董熠輝，吳蘇喜,，李 彪，李普選

(1.長(zhǎng)沙理工大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410114; 2.鄭州遠(yuǎn)洋油脂工程技術(shù)有限公司，鄭州 450000)

目前，生產(chǎn)企業(yè)為預(yù)防油脂酸敗、延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，常在油脂產(chǎn)品中添加化學(xué)合成抗氧化劑，而化學(xué)合成抗氧化劑有一定的安全隱患[1-2]。從天然植物資源中尋求高效無(wú)害的天然抗氧化劑是近年來(lái)油脂科研人員所追求的研究方向之一。

油茶蒲(也叫油茶果殼)是油茶產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，占油茶果的2/3，年產(chǎn)量達(dá)200多萬(wàn)t[3]。油茶蒲含有多種天然的抗氧化活性成分，如黃酮[4]、多酚[5]、皂苷[6]等，近年來(lái)其已成為科研人員研究開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑的重要資源[7]。然而，目前人們只是研究了油茶蒲提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力、對(duì)Fe2+的螯合能力和總還原力等[8]，而在油脂工業(yè)生產(chǎn)和實(shí)際生活中并未得到合理利用。本試驗(yàn)在前期研究油茶蒲黃酮提取工藝及其抗氧化活性[9]的基礎(chǔ)上，研究油茶蒲醇提物對(duì)于常見(jiàn)的幾種不同類型食用油的抗氧化作用，以期對(duì)提高油茶副產(chǎn)物綜合利用率、開(kāi)發(fā)出油茶蒲基天然抗氧化劑提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油茶蒲，由湖南省康多利油脂有限公司提供的油茶鮮果經(jīng)陰干、裂果、烘干而得；菜籽油和核桃油，采用ZYJ-9018榨油機(jī)的清香模式壓榨制得，分別符合菜籽油和核桃油的國(guó)標(biāo)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；油茶籽油 (國(guó)標(biāo)一級(jí))，由湖南殷理基油脂有限公司提供。

S-8大孔樹(shù)脂，天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司；沒(méi)食子酸、蘆丁、槲皮素、兒茶素、表兒茶素5種標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；TBHQ(食品級(jí))，翁源廣業(yè)清怡食品科技有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純；無(wú)水乙醇、石油醚、三氯化鐵、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等，均為分析純。

島津LC-20AT高效液相色譜儀；ZYJ-9018榨油機(jī)，德國(guó)貝爾斯頓；TDL-36C離心機(jī)；ACO電磁式空氣泵；UV 5200 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶蒲醇提物的制備

稱取2 g左右過(guò)0.18 mm(80目)篩的油茶蒲粉末(W0)于錐形瓶，按照料液比1∶20加入60%乙醇溶液，在60℃下以240 W超聲功率輔助浸提40 min，趁熱抽濾，于50℃下旋蒸濃縮到適當(dāng)程度，將濃縮液冷凍干燥，得到油茶蒲醇提物，稱重(W1)，備存。

1.2.2 油茶蒲醇提物的純化

用S-8大孔樹(shù)脂，按照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行預(yù)處理和裝柱；將油茶蒲醇提物配制成4 mg/mL溶液，過(guò)柱[11]，然后用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋蒸濃縮，將濃縮液冷凍干燥，得到油茶蒲醇提純化物(簡(jiǎn)稱POSE)，稱重(W2)，備用。

1.2.3 樣品總黃酮含量的測(cè)定

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考吳蘇喜等[9]的方法，以乙醇為溶劑配制306 μg/mL蘆丁原液。分別準(zhǔn)確移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁原液于10 mL比色管中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，靜置6 min后，加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，靜置6 min，再加入4.0 mL 4% NaOH溶液，搖勻，用水定容至10 mL，靜置15 min；用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以蒸餾水為空白調(diào)零。以蘆丁質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=0.001 1X+0.003 4，R2=0.999 6。

1.2.3.2 樣品中總黃酮的提取

實(shí)驗(yàn)室前期研究[9]發(fā)現(xiàn)60%丙酮溶液對(duì)于油茶蒲黃酮的提取具有顯著優(yōu)勢(shì)，故用60%丙酮溶液為溶劑。取0.1 g左右待測(cè)樣(油茶蒲、其醇提物粗樣或醇提純化物，Mi)，在料液比1∶50 、溫度60℃、超聲功率240 W條件下輔助浸提40 min，趁熱抽濾、洗滌，匯集濾液和洗滌液，用60%丙酮定容至一定體積(Vi)，得到相應(yīng)樣品的黃酮測(cè)試液。

1.2.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

取1.0 mL黃酮測(cè)試液置于10 mL比色管內(nèi)，按1.2.3.1操作，測(cè)定吸光度(Ai)，根據(jù)回歸方程計(jì)算測(cè)試液中的總黃酮質(zhì)量濃度(Ci)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算測(cè)試固樣中總黃酮含量、質(zhì)量、回收率和得率。

(1)

Pi=Qi×Wi

(2)

(3)

(4)

式中：Qi為樣品的總黃酮含量；Ci為樣液中總黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；Vi為樣液總體積，mL；Mi為樣品質(zhì)量，g；Pi為樣品中的總黃酮質(zhì)量，g；Wi為樣品總質(zhì)量，g；Ni為制備過(guò)程中樣品的總黃酮回收率；Ri為制備過(guò)程中樣品的總黃酮得率(i可取0,1,2，i=0時(shí)為油茶蒲原料，i=1時(shí)為油茶蒲醇提物粗品，i=2時(shí)為POSE)。

1.2.4 HPLC法測(cè)定POSE中抗氧化成分含量

1.2.4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

分別稱取沒(méi)食子酸、槲皮素、兒茶素、表兒茶素和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；各取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，混合，用甲醇定容至10 mL，配制成100 μg/mL的混標(biāo)工作液；再稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、100 μg/mL 的混標(biāo)測(cè)試液，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.4.2 樣品測(cè)定

取POSE測(cè)試液，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算POSE中抗氧化成分含量。

1.2.4.3 HPLC分析條件

C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm)；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL； 流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相 A為乙腈，流動(dòng)相B為純水； 梯度洗脫程序?yàn)?～5 min 20% A，5～15 min 20%～85% A，15～19 min 85% A，19～19.01 min 85%～20% A，19.01～27 min 20% A。

1.2.5 POSE對(duì)食用油氧化穩(wěn)定性的影響

稱取6份100 g油樣，分別置于1～6號(hào)250 mL錐形瓶中。按照0.00%、0.01%、0.05%、0.10%、0.20%添加量向1～5號(hào)瓶中添加POSE，向6號(hào)瓶中添加0.01% TBHQ作為陽(yáng)性對(duì)照，超聲混合均勻。然后，將錐形瓶放入恒溫干燥箱中，通過(guò)干燥箱的排氣孔插入玻璃導(dǎo)氣管，該導(dǎo)氣管上端依次與氣體流量計(jì)和電磁式空氣泵相連，下端插入錐形瓶底部。將干燥箱溫度設(shè)定為97.8℃(參考AOM法)[12]，開(kāi)動(dòng)空氣泵，以3 mL/s流速向錐形瓶通入空氣。從第12 h開(kāi)始(核桃油從0 h開(kāi)始)，每隔3 h測(cè)定油脂的酸值(參照GB 5009.229—2016)，取3次測(cè)定的平均值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0和Origin 2018C系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶蒲原料的總黃酮含量與純化過(guò)程中的總黃酮回收率及得率

油茶蒲基各樣品的總黃酮含量與提取純化過(guò)程中總黃酮回收率及得率見(jiàn)表1。

表1 油茶蒲基樣品的總黃酮含量、回收率和得率

從表1可知：2 g原料油茶蒲以60%乙醇提取，可獲得0.46 g油茶蒲醇提物，該醇提物通過(guò)S-8大孔樹(shù)脂純化，可得0.14 g POSE；原料油茶蒲總黃酮含量為7.04%，其醇提物中總黃酮含量為22.41%，經(jīng)過(guò)純化后，總黃酮含量提高到66.86%；醇提可使總黃酮回收率達(dá)74.57%，純化可使總黃酮回收率達(dá)89.14%；相對(duì)油茶蒲原料而言，經(jīng)過(guò)醇提的總黃酮得率達(dá)5.25%，再經(jīng)過(guò)純化處理后總黃酮得率為4.68%。說(shuō)明醇提和純化處理可以有效地獲得油茶蒲原料中的黃酮。

2.2 POSE中功能活性成分的鑒定

選用植物皮殼中最常見(jiàn)的5種生物活性成分為標(biāo)樣，采用HPLC法對(duì)POSE中的功能活性成分進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 POSE的活性成分含量 mg/g

由表2可知，POSE中鑒定出沒(méi)食子酸 18.83 mg/g、兒茶素26.12 mg/g、表兒茶素 27.64 mg/g、蘆丁16.13 mg/g、槲皮素0.52 mg/g?？梢?jiàn)，POSE中富含表兒茶素、兒茶素、蘆丁等多種黃酮類物質(zhì)以及沒(méi)食子酸(其他成分可能為山奈苷[13]、鞣花酸[14]、花青素[15]等)。黃酮類化合物具有優(yōu)良的抗氧化活性及多種藥理和保健性能[16]，沒(méi)食子酸對(duì)于食用油的抗氧化具有增效作用[17]。因此，POSE具有作為天然植物抗氧化劑開(kāi)發(fā)使用的潛在價(jià)值。

2.3 POSE對(duì)不同類型油脂的抗氧化作用

2.3.1 不同劑量POSE對(duì)油茶籽油酸值的影響(見(jiàn)圖1)

從圖1可知，空白油茶籽油和添加0.01% POSE的油茶籽油酸值的突增臨界點(diǎn)為加熱18 h，添加0.05%、0.10%和0.20% POSE的油茶籽油酸值突增臨界點(diǎn)推遲到30 h，說(shuō)明POSE的添加對(duì)于油茶籽油酸值的增長(zhǎng)具有劑量正相關(guān)的抑制作用。加熱39 h內(nèi)0.20% POSE與0.01%TBHQ對(duì)油茶籽油酸值增長(zhǎng)的抑制作用相當(dāng)。

圖1 POSE對(duì)油茶籽油酸值的影響

2.3.2 不同劑量POSE對(duì)菜籽油酸值的影響(見(jiàn)圖2)

圖2 POSE對(duì)菜籽油酸值的影響

從圖2可知，POSE對(duì)菜籽油酸值的抑制能力具有一定的劑量依賴性?？瞻撞俗延秃吞砑?.01%、0.05%和0.10% POSE的菜籽油酸值突增臨界點(diǎn)為加熱15 h，添加0.20% POSE的菜籽油酸值突增臨界點(diǎn)推遲到24 h，而添加0.01% TBHQ的菜籽油酸值突增臨界點(diǎn)達(dá)到33 h。這說(shuō)明POSE對(duì)于菜籽油有一定的抗氧化效果，但與TBHQ存在一定差距。

2.3.3 不同劑量POSE對(duì)核桃油酸值的影響(見(jiàn)圖3)

圖3 POSE對(duì)核桃油酸值的影響

從圖3可知，POSE對(duì)核桃油酸值的增長(zhǎng)抑制作用很強(qiáng)，具有劑量正相關(guān)的抑制作用?？瞻缀颂矣偷乃嶂低辉雠R界點(diǎn)是加熱12 h，添加0.01%、0.05%、0.10%和0.20% POSE的核桃油酸值均緩慢平穩(wěn)增長(zhǎng)，直到加熱24 h后才出現(xiàn)突增跡象。在加熱24 h后，添加0.20% POSE的核桃油酸值明顯低于添加0.01% TBHQ的核桃油；加熱30 h后，添加0.10% POSE與添加0.01% TBHQ對(duì)核桃油酸值抑制能力相當(dāng)。

2.3.4 討論

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，要達(dá)到與添加0.01%TBHQ相當(dāng)?shù)目寡趸Ч筒枳延?、菜籽油和核桃油中分別需要添加0.20%、0.20%以上和0.10%～0.20%的POSE，說(shuō)明核桃油對(duì)POSE的敏感度最高。

POSE在油脂中主要起到兩方面的抗氧化作用：一是POSE中富含酚羥基的黃酮類物質(zhì)具有清除自由基的能力[18]，從而阻斷了油脂的自動(dòng)氧化進(jìn)程；二是POSE中的黃酮類、有機(jī)酸等活性成分易于螯合金屬離子[11,19-20]，生成金屬鹽，使油脂中的金屬離子鈍化，不能引發(fā)自由基鏈反應(yīng)。由此可見(jiàn)，相較于油茶籽油與菜籽油， POSE對(duì)核桃油表現(xiàn)出更加優(yōu)良抗氧化作用的原因可能是在油脂制備過(guò)程中，有部分金屬離子進(jìn)入油脂中，核桃油富含多不飽和脂肪酸(70%以上[21])，極易受金屬離子催化氧化，而POSE中的功能性活性成分對(duì)于金屬離子具有很強(qiáng)的螯合能力[11,20]，從而提高了核桃油的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)S-8大孔樹(shù)脂純化，POSE的總黃酮含量由純化前的22.41% 提高到66.86%；從POSE中初步鑒定出5種活性成分，分別為沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素，其他組分有待進(jìn)一步鑒定；POSE對(duì)多不飽和脂肪酸含量高的核桃油具有較好的抗氧化作用，且對(duì)于植物油的抗氧化作用與植物油中多不飽和脂肪酸含量存在一定正相關(guān)性，這對(duì)于高不飽和脂肪酸型油脂的天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。