陳 瓊，金毓莉，杭遠遠，徐 梅，唐苾芯

(1.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437；3.上海市黃浦區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200010；4.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院，上海 200135)

卵巢儲備功能是指卵泡在卵巢皮質中生長并形成可受精卵泡的能力，包括女性剩余卵母細胞的數(shù)量和質量[1]。育齡期女性隨著年齡的增長，卵巢中募集的卵泡逐漸減少，卵子的質量也在下降，這一過程稱為卵巢儲備功能降低(Decreased ovarian reserve，DOR)，預示著生育能力下降，在1～6年內有發(fā)展成為卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的風險[2]。2004—2011年，美國DOR患病率從19%升高至26%[3]。DOR的主要癥狀包括40歲以前女性出現(xiàn)月經紊亂、閉經和不孕，并伴有圍絕經期癥狀，如潮熱、盜汗，與反復流產、不明原因的不孕、輔助生殖反復種植失敗、先兆流產等生育問題密切相關。因此，有效治療DOR對不孕夫婦和提高女性生活質量具有重要意義。

中醫(yī)藥基于“治未病”的思想上治療DOR具有獨特優(yōu)勢。蔡氏婦科育腎助孕方的臨床療效顯著，前期研究證實，育腎助孕方可上調卵巢抗凋亡因子Bcl-2的表達，下調促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達，從而抑制卵巢顆粒細胞凋亡[4]，促進卵泡生長、分泌，起到改善卵巢儲備功能的作用[5]。細胞凋亡指為維持細胞內環(huán)境平衡的一種程序性死亡。MAPK信號通路(包含ERK通路和JNK通路)與細胞分化、增殖和凋亡密切相關。有研究證實ERK和JNK信號通路在卵巢細胞凋亡中起關鍵作用，是Bcl-2、Bax、Caspase-3的上游激酶[6]。故本研究結合前期研究結果，以DOR大鼠模型為研究對象，觀察育腎助孕方對卵巢組織中ERK1/2及JNK1/2蛋白活化的影響，探討其作用機制，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用健康清潔級雌性SD大鼠，12周齡，48只，體重250～280 g，上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，許可證號：SYXK(滬)2009-0086，檢疫合格備用。大鼠飼養(yǎng)在上海市第一人民醫(yī)院清潔級實驗動物中心，室內保持恒定溫度、濕度，相對濕度為40%～60%。

1.2 實驗藥物及制備 雷公藤多苷片：10 mg/片，江蘇美通制藥有限公司(批號：131029)，以純凈水溶化，配制濃度為5 mg/ml。戊酸雌二醇片(補佳樂)：1 mg/片，用純凈水溶化，配制濃度為0.05 mg/ml。育腎助孕方免煎顆粒劑(由廣州一方中藥廠提供)：白茯苓12 g，熟地、山萸肉、淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉、鹿角霜、醋龜板各10 g，上述藥物等量免煎顆粒劑劑量為：熟地2.5 g，白茯苓0.6 g，山萸肉、巴戟天各3 g，淫羊藿、鹿角霜各0.5 g，肉蓯蓉2.5 g，醋龜板0.7 g，純凈水配制成低、中、高3個濃度混懸液，4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?，灌胃前搖勻。

1.3 主要試劑與儀器 p-ERK抗體，美國CST公司(批號：4370S)；ERK抗體，美國CST公司(批號：4376S)；p-JNK抗體，美國CST公司(批號：4668)；JNK抗體，美國CST公司(批號：9252)；GAPDH抗體，美國CST公司(批號：5174)；羊抗兔HRP標記二抗，上海碧云天生物技術有限公司(批號：A0208)；羊抗鼠HRP標記二抗，上海碧云天生物技術有限公司(批號：A0216)；RIPA組織細胞快速裂解液，上?；鶢栴D生物有限公司(批號：BYL40825)；BCA蛋白定量試劑盒，美國Thermo Scientific公司(批號：PICPI23223)；NC膜，美國millipore公司(批號：HATF00010)；蛋白預染Marker，加拿大Fermentas公司(批號：SM1811)；發(fā)光液，美國Millipore公司(批號：WBKLS0100)；mini protean 3 cell電泳儀(美國Bio-Rad公司)；PS-9型電轉儀(大連競邁科技有限公司)；MK3型酶標儀(芬蘭雷勃公司)；CX41型正置顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.4 分組及給藥 將48只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法分為六組：對照組，模型組，補佳樂組，育腎助孕方低、中、高劑量組，每組8只。每組連續(xù)2周上午及下午各灌胃1次。對照組：每日2次灌胃3 ml 0.9%氯化鈉水溶液；模型組：雷公藤多苷造模劑量按照50.00 mg/kg體積灌胃，雷公藤多苷溶液及0.9%氯化鈉水溶液各1次；補佳樂組：補佳樂按照0.21 mg/kg體積灌胃，雷公藤多苷溶液及補佳樂溶液各1次；育腎助孕方低、中、高劑量組按照臨床等效劑量的0.5倍(0.69 g/kg)、1倍(1.38 g/kg)和2倍(2.76 g/kg)給藥，每次灌胃前搖勻，每組雷公藤多苷溶液及各濃度育腎助孕方中藥溶液各1次。以上給藥劑量均根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算出藥液體積稀釋為3 ml。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 取材：大鼠處死后在無菌條件下取出卵巢，稱重，部分卵巢福爾馬林固定，部分卵巢置于-80 ℃冰箱待用。

1.5.2 卵巢組織形態(tài)觀察：卵巢置于福爾馬林中固定48 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋切片，片厚4 μm，常規(guī)HE染色，置于顯微鏡下觀察卵泡、黃體及顆粒細胞等變化。

1.5.3 Western blot法檢測卵巢組織ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2及p-JNK1/2蛋白表達：將卵巢組織剪成細小的碎片，按每20 mg組織加入150～250 μl裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解，離心15 min，取上清，進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱。用BCA試劑盒檢測蛋白含量。按實驗常規(guī)上樣、電泳、轉膜后，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入一抗(ERK1/2 1∶1000稀釋，p-ERK1/2 1∶1000稀釋，p-JNK1/2 1∶800稀釋，JNK1/2 1∶1000稀釋，GAPDH 1∶1500稀釋)，4 ℃過夜孵育；之后加入二抗，與膜37 ℃孵育1 h。ECL化學發(fā)光法顯影。膠片掃描后獲得圖像，計算目的蛋白條帶與內參GAPDH蛋白條帶的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，所有統(tǒng)計圖采用Graph Pad Prism軟件繪制。組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 卵巢組織病理觀察結果 對照組卵巢結構清晰，可見生長卵泡數(shù)量、形態(tài)正常，顆粒細胞多層排列整齊，卵泡液含量多，可見發(fā)育好、體積大的黃體；模型組見部分卵巢萎縮，生長卵泡數(shù)量減少、閉鎖卵泡數(shù)量增多，顆粒細胞排卵紊亂且層數(shù)減少，黃體數(shù)減少、體積減??；補佳樂組卵巢組織形態(tài)與對照組相近，可見生長卵泡，但閉鎖卵泡較對照組多；育腎助孕方低劑量組較模型組卵巢組織形態(tài)有所改善，卵泡數(shù)量比對照組少，黃體數(shù)目也比對照組少；育腎助孕方中、高劑量組卵巢形態(tài)與對照組相似，卵泡結構清晰，顆粒細胞多層次，卵泡數(shù)目及黃體數(shù)目較模型組增多(圖1)。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)比較(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白總相對表達量及磷酸化水平比較 與對照組比較，模型組、補佳樂組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白總相對表達量比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與對照組比較，模型組和育腎助孕方低、中劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯增加(P<0.05)，補佳樂組和育腎助孕方高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與模型組比較，補佳樂組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與補佳樂組比較，育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1(圖2、3)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補佳樂組比較，△P<0.05圖2 各組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白總相對表達量及磷酸化水平比較

2.3 各組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白總相對表達量及磷酸化水平比較 與對照組比較，模型組、補佳樂組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK蛋白總相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組比較，模型組和育腎助孕方低劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平明顯增加(P<0.05)，補佳樂組和育腎助孕方中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，補佳樂組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與補佳樂組比較，育腎助孕方中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，低劑量育腎助孕方組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平明顯高于補佳樂組(P<0.05)。見表1(圖3、4)。

表1 各組大鼠卵巢組織ERK1/2和JNK1/2蛋白總相對表達量及磷酸化水平比較

A:對照組；B：模型組；C:補佳樂組；D:育腎助孕方低劑量組；E:育腎助孕方中劑量組；F:育腎助孕方高劑量組圖3 各組大鼠卵巢組織p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2蛋白表達情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補佳樂組比較，△P<0.05圖4 各組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白總相對表達量及磷酸化水平比較

3 討 論

DOR是常見的女性生殖內分泌疾病。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)DOR發(fā)病常與年齡增長、遺傳因素、自身免疫因素、盆腔因素、環(huán)境污染、不良生活方式、精神壓力等有關[7]。

中醫(yī)學中無DOR，根據(jù)其臨床癥狀可歸于“閉經”“月經后期”“斷經前后諸證”“不孕”等疾病中。生育能力是指在1個月經周期內受孕的概率，其在30歲初即開始顯著下降，幾年后(約37歲)下降得更快[8]。隨著國家二胎政策進一步開放和初產婦平均年齡逐漸升高，年齡越大，生育力越低，越來越多的高齡女性不得不面對不孕癥。據(jù)統(tǒng)計，35歲以下的不孕患者中DOR發(fā)病率約6.3%[9]。DOR是POF的早期階段，臨床表現(xiàn)無特異性，需要結合檢查如：抗苗勒管激素(AMH)下降、促卵泡刺激素(FSH)升高、雌二醇(E2)下降、FSH/LH升高、超聲下見卵巢體積縮小等。因此，若40歲之前的女性出現(xiàn)了經量減少、月經稀發(fā)、崩漏甚至閉經、圍絕經期表現(xiàn)時，應及時明確診斷，做到未病先防，已病防變，早發(fā)現(xiàn)早干預DOR。

雷公藤屬于細胞毒性藥物，具有生殖毒性。本研究中，模型組見部分卵巢萎縮，生長卵泡數(shù)目減少，顆粒細胞減少和黃體減少，各級卵泡數(shù)目減少，提示雷公藤多苷灌胃可致大鼠的卵巢功能降低，進而卵巢萎縮，該結果與杜清等[10]的結果一致。說明雷公藤多苷能夠明顯降低大鼠的卵巢儲備功能、減少卵泡數(shù)量。有研究發(fā)現(xiàn)，氟化鈉可通過促進p-ERK及p-JNK活化，降低Bcl-2表達，增加Bax表達，觸發(fā)Caspase級聯(lián)反應誘導卵巢細胞凋亡[6]。雷公藤多甙片[11]可能通過ERK、JNK信號通路誘導卵巢組織中線粒體和死亡受體凋亡途徑發(fā)生過度激活，造成細胞凋亡，抑制卵泡生長，引發(fā)卵巢功能損傷。雷公藤甲素可通過引起ERK/c-fos異常表達導致卵巢細胞凋亡[12]。JNK促進促凋亡蛋白Bax在激活時移位到線粒體，從而激活細胞凋亡[13]。本研究結果顯示模型組大鼠的p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表達較對照組明顯升高，結合前期研究結果[4]提示雷公藤多苷可能通過促進p-ERK1/2及p-JNK1/2活化，調節(jié)細胞凋亡相關因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，從而誘導DOR的發(fā)生。

蔡小蓀教授治療不孕基于《傅青主女科》云：“經水出諸腎”“經水早斷，似乎腎水衰涸”以補腎為基本法則創(chuàng)制育腎助孕方，臨床亦以補益肝腎，培元育孕為治療DOR的主要思路，育腎助孕方從六味地黃丸化裁，僅用其半，熟地、茯苓、山萸肉補脾腎和中，養(yǎng)血滋陰；淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉溫腎興陽；鹿角霜補腎強督，調理沖任，性較溫和；醋龜板滋陰潛陽，補腎益精，制約諸溫陽藥之溫燥，以使陰陽平衡而相得益彰。《醫(yī)學正傳》曰：“月經全借腎水施化，腎水既乏，則經血日以干涸”，故臨床醫(yī)家多認為DOR的主要病機在腎虛，補腎填精為治療大法[14-16]。育腎助孕方中用以大量補腎藥，在補腎的同時注意顧護脾氣，后天源源不斷生化精微，涵育先天，重振根基，從而為孕育夯實基礎。近年來多項研究表明：補腎中藥能抑制卵巢顆粒細胞凋亡[17]；干預氧化應激過程，延緩端粒衰老速度，保護卵母細胞，延緩卵巢組織衰老[18]；補腎中藥能作用于性激素、內分泌、免疫、細胞增殖等多個通路，其中補腎陽中藥在卵細胞成熟相關通路存在作用靶點[19-20]，達到從多途徑、多階段、多靶點改善DOR患者的臨床癥狀、內分泌指標以及妊娠結局的治療目的。該研究結果顯示，補佳樂和育腎助孕方各組卵巢組織形態(tài)、卵泡生長和顆粒細胞排列等較模型組改善，提示藥物治療后可能對卵巢功能有所改善，中藥濃度升高可能與改善程度正相關。補佳樂組、育腎助孕方高劑量組p-ERK1/2及p-JNK1/2表達均與對照組比較無統(tǒng)計學差異。育腎助孕方各組p-ERK1/2及育腎助孕方中、高劑量組p-JNK1/2蛋白表達與補佳樂組比較無統(tǒng)計學差異，且均明顯低于模型組。提示育腎助孕方可能通過降低p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白活化，減少卵巢顆粒細胞凋亡，抑制卵巢組織萎縮，改善DOR大鼠卵巢功能，減緩衰退進程，且育腎助孕方對卵巢功能的改善效果與其藥物濃度有關。