蔡昌君，黃惠敏，桂冬梅，尹楊艷

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，?？?570100)

病毒性心肌炎是一種彌漫性或局限性的心肌病變，通常由嗜心肌病毒感染所致[1]。由于小兒免疫系統(tǒng)尚在發(fā)育，抵抗能力較差，因此極易被病毒感染，罹患病毒性心肌炎[2]。經(jīng)過長期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，磷酸肌酸鈉和果糖二磷酸鈉用于小兒病毒性心肌炎的治療，可發(fā)揮良好的療效[3-4]。也有臨床研究結(jié)果證實(shí)，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對(duì)小兒病毒性心肌炎的療效更佳[5]。但鮮有研究探討上述聯(lián)合用藥的分子機(jī)制。微RNA(miRNA)為廣泛存在于機(jī)體中的非編碼RNA，與人類的多種疾病密切相關(guān)[6]。作為疾病標(biāo)志物，異常上調(diào)或下調(diào)的特定miRNA可能參與調(diào)控疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，其中也不乏針對(duì)病毒性心肌炎的相關(guān)報(bào)道[7]。也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)控機(jī)體中的miRNA是藥物發(fā)揮作用的方式之一[8]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，柯薩奇病毒B組(CVB)作為引發(fā)病毒性心肌炎的病毒之一，已被廣泛用于構(gòu)建病毒性心肌炎模型[9]。心肌肌鈣蛋白T(cTnT)為心肌肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白，其濃度會(huì)在心肌受到損傷后顯著升高；肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平明顯升高時(shí)，提示心肌損害；此外，心肌炎是以炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的疾病，腫瘤壞死因子α(TNF-α)為涉及系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素6(IL-6)為機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用的淋巴因子，兩者的水平也與心肌炎的病程密切相關(guān)。因此，本研究探討了磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對(duì)小兒病毒性心肌炎心肌損傷標(biāo)志物(cTnT和CK-MB)、炎癥因子(TNF-α和IL-6)水平的影響，同時(shí)篩選出受磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉影響顯著的miRNA，并進(jìn)一步通過柯薩奇病毒B組3型Nancy株(CVB3)感染心肌細(xì)胞，構(gòu)建病毒性心肌炎細(xì)胞模型，從細(xì)胞水平探討磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉發(fā)揮治療效果的分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源

依據(jù)《病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》，將2018年1月至2020年1月就診于我院的符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的2～6周歲病毒性心肌炎患兒120例作為研究對(duì)象，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、心悸和氣促。診斷標(biāo)準(zhǔn)為血清柯薩奇病毒陽性，并符合以下輔助改變之一：(1)心功能不全；(2)心臟擴(kuò)大，室壁運(yùn)動(dòng)彌漫性降低；(3)心電圖檢查顯示，以R波為主的2個(gè)以上主要導(dǎo)聯(lián)ST-T段改變，低電壓(新生兒除外)出現(xiàn)異常Q波。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡2～6周歲；無先天性心臟病或心臟畸形。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重器官功能障礙者；合并免疫系統(tǒng)疾病、代謝系統(tǒng)疾病者；其他類型心肌炎者。本研究獲得我院倫理委員會(huì)審批通過(審批號(hào)：20171215076)。根據(jù)給藥情況，將患兒分為磷酸肌酸鈉組、果糖二磷酸鈉組和磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組，每組40例。磷酸肌酸鈉組患兒平均年齡(11.23±2.73)歲；男性22例，女性18例。果糖二磷酸鈉組患兒平均年齡(11.43±3.32)歲；男性27例，女性13例。磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組患兒平均年齡(10.82±4.23)歲；男性16例，女性24例。三組患兒年齡、性別等資料相似，具備可比性。

1.2 治療方法

(1)磷酸肌酸鈉組患兒使用注射用磷酸肌酸鈉[規(guī)格：0.5 g(以C4H8N3O5PNa2計(jì))]，1日1 g，靜脈注射，分2次給藥。(2)果糖二磷酸鈉組患兒口服果糖二磷酸鈉片[規(guī)格：0.25 g(以C6H11Na3O12P2計(jì))]，1日200 mg/kg，分2次給藥。(3)磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組患兒使用注射用磷酸肌酸鈉靜脈注射，并口服果糖二磷酸鈉片，用法與用量同磷酸肌酸鈉組、果糖二磷酸鈉組。三組患兒均連續(xù)治療3周。

1.3 觀察指標(biāo)

分別取治療前后患兒清晨空腹?fàn)顟B(tài)靜脈血，已酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書為指導(dǎo)處理患者血液樣本，檢測cTnT、CK-MB、TNF-α和IL-6水平，以及miRNA表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 材料：(1)細(xì)胞。人心肌細(xì)胞(HCM，上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號(hào)為6200，品牌為Sciencell)；CVB3病毒由中國醫(yī)科院生物技術(shù)研究所提供。(2)儀器。ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(北京安麥格貿(mào)易有限公司)；GIS-500型凝膠成像分析儀(杭州谷峰科學(xué)儀器有限公司)；HBS-1096A型酶標(biāo)分析儀(上海研卉生物科技有限公司)。(3)藥品與試劑。注射用磷酸肌酸鈉(北京朋來制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國藥準(zhǔn)字H20068079)；果糖二磷酸鈉片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國藥準(zhǔn)字H19991128)。miR-133b inhibitor、miR-133b mimics及pcDNA-ELAVL1由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。InvitrogenTMLipofectamineTM2000 Transfection Reagent(貨號(hào)：11668-019)購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司。TRIzol法總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：CD-13433-ML)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：CD-102539GM)，總蛋白提取試劑盒(貨號(hào)：CD-13559-ML)，BCA蛋白法含量測試盒(貨號(hào)：CDY-2798X-SJH)，人cTnT ELISA試劑盒(貨號(hào)：CD-101420-ELISA)，人CK-MB ELISA試劑盒(貨號(hào)：CD-101354-ELISA)，人TNF-α ELISA試劑盒(貨號(hào)：CD-102490-ELA)，人IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào)：CD-102483-ELA)，CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒(貨號(hào)：CDJ-1626C-SJH)，均購自武漢純度生物科技有限公司。anti-ELAVL1(貨號(hào)：XGK97147)，anti-GAPDH(貨號(hào)：XGK104170)，二抗(貨號(hào)：XG-X10933)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)：XG-X10548)，均購自上海西格生物科技有限公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒(貨號(hào)：C-8304)購自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HCM，即為HCM組。待HCM出現(xiàn)搏動(dòng)后以100 Tcid50作為實(shí)驗(yàn)接種濃度將CVB3作用于HCM，構(gòu)建病毒性心肌炎模型細(xì)胞(CVB3-HCM)，為CVB3組。待模型構(gòu)建成功后，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-133b inhibitor、miR-133b mimics和pcDNA-ELAVL1按實(shí)驗(yàn)分組需求分別轉(zhuǎn)染至CVB3-HCM，即為miR-133b inhibitor組、miR-133b mimics組和OE-ELAVL1組，另設(shè)置陰性對(duì)照組(NC組)；48 h后驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外，采用磷酸肌酸鈉和果糖二磷酸鈉聯(lián)合處理上述各組細(xì)胞，根據(jù)各組轉(zhuǎn)染的載體不同，分為磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理無載體轉(zhuǎn)染CVB3-HCM細(xì)胞(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組)，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理OE-ELAVL1組(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組)、磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理miR-133b inhibitor組(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+miR-133b inhibitor組)，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-133b mimic和pcDNA-ELAVL1的CVB3-HCM細(xì)胞(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+miR-133b mimic+OE-ELAVL1組)。

1.4.3 CCK-8檢測細(xì)胞毒性：用不同濃度磷酸肌酸鈉或果糖二磷酸鈉處理CVB3-HCM，通過細(xì)胞存活率確定磷酸肌酸鈉和果糖二磷酸鈉的細(xì)胞毒性。采用CCK-8檢測細(xì)胞毒性，將濃度為5×103個(gè)/mL的CVB3-HCM接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2下穩(wěn)定24 h后，加入不同濃度磷酸肌酸鈉(1、5、10、20和30 mmol/L)或果糖二磷酸鈉(1、3、5、10和20 mg/mL)處理細(xì)胞24 h，再加入CCK-8孵育后于450 nm處測吸光度。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)檢測miR-133b水平：細(xì)胞中總RNA用Trizol法RNA提取試劑盒提取后，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，而后進(jìn)行擴(kuò)增，條件為95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，45個(gè)循環(huán)。引物序列如下，內(nèi)參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-133b上游引物為5′-AAGAAAGATGCCCCCTGCTC-3′，下游引物為5′-GTAGCT GGTTGAAGGGGACC-3′。采用2-ΔΔCt法以U6為內(nèi)參對(duì)miR-133b的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測ELAVL1的表達(dá)：細(xì)胞中的總蛋白用蛋白提取試劑盒提取后經(jīng)BCA蛋白法含量測試盒檢測濃度，然后將等量提取出的蛋白上樣后用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后加入1∶1 000一抗anti-ELAVL1后在4 ℃下孵育過夜。次日，去除一抗，加入1∶1 000二抗孵育1 h。孵育結(jié)束后，洗膜，加ECL發(fā)光試劑顯影。

1.4.6 ELISA檢測心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子水平：根據(jù)ELISA，處理人CVB3-HCM細(xì)胞，檢測細(xì)胞心肌損傷標(biāo)志物(cTnT和CK-MB)、炎癥因子(TNF-α和IL-6)水平。

1.4.7 免疫熒光檢測細(xì)胞焦亡：在室溫(25 ℃)下用4%多聚甲醛緩沖液處理各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞20 min后加入1%的BSA和0.1%的Triton-X反應(yīng)1 h，然后在4 ℃下用NLRP3及caspase-1抗體孵育過夜。次日洗脫一抗后加二抗處理1 h，并用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色結(jié)束后于熒光顯微鏡下拍照。

1.4.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-133b和ELAVL1的靶向關(guān)系：根據(jù)雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，將miR-133b和ELAVL1結(jié)合片段的序列擴(kuò)增后插入熒光素酶載體中構(gòu)建野生型ELAVL1載體(ELAVL1-WT)、結(jié)合位點(diǎn)序列突變后插入熒光素酶載體中構(gòu)建突變型ELAVL1載體(ELAVL1-MUT)，而后將ELAVL1-WT或ELAVL1-MUT與miR-133b mimics分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)48 h后檢測熒光素酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療小兒心肌炎的臨床研究

與治療前相比，治療后磷酸肌酸鈉組、果糖二磷酸鈉組和磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組患兒體內(nèi)心肌損傷標(biāo)志物(cTnT、CK-MB)和炎癥因子(TNF-α、IL-6)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。治療前后患兒靜脈血樣本中異常表達(dá)的miRNA見圖1，結(jié)果顯示，miR-133b表達(dá)水平在每組治療后均顯著上調(diào)。

圖1 病毒性心肌炎患兒經(jīng)磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療前后miRNA表達(dá)譜

表1 三組患兒治療前后心肌損傷標(biāo)志物變化比較

2.2 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b對(duì)CVB3-HCM的影響

采用RT-qPCR檢測心肌細(xì)胞中miR-133b水平發(fā)現(xiàn)，與HCM組miR-133b水平(1.00±0.07)相比，CVB3組miR-133b水平(0.50±0.09)顯著降低，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中miR-133b水平(0.94±0.05)顯著上調(diào)，三組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.66，P=0.000 3)。miR-133b inhibitor轉(zhuǎn)染至CVB3-HCM后的RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與NC組miR-133b水平(1.02±0.04)相比，miR-133b inhibitor組miR-133b水平(0.03±0.06)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.53，P=0.000 062)。檢測cTnT、CK-MB、TNF-α及IL-6水平發(fā)現(xiàn)，與CVB3組相比，心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子在磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中顯著降低，但磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+miR-133b inhibitor組CVB3-HCM中與CVB3組相近，見表2。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與CVB3組相比，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中NLRP3及caspase-1顯著被抑制，miR-133b inhibitor組的CVB3-HCM細(xì)胞焦亡標(biāo)志物水平無顯著變化，見圖2。

表2 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉處理對(duì)心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物及炎癥因子水平的影響

圖2 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b對(duì)CVB3-HCM焦亡的影響

2.3 miR-133b與ELAVL1的靶向關(guān)系

ELAVL1(ELAV-like protein 1)與miR-133b的靶向結(jié)合位點(diǎn)見圖3(A)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-133b mimics組ELAVL1野生型載體(ELAVL1-WT)的熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但兩組ELAVL1突變型載體(ELAVL1-MUT)的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。在CVB3-HCM中轉(zhuǎn)染miR-133b mimics后的RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與NC組miR-133b水平(1.01±0.04)相比，miR-133b mimics組CVB3-HCM中miR-133b水平(2.28±0.22)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.86，P=0.000 6)。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-133b mimics組ELAVL1蛋白水平顯著低于NC組，見圖3(B)。

A.miR-133b和ELAVL1的結(jié)合位點(diǎn)；B.miR-133b對(duì)ELAVL1蛋白表達(dá)水平的影響

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-133b與ELAVL1的靶向關(guān)系

2.4 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b/ELAVL1分子軸對(duì)CVB3-HCM細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測ELAVL1蛋白水平結(jié)果顯示，與CVB3組相比，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中ELAVL1蛋白水平顯著降低，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組中ELAVL1蛋白水平顯著高于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1+miR-133b mimics組ELAVL1蛋白水平顯著低于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4(A)。各組心肌損傷標(biāo)志物、炎癥因子及細(xì)胞焦亡結(jié)果顯示，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM心肌細(xì)胞中cTnT、CK-MB、TNF-α和IL-6水平，NLRP3、caspase-1表達(dá)水平顯著低于CVB3組；磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組cTnT、CK-MB、TNF-α和IL-6水平，NLRP3、caspase-1表達(dá)水平顯著高于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組；而磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1+miR-133b mimics組CVB3-HCM細(xì)胞損傷、炎癥因子及細(xì)胞焦亡標(biāo)志物水平均顯著低于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖4(B)。

表4 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b/ELAVL1分子軸對(duì)CVB3-HCM細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的影響

3 討論

病毒性心肌炎為兒科常見的后天性心臟疾病，具有擴(kuò)張型心肌病、預(yù)后差等多種不良影響[10]。在小兒病毒性心肌炎的治療中，磷酸肌酸鈉、果糖二磷酸鈉及兩者聯(lián)合應(yīng)用成為臨床上較為常見的有效治療方法[11-12]。尤其是磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉的療效得到了廣泛的認(rèn)可[13-14]。但對(duì)聯(lián)合用藥作用機(jī)制的研究缺失成為該治療方案進(jìn)一步推廣中亟待解決的問題。本研究通過臨床治療肯定了磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉的療效，篩選出有可能參與藥效發(fā)揮的miRNA，并在細(xì)胞水平對(duì)此機(jī)制加以驗(yàn)證。

本研究在臨床水平和細(xì)胞水平的結(jié)果均證實(shí)，miR-133b在病毒性心肌炎患兒血液樣本及CVB3感染的心肌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，而經(jīng)過磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療后miR-133b表達(dá)水平顯著上調(diào)；后續(xù)細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，敲降CVB3感染的心肌細(xì)胞中miR-133b后，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉可逆轉(zhuǎn)CVB3所致細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的抑制作用。該結(jié)果不僅提示異常低表達(dá)的miR-133b有成為小兒病毒性心肌炎標(biāo)志物的潛在可能性，也表明磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對(duì)小兒病毒性心肌炎的治療作用可能是通過上調(diào)miR-133b表達(dá)，進(jìn)而抑制病毒對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。有研究結(jié)果提出，過表達(dá)miR-133b可減弱病毒對(duì)心肌炎患兒心肌細(xì)胞的損傷[15]；過表達(dá)miR-133b能夠有效降低細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α水平，緩解炎癥反應(yīng)[16]；細(xì)胞焦亡關(guān)鍵基因NLRP3是miR-133b的潛在下游靶基因[17]。上述研究也從多個(gè)角度進(jìn)一步支撐了本研究結(jié)果。

miRNA通過調(diào)節(jié)下游靶基因參與細(xì)胞的生理過程已得到廣泛證實(shí)，通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)ELAVL1是miR-133b的靶基因之一，進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，miR-133b靶向負(fù)調(diào)控CVB3-HCM中ELAVL1蛋白。本研究中，miR-133b的靶基因ELAVL1被過表達(dá)后，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對(duì)CVB3感染心肌細(xì)胞的治療作用將被顯著削弱，可見，ELAVL1在磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療小兒病毒性心肌炎中意義重大。ELAVL1是一種廣泛表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，能夠作為RNA調(diào)節(jié)因子，通過多種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制介導(dǎo)多種蛋白的表達(dá)[18]。有研究結(jié)果表明，人肺上皮細(xì)胞中ELAVL1表達(dá)被抑制后，TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-18等多種炎癥因子的釋放也隨之減少；此外，與細(xì)胞焦亡相關(guān)的NLRP3、Gasdermin D及caspase-1蛋白水平也顯著降低[19]。針對(duì)人心室肌細(xì)胞的研究結(jié)果也表明，敲除ELAVL1基因可通過抑制NLRP3、caspase-1和IL-1β，緩解高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[20]。以上結(jié)果與本研究一致，即過表達(dá)ELAVL1能夠促進(jìn)CVB3-HCM細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過上調(diào)病毒性心肌炎心肌細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)，抑制ELAVL1蛋白，從而緩解CVB3對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡。本研究結(jié)果可為磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療小兒病毒性心肌炎提供分子機(jī)制方面的支持。