+15 bp）的DNA 序列作為本項目研究的啟動子片段。應用CE Design V1.04引物設(shè)計軟件，以Ⅰ和dⅢ為酶切位點分別設(shè)計上游引物5'-atttctctatcgataggtaccCCC CAGGCCCCTGCAGTA-3'和下游引物5'-cagtaccggaa tgccaagcttCGCGAGCTTCCTGCTCCG-3'。以基因組DNA為模板擴增目的啟動子片段：在PCR反應管中依此加入ddHO，基因組DNA，上下游引物，2×Phanta Max Buffer，dNTP Mix，PhantaMax超保真DNA聚合酶。PCR反應條件如下：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸150 s，共35個循環(huán)，72 ℃徹底延伸5 min。反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在切膠儀上切下目的產(chǎn)物并利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。同時用相同的下游引物分別構(gòu)建2077 bp NFATC2 基因啟動子片段（上游引物5'-atttct ctatcgataggtaccCTGATGCCTAAGTCCCAACCC-3'）、1802 bp NFATC2 基因啟動子片段（上游引物5'-attt ctctatcgataggtaccTGGAATGATGGATGGCTTGG-3'），1651 bp NFATC2基因啟動子片段（上游引物5'-atttctct atcgataggtaccCCCGTCTAATCTTCTCATCCTCA-3'），1083 bp NFATC2基因啟動子片段（上游引物5'-atttctc tatcgataggtaccTTTAGTTACTGGGTCCTTATGCAGT G-3'）和323 bp NFATC2基因啟動子片段（上游引物5'-atttctctatcgataggtaccCTGATGCCTAAGTCCCAACCC-3'）。

1.4 pGL3-basic質(zhì)粒雙酶切及回收純化

應用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和dⅢ對pGL3-basic質(zhì)粒進行雙酶切，酶切條件為：pGL3-basic 質(zhì)粒2 μL（2 μg)，Ⅰ(10 U/μL)2 μL，dⅢ（20 U/μL）2 μL，10×CutSmart Buffer 5 μL，ddHO 39 μL，共50 μL。37 ℃酶切4 h，反應完成后將酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠回收。

1.5 重組和轉(zhuǎn)化

將293F細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d接種2×10細胞于24孔板中，在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。直至細胞融合度達到80%時，按照Lipofectamine 3000試劑盒操作說明，分別以0.8 μg/孔pGL3-basic質(zhì)粒（對照組）和pGL3-NFATC2-promoter質(zhì)粒（實驗組）的劑量瞬時轉(zhuǎn)染293F細胞，同時以0.1 μg/孔pRL-TK海腎熒光素酶表達質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染效率內(nèi)參照，每組分別設(shè)置3個復孔。

1.2 納入標準 （1）參考《中國心力衰竭診斷和治療指南 2014》［4］確診為慢性心力衰竭；（2）參考《室性心律失常中國專家共識》［5］確診為室性心律失常；（3）NYHA心功能分級Ⅲ—Ⅳ級；（4）左室射血分數(shù)（LVEF）≤40%；（4）用藥及隨訪依從性高；（5）對本研究知情且簽署同意書。

1.6 陽性克隆的鑒定和質(zhì)粒抽提

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，吸掉培養(yǎng)基，每孔細胞用PBS洗滌兩次。根據(jù)Vazyme公司的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual Luciferase Reporter Assay Kit）操作說明，加入100 μL/孔細胞裂解液，室溫下振搖裂解5 min，吹打并吸取細胞裂解產(chǎn)物至1.5 mL離心管中，12 000 g常溫離心2 min。吸取20 μL細胞裂解上清至酶標板中，加入100 μL/孔Luciferase Substrate，迅速混勻后讀取螢火蟲熒光素酶發(fā)光值。然后再加入100 μL Renilla底物工作液（螢火蟲熒光素酶終止液和海腎熒光素酶的底物），迅速混勻后讀取海腎熒光素酶發(fā)光值。每組細胞重復測量3次，以螢火蟲熒光素酶發(fā)光值與海腎熒光素酶發(fā)光值的比值作為衡量NFATC2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的依據(jù)。

1.7 NFATC2啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293F細胞

將回收得到的NFATC2啟動子片段與pGL3-basic質(zhì)粒片段應用重組克隆試劑盒進行重組反應。反應結(jié)束后取10 μL 重組產(chǎn)物與50 μL 感受態(tài)細胞DH5α混勻，冰上靜置30 min，42 ℃熱激90 s，冰上放置3 min，加入600 μL LB 培養(yǎng)基（不含抗生素），37 ℃搖菌1 h（220 r/min），5000 r/min離心1 min，加入100 μL培養(yǎng)基重懸，取50 μL 涂于LB 固體培養(yǎng)平板（含Ampicillin）上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。

1.8 NFATC2啟動子活性鑒定

挑取5個菌落接種于800 μL的LB液體培養(yǎng)基（含Ampicillin）中，37 ℃搖菌4 h，取1 μL菌液進行菌液PCR鑒定，挑選菌液PCR鑒定為陽性的菌液送至北京擎科生物科技有限公司測序進一步鑒定。將測序鑒定正確的陽性克隆進行擴大培養(yǎng)并提質(zhì)粒。

1.9 二甲雙胍和LPS對NFATc2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

293F 細胞轉(zhuǎn)染pGL3-1651 bp NFATC2-promoter質(zhì)粒24 h，分別給予二甲雙胍濃度梯度（2.5、5、10 mmol/L）和LPS濃度梯度（2、5、10、20μg/mL,）處理24 h后收集細胞測定各組熒光素酶活性。接著分別將pGL3-1651 bp NFATC2-promoter 質(zhì)粒和pGL3-1651bp NFATC2-promoter突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293F細胞24 h，接著給予二甲雙胍（10 mmol/L）和LPS（5μg/mL）處理24 h，收集細胞測定轉(zhuǎn)錄因子RUNX2結(jié)合位點突變前后各組熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學方法

293F細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基接種至3.5 cm細胞培養(yǎng)皿，待細胞密度達95%，收集細胞。按照基因組DNA 提取試劑盒操作說明提取293F 細胞的基因組DNA，應用超微量核酸分析儀Biodrop測定提取的基因組DNA產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果

2.1 NFATC2啟動子序列的擴增

將pGL3-basic 空載質(zhì)粒和pGL3-NFATC2-promoter 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293F 細胞，24 h 后測得轉(zhuǎn)染pGL3-basic 空載質(zhì)粒組的熒光數(shù)值為0.18±0.18，轉(zhuǎn)染pGL3-NFATC2-promoter 質(zhì)粒組的熒光數(shù)值為0.55±0.09，pGL3-NFATC2-promoter 質(zhì)粒組比pGL3-basic空載質(zhì)粒組的熒光素酶活性高約3.04倍（=3.178,df=4,=0.0336，圖5）。

2.2 pGL3-NFATC2-promoter載體的構(gòu)建

應用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和dⅢ對pGL3-basic質(zhì)粒進行雙酶切，結(jié)果見圖1B，泳道2為未進行雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒，泳道3-4為雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒，由于雙酶切破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)，因此酶切的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中的遷移速度較慢。凝膠回收酶切后的pGL3-basic質(zhì)粒，與NFATC2啟動子片段進行重組連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取5個平板克隆進行菌液PCR鑒定（圖2），5個克隆均在2000 bp附近可見清晰條帶，與目的片段大小基本一致。挑選陽性克隆測序，測序結(jié)果顯示NFATC2基因啟動子成功插入到pGL3-basic 載體中，所構(gòu)建質(zhì)粒與設(shè)計相符（圖3），且未發(fā)現(xiàn)堿基突變或缺失。同時，按照相同的方法利用已構(gòu)建好的pGL3-NFATC2-promoter重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建不同片段長度的NFATC2基因啟動子報告基因載體，分別為2077 bp（-2062 bp～+15 bp）、1802 bp（-1787 bp～+15 bp）、1651 bp（-1636 bp～+15 bp）、1083 bp（-1068 bp～+15 bp）和323 bp（-308 bp～+15 bp），凝膠電泳結(jié)果顯示各個片段擴增條帶與相應目的片段大小一致（圖4）。

2.3 NFATC2啟動子報告基因轉(zhuǎn)染細胞后熒光素酶表達

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1A），在2000 bp附近可見清晰條帶，與NFATC2基因啟動子PCR擴增片段大小相符。對該片段進行凝膠回收，測定濃度為136 ng/μL。

海島是我國海洋國土的重要組成部分，也是海洋經(jīng)濟發(fā)展及國防建設(shè)的重要基點。海島工業(yè)污染源較少，生活垃圾和生活污水是海島的主要污染來源；隨著海島的開發(fā)和建設(shè)大力推進，生活垃圾和污水產(chǎn)量日益增加[1-3]。海島生活垃圾處理方式和設(shè)施的選擇，必須根據(jù)海島生活垃圾產(chǎn)生現(xiàn)狀和理化特征等基本資料和實際情況進行設(shè)計。國內(nèi)對生活污染源的研究主要集中于內(nèi)陸農(nóng)村地區(qū)，海島地區(qū)生活污染物排放規(guī)律、理化特性研究較少。我國海島大部分面積較小，多為村鎮(zhèn)級海島。筆者以廣東省2個村鎮(zhèn)級海島(外伶仃島、東澳島)為研究地點，對生活垃圾產(chǎn)生量、理化特性和生活污水排放系數(shù)、污染物濃度進行研究。

2.4 NFATC2啟動子不同片段長度的熒光素酶表達量

為了探究NFATC2啟動子上的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域及其潛在轉(zhuǎn)錄因子，我們構(gòu)建了6 個不同片段長度的NFATC2啟動子報告基因載體，分別是pGL3-2170 bp、pGL3-2077 bp、pGL3-1802 bp、pGL3-1651 bp、pGL3-1083 bp、pGL3-323 bp，并將其分別轉(zhuǎn)染293F細胞，結(jié)果顯示6組差異有統(tǒng)計學意義（=121.6,＜0.001）。進一步運用Dunnett's多重比較檢驗，顯示pGL3-1802 bp組與pGL3-2170 bp組差異沒有統(tǒng)計學意義（＞0.05），其余各組與pGL3-2170 bp組之間差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05），而且轉(zhuǎn)染pGL3-1651 bp質(zhì)粒達到最大的熒光素酶表達量（圖6）。

2.5 LPS和二甲雙胍對NFATC2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

將pGL3-1651bp報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293F細胞，分別使用LPS和二甲雙胍刺激細胞。LPS組4個不同濃度之間差異有統(tǒng)計學意義（=6.811,=0.0065），而且均對NFATC2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性有激活作用，其中以5 μg/mL 的效果最顯著（圖7B）。然而二甲雙胍對NFATC2 啟動子的轉(zhuǎn)錄具有雙向調(diào)節(jié)作用（=33.10,＜0.0001），低濃度的二甲雙胍（2.5 mmol/L）對NFATC2的啟動子起抑制作用，而中高濃度的二甲雙胍（5、10 mmol/L）則對NFATC2啟動子的轉(zhuǎn)錄具有激活作用。

為進一步探究LPS和二甲雙胍調(diào)控NFATC2轉(zhuǎn)錄的潛在機制，將pGL3-1651 bp質(zhì)粒上轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的結(jié)合位點進行點突變（圖8A），構(gòu)建pGL3-1651 bp突變質(zhì)粒（pGL3-1651bp-Mutation），并將轉(zhuǎn)染到293F細胞。結(jié)果顯示，RUNX2的結(jié)合位點突變后，LPS和二甲雙胍對NFATC2的轉(zhuǎn)錄激活作用下調(diào)（=0.0179，圖8B；＜0.0001，圖8C）。

3 討論

NFATc2可以抑制成年動物軟骨細胞的生長和分化，小鼠敲除NFATc2基因后導致關(guān)節(jié)外軟組織中的細胞自分化形成軟骨，而老年小鼠中一旦NFATc2蛋白喪乏功能將導致軟骨細胞不受控制地增殖。此外，膠質(zhì)母細胞瘤中NFATc2的表達明顯上調(diào)，NFATc2敲低后顯著抑制膠質(zhì)母細胞瘤的增殖。由此可見NFATC2 在各種病理生理過程中扮演極其重要的作用。近年來越來越多的研究表明NFATC2與黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［，提示NFATC2很可能是黑色素瘤的潛在治療靶點。因此，本研究旨在通過構(gòu)建NFATC2熒光素酶報告基因探討NFATC2在轉(zhuǎn)錄水平上的表達調(diào)控機制，為臨床篩查抗腫瘤藥物的分子生物學機制奠定基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了人NFATc2基因啟動子的熒光素酶報告基因，并在293F細胞中驗證了其轉(zhuǎn)錄活性。與此同時，本研究構(gòu)建了6個不同片段長度的NFATc2基因啟動子報告基因載體，發(fā)現(xiàn)不同片段長度的NFATc2 基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性不盡相同，與長度為2170 bp 的NFATc2 基因啟動子相比，長度為1651、1083、323 bp的NFATc2基因啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加，而長度為2077 bp和1802 bp的NFATc2基因啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性或降低或不變，這與Kannan等研究結(jié)果基本一致。令人驚喜的是，我們證實片段長度為1651 bp的NFATc2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性最高，提示NFATc2基因啟動子-1636 bp～+15 bp的區(qū)域可能為NFATc2基因的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域。有研究表明骨髓來源的樹突狀細胞暴露于高劑量LPS可上調(diào)NFATc2的表達以及核移位，增加細胞凋亡從而阻止實驗性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎進展。本研究實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在293F細胞轉(zhuǎn)染了NFATc2報告基因24 h后再給予不同濃度的LPS刺激24 h均能增加NFATc2報告基因的活性，在LPS 5μg/mL的濃度下NFATc2報告基因的活性最高，當LPS濃度提高到10或20μg/mL，NFATc2報告基因的活性有所下降，說明LPS對NFATc2轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的最適劑量是5μg/mL。二甲雙胍是2型糖尿病患者使用最廣泛的降糖藥物，目前國內(nèi)外還沒有研究闡明二甲雙胍對NFATc2的調(diào)控作用，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對NFATc2報告基因的轉(zhuǎn)錄活性具有雙向調(diào)控作用，2.5 mmol/L的二甲雙胍顯著抑制NFATc2報告基因的轉(zhuǎn)錄活性，而5 mmol/L和10 mmol/L的二甲雙胍明顯增加NFATc2報告基因的轉(zhuǎn)錄活性，本研究首次證實二甲雙胍可從基因轉(zhuǎn)錄層面調(diào)控NFATc2的表達。

RUNX2是成骨細胞分化必不可少的最上游轉(zhuǎn)錄因子，序列分析揭示NFATC2基因啟動子上存在多個轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的潛在結(jié)合位點，成纖維細胞、間充質(zhì)細胞和軟骨細胞中過表達RUNX2 顯著增加NFATc2 基因的轉(zhuǎn)錄活性，提示NFATc2 基因可能是RUNX2的潛在下游調(diào)控基因，但RUNX2與NFATC2基因啟動子上哪個位點結(jié)合并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用尚未證實。因此，我們將NFATc2基因啟動子-1636 bp～+15 bp區(qū)域的一個潛在RUNX2結(jié)合位點（-1632 bp～-1626 bp）進行點突變，發(fā)現(xiàn)突變前后NFATc2報告基因活性并沒有明顯變化，然而突變后再給予LPS或二甲雙胍刺激，NFATc2 報告基因的活性均顯著受到削弱，由此證實LPS 和二甲雙胍誘導NFATC2 的轉(zhuǎn)錄激活依賴于RUNX2 在NFATC2 啟動子上的結(jié)合位點（-1632 bp～-1626 bp），提示NFATC2 基因啟動子上-1632 bp～-1626 bp的RUNX2結(jié)合位點很可能是RUNX2的一個主要調(diào)控位點，這在既往研究中未見報道。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建人NFATC2基因啟動子的熒光素酶報告基因，并證實NFATc2 基因啟動子-1636 bp～+15 bp的區(qū)域為NFATc2基因的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域。我們首次證實LPS和二甲雙胍對NFATc2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，LPS和二甲雙胍對NFATc2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)依賴于轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，且依賴于NFATC2基因啟動子上-1632 bp～-1626 bp的RUNX2結(jié)合位點。后續(xù)我們將在此報告基因質(zhì)粒的基礎(chǔ)之上圍繞NFATC2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，深入探討LPS和二甲雙胍在相關(guān)的人類疾病模型中的具體作用及其分子機制。