曹文明， 薛 斌, 屠炳芳

(1.上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海食品快速檢測工程技術研究中心，上海 200093； 2.豐益(上海)生物技術研發(fā)中心有限公司，上海 200137； 3.月旭科技(上海)股份有限公司，上海 201613； 4.貝雷(上海)生物科技有限公司，上海 201203)

酸價(acid value，AV)反映油脂中游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)含量，是油脂最重要的質量等級指標之一，也是食用油脂和含油食品的安全指標。自1940年美國油脂化學家學會(American Oil Chemists Society, AOCS)頒布酸堿中和滴定法測定酸價以來，該酸價測定方法相繼被全球各標準化組織采用。由于酸堿中和滴定技術無法區(qū)分非FFA的有機酸和無機酸[1]，是FFA的非特異性檢測方法，當應用于含油食品等復雜基質的酸價測定時，酸價正偏差的檢測結果極大地困擾食品行業(yè)。對于特異性定量測定FFA的技術，較系統(tǒng)的研究報道僅限于金屬絡合法，其中最具代表性的是銅皂絡合比色法，其技術雛形始于20世紀50年代。近70年來，因對銅皂絡合理論的認識局限，以及高毒試劑、顯色穩(wěn)定性等技術瓶頸，銅皂絡合比色法在定量檢測油脂F(xiàn)FA、評價脂肪酶活性、脂質代謝等領域的應用受到限制。直到2020年，銅皂絡合顯色理論取得了新的進展，突破了長期存在的絡合顯色技術瓶頸，形成了具有高度特異性和穩(wěn)定性的新銅皂絡合比色法。本文旨在針對酸價測定的酸堿中和滴定技術的共性和非特異性的局限，闡述特異性測定FFA技術中最具代表性的銅皂絡合比色法的技術演變和創(chuàng)新發(fā)展歷程，展望新銅皂絡合比色法在突破若干技術瓶頸后的應用優(yōu)勢，為準確定量復雜基質中FFA或酸價測定提供一種理想的特異性方法。

1 現(xiàn)行油脂酸價檢測技術概況

1.1 酸價的本質內(nèi)涵

酸價，也稱酸值，是指中和1 g油脂中所有的FFA所需消耗的氫氧化鉀(KOH)的質量(毫克)[1]，可反映油脂受脂肪酶等催化發(fā)生氧化水解反應的程度。制油過程中，動植物油料的天然細胞結構被破壞，同時釋放出脂肪酶混合于油脂中，使油脂在加工和儲存過程中可能不斷地發(fā)生氧化水解反應產(chǎn)生FFA[2-4]。油脂中FFA總含量高，會造成油脂的煙點降低、氧化劣變加快、營養(yǎng)成分破壞、不良氣味等負面作用。FFA總含量是反映油脂氧化水解酸敗[5]最直接的標志，酸價既是食用動植物油脂及制品重要的安全指標[6-9]，也是食用植物油產(chǎn)品分級的主要質量指標之一。

酸價僅當表示油脂中FFA百分含量時與酸度同義，但單位不同。在我國國家標準中，其他酸度、脂肪酸值等概念都與酸價含義無關，如表1所示。

表1 國家標準中與酸價易混淆的概念

續(xù)表1

1.2 酸價測定的滴定技術共性與非特異性局限

目前國際上酸價或FFA總含量檢測的標準方法[1，10，15-18]，無一例外都采用了酸堿中和滴定技術，詳見表2。

表2 酸價和FFA總含量測定的標準方法

酸堿中和滴定檢測技術分為3種：冷溶劑指示劑滴定、熱乙醇指示劑滴定和冷溶劑自動電位滴定。AOCS Cd 3d-63、AOCS Ca 5a-40、AOAC 940.28和AOAC 969.17在其各自的應用范圍內(nèi)只規(guī)定了冷溶劑指示劑滴定檢測技術；而ISO 660：2020卻同時采用了這3種滴定技術，并規(guī)定了冷溶劑指示劑滴定檢測技術和冷溶劑自動電位滴定技術均為參考方法。我國現(xiàn)行的酸價檢測食品安全國家標準(GB 5009.229—2016)與ISO 660:2020的技術同步而應用范圍各異[10]。

酸堿中和滴定不是FFA的特異性檢測技術，根據(jù)酸堿中和滴定技術的基本原理[19]，油脂中所有的酸性強度大于或接近于FFA酸性強度的有機酸類物質和無機酸類物質，都會在滴定時與標準滴定溶液中的KOH或NaOH發(fā)生酸堿中和反應，導致酸價檢測結果偏高。

酸堿滴定技術的非特異性弊端，對于食用動植物油脂的酸價測定影響并不大，因為一般情況下，各類食用油脂中主要的天然酸性物質就是FFA。但是，對于基質復雜的含油食品，其中的非FFA類酸性天然產(chǎn)物、酸性食品添加劑和酸性美拉德反應產(chǎn)物等(見表3)，都可能溶解于提取的油脂樣品中，導致酸價檢測結果偏高。薛斌等[33]研究指出，未添加食用香精香料的調(diào)味醬，其自動電位滴定法的酸價測定值與銅皂絡合比色法的測定值相差無幾，但添加食用香精香料的調(diào)味醬，其自動電位滴定法的酸價測定值就顯著偏高。因此，銅皂絡合比色法在酸價測定時可以免受酸性食用香精香料的干擾。

表3 可能存在食品中的酸性物質

2 特異性定量FFA的經(jīng)典銅皂絡合比色法

2.1 銅皂絡合比色法的兩相絡合技術及其適用范圍

銅皂絡合比色法是一種用于測定油脂中FFA總含量的技術[34-36]，該技術是將油脂試樣溶于烴類溶劑作為有機相，用吡啶-銅離子的絡合離子染色液作為水相，進行液-液雙相反應，反應過程中水相中的絡合離子會與有機相中的各種FFA發(fā)生反應，形成三位一體的(吡啶-銅離子-脂肪酸根離子)銅皂絡合物，易溶于有機相的銅皂絡合物顯現(xiàn)特殊的靛藍色，在700 nm波長附近有特征吸收峰，且符合朗伯-比爾定律，從而可以準確定量。銅皂絡合物結構以及銅皂絡合反應示意圖如圖1和圖2所示。

注：R1～R4分別為不同脂肪酸碳鏈。

有研究指出，銅皂絡合比色法僅對C8及其以上的中長碳鏈FFA有顯色反應，而對C8以下的短碳鏈脂肪酸無顯色反應[33，36](FFA的碳數(shù)與FFA銅皂絡合反應后吸光度的相對強度關系如圖3所示)。

圖3 不同碳鏈長度FFA銅皂絡合反應后吸光度的相對強度[36]

相比于酸堿中和滴定技術，銅皂絡合比色法可避免溶解在油脂中的山梨酸和苯甲酸等對酸價檢測的干擾[33]。銅皂絡合比色法是食用油脂中各種天然FFA的特異性檢測技術。

2.2 經(jīng)典銅皂絡合比色法的技術演變與發(fā)展瓶頸

銅皂絡合比色法研究始于20世紀50年代。 日本Iwayama[37]研究發(fā)現(xiàn)，在三乙醇胺存在的條件下，脂肪酸的硝酸銅溶液能夠溶于氯仿，使C10～C22 的FFA所形成的銅鹽轉移入有機相并顯現(xiàn)藍色，在691 nm波長處測定吸光度，所測得的吸光度與FFA含量在7.5～150 mg/L FFA質量濃度范圍內(nèi)呈線性關系。這就是銅皂絡合比色技術的雛形。

1964年，美國Baker[34]使用乙酸銅水溶液為水相染色液，苯作為有機相，率先應用于檢測植物油脂中FFA總含量。

1976年，美國Lowry等[35]首次初步闡明了銅皂絡合物的結構，建立了苯為有機相、乙酸銅水溶液(吡啶調(diào)節(jié)pH至6.0～6.2)為水相染色液的技術框架，至此經(jīng)典的銅皂絡合比色法基本定型并沿用至今。但是由于對銅皂絡合顯色理論認識的局限，過窄的pH范圍(pH 6.0～6.2)使實驗操作難度較大，劇毒試劑苯與替代有機相顯色強度的矛盾，以及顯色穩(wěn)定性等因素限制了該方法的廣泛應用。

1986年，韓國Kwon等[36]首次建立以異辛烷替代苯為有機相、乙酸銅-吡啶為水相的改良銅皂絡合比色法，并用于測定FFA，將其應用于脂肪酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，銅皂絡合比色法僅適用C8以上FFA的檢測，F(xiàn)FA碳鏈長度對顯色強度無顯著影響。但是，異辛烷替代苯為有機相，銅皂絡合物顯色強度銳減了2/3，靈敏度大幅下降，對固態(tài)油脂溶解穩(wěn)定性差等弊端凸顯。

從1976至今，經(jīng)典的銅皂絡合比色法測定FFA在脂肪酶活性評價、脂質組學的研究報道未曾間斷，其中包括銅皂絡合比色法用于谷物脂肪酸值的測定(2012年)[38]，采用銅皂絡合比色法監(jiān)測水產(chǎn)及其制品在長期儲存過程中所含油脂成分中FFA總含量的變化情況以評價水產(chǎn)及其制品在儲存過程中品質變化規(guī)律(2014—2017年)[39-41]。在酶學研究中，一直以來都采用銅皂絡合比色法測定脂肪酶水解產(chǎn)物中FFA總含量(2011—2016年)[42-44]來評價脂肪酶的活性。2017年 Chen等[45]在運用脂質組學方法研究牡蠣在儲存過程中磷脂類物質的代謝機理時發(fā)現(xiàn)，牡蠣的代謝產(chǎn)物會引起pH的變化，干擾了酸堿滴定法測定FFA的結果，而改用銅皂絡合比色法測定FFA則可以避免此缺陷。

2021年報道了以低毒溶劑環(huán)己烷替代高毒的苯作為有機相，解決了用銅皂絡合比色法檢測固態(tài)油脂酸價的問題，并驗證了酸性添加劑和食用香精對傳統(tǒng)酸堿滴定法檢測酸價的干擾。銅皂絡合比色法可特異性定量復雜基質樣品中油脂F(xiàn)FA總含量，免受非FFA的有機酸和無機酸的干擾[33]。

3 銅皂絡合比色法的技術進展

3.1 銅皂絡合顯色理論創(chuàng)新

3.1.1 銅皂絡合反應原理新發(fā)現(xiàn)

經(jīng)典的銅皂絡合比色法，要求銅皂染色液pH嚴格維持在6.0～6.2，偏離該狹窄pH區(qū)間則會導致銅皂絡合顯色強度大幅降低[35-36]。進一步研究發(fā)現(xiàn)：銅皂染色液中吡啶分子與銅離子的物質的量比(以下簡稱摩爾比,MR)才是決定銅皂絡合顯色反應的關鍵[46]。MR大于等于3時，無論銅皂染色液的pH如何變化，都失去了對FFA進行銅皂絡合顯色反應的能力。根據(jù)金屬離子絡合原理推導的絡合機制，在水溶液中銅離子與吡啶分子形成銅-吡啶絡合物離子([Cu(C5H5N)n]2+，n=1～4)，銅離子作為中心離子，可以與配位體吡啶分子絡合形成1～4個不同配位數(shù)[47]的絡合物。絡合的吡啶分子數(shù)目越多，形成的絡合物也越穩(wěn)定，如表4所示。

表4 不同數(shù)目配位體的銅-吡啶絡合物離子的穩(wěn)定系數(shù)[47]

3.1.2 銅皂絡合反應的抑制

根據(jù)表4的數(shù)據(jù)推測，銅離子、吡啶分子和FFA形成的銅皂絡合物的穩(wěn)定系數(shù)(lgβn)應當在(4.33, 5.93)范圍內(nèi)。所以，當MR在[1，3)范圍時，銅皂染色液中總會存在一定量的[Cu(C5H5N)2]2+或[Cu(C5H5N)]2+絡合離子，正是這些含有1個或2個吡啶配位體數(shù)的銅-吡啶絡合物離子直接與FFA進行了銅皂絡合反應，形成了銅皂絡合物。但當MR大于等于3時，銅皂染色液中所有的銅離子與吡啶分子形成[Cu(C5H5N)3]2+或[Cu(C5H5N)4]2+，這些含有3個或4個吡啶配位體數(shù)的銅-吡啶絡合物離子的絡合穩(wěn)定系數(shù)大于與FFA形成的銅皂絡合物，從而完全抑制了銅皂絡合反應。

3.1.3 銅皂絡合顯色理論突破

新銅皂絡合比色法不必嚴控銅皂染色液的pH在6.0～6.2范圍內(nèi)的要求，論證了MR在[1，3)條件下(MR在2左右最優(yōu)),銅皂染色液的pH達到6.8后(pH 6.8～7.5)顯色強度最佳[46]。對新銅皂絡合比色法研究證明，MR在[1，3)條件下，銅皂染色液中主體絡合物離子[Cu(C5H5N)2]2+，在pH 5～7 的水溶液中不僅可有效抑制銅離子形成氫氧化銅沉淀(當pH>5時)[46]，而且不影響脂肪酸銅皂絡合物的形成，而一旦MR達到3時，形成的[Cu(C5H5N)3]2+會抑制銅皂絡合物的形成。

經(jīng)典銅皂絡合比色法用吡啶將染色液pH調(diào)節(jié)到6.0～6.2之間時，MR恰好接近2，所以本質上已將染色液MR調(diào)節(jié)到最佳。

研究表明，MR在2左右時用10%氫氧化鈉水溶液不斷調(diào)節(jié)升高銅皂染色液的pH，銅皂絡合反應的顯色強度也會隨之不斷地增強。一旦染色液的pH大于6.8，顯色強度不再隨pH的上升而明顯增強[46]。其原因是各種中長碳鏈FFA的pH都在4.8左右[48]，屬于弱酸。因此，隨著銅皂染色液pH的升高，有機相中FFA的電離度不斷加大，釋放出FFA酸根離子的量也不斷增加，導致更多的FFA酸根離子從有機相轉移入水相，形成更多的銅皂絡合物，銅皂絡合顯色強度因此不斷增強，直到銅皂染色液的pH達到6.8，此時有機相中的FFA已經(jīng)99%解離為FFA酸根離子。

3.2 緩沖鹽染色液的增強顯色與抑制乳化作用

3.2.1 促進銅皂絡合物向有機相遷移而增強顯色強度與穩(wěn)定性

新銅皂絡合比色法采用0.05～2.0 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液配制的銅皂染色液，降低了銅皂染色液的水活性，銅皂絡合物在染色液(水相)的溶解度也相應降低，促進了絡合反應后更多的銅皂絡合物遷移進入有機相，從而增強了銅皂絡合顯色強度[46]。同時，由于緩沖液極化了銅皂絡合物在水相和有機相之間的分配系數(shù)，最大程度降低了銅皂絡合物在水相中的溶解度，從而縮小了銅皂絡合物在水相中溶解度隨溫度變化的幅度，即進一步降低了溫度對顯色穩(wěn)定性的影響。過高濃度的緩沖液(>2.0 mol/L)，不利有機相中形成的FFA酸根離子在銅皂染色液中的溶解，使其難以完全與銅皂染色液中的銅離子和吡啶接觸形成銅皂絡合物，反而導致銅皂絡合顯色強度降低[46]。

3.2.2 抑制銅皂絡合反應時的乳化作用和水溶性酸性物質的干擾

從復雜基質的加工食品中提取的油脂會含有微量水溶性的酸性物質，如乙酸。對于缺乏緩沖鹽的經(jīng)典銅皂染色液，即使油脂樣品中有極微量的乙酸，也會破壞極窄范圍的pH限制，使銅皂絡合顯色強度出現(xiàn)明顯的降低，一旦pH低于6.0，則顯色強度劇烈下降[35-36]。新銅皂絡合比色法染色液中的乙酸鈉-乙酸緩沖液可高效維持穩(wěn)定的pH環(huán)境,即使較高濃度的外來乙酸等酸性物也難以明顯影響顯色強度[46]。

相比于傳統(tǒng)的純水配制的銅皂染色液，用緩沖液配制的銅皂染色液，增強了銅皂染色液的離子強度，增大了水相和有機相的極性差異，因而降低了兩相之間發(fā)生乳化作用的可能性。

3.3 破解非苯有機溶劑絡合顯色弱的難點

經(jīng)典銅皂絡合比色法中溶劑苯[34-35]是銅皂絡合顯色反應最佳的有機相溶劑，具有最強的顯色強度。其他常見有機溶劑銅皂絡合反應顯色強度強弱順序為苯>甲苯>鄰二甲苯>間二甲苯≈對二甲苯>環(huán)己烷>C8～C16的直鏈烷烴≈異辛烷[46]。苯是高毒溶劑。在銅皂絡合比色技術發(fā)展中，有嘗試用低毒溶劑異辛烷[36]作為有機相，但其顯色強度和固脂溶解穩(wěn)定性較差[33，46]。研究顯示，以乙酸鈉-乙酸緩沖液配制的銅皂染色液為水相，用環(huán)己烷替代苯為有機相的銅皂絡合比色法，其顯色強度達到經(jīng)典銅皂絡合比色法的60%以上，完全滿足定量比色的靈敏度和穩(wěn)定性要求[33]。同樣條件下，若用低毒的甲苯或二甲苯(略有異味)替代高毒的苯為有機相，顯色強度與經(jīng)典銅皂絡合比色法基本相當[46]。

3.4 新銅皂比色法與傳統(tǒng)銅皂比色法的比較

傳統(tǒng)銅皂比色法與新銅皂比色法技術上的主要差異對比見表5。

表5 傳統(tǒng)銅皂比色法與新銅皂比色法技術上的主要差異對比

4 結 語

在經(jīng)典銅皂絡合比色技術的基礎上，經(jīng)系統(tǒng)研究形成的新銅皂絡合比色法，發(fā)展了吡啶-銅離子摩爾比為核心的新銅皂絡合顯色理論，解決了經(jīng)典銅皂絡合比色法顯色強度易受pH變化影響、有機相只能用高毒溶劑苯才能達到高顯色強度等問題，使銅皂絡合比色技術的操作便捷性、穩(wěn)定性、特異性顯著提升。作為一種FFA的特異性檢測技術，彌補了傳統(tǒng)的酸堿中和滴定法無法區(qū)分FFA和其他油溶性酸性物質、油脂樣品消耗量大等不足，更適合于復雜基質的加工食品的酸價檢測，成為特異性定量FFA和AV的理想方法。