李 津 宋 強(qiáng)△ 高鐵祥

葛根芩連湯治療糖尿病的作用已被中醫(yī)藥界所認(rèn)同，該應(yīng)用可謂古方新用、異病同治。從中醫(yī)理論來(lái)講，糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，多由長(zhǎng)期嗜食肥甘厚味，辛辣香燥，使脾胃運(yùn)化失職，致積熱內(nèi)蘊(yùn)，化燥傷津，消谷耗液，而發(fā)為消渴。葛根芩連湯具有升陽(yáng)運(yùn)脾、清熱燥濕、潤(rùn)燥生津的功效，符合消渴病脾失健運(yùn)、胃腸濕熱、燥熱傷津的病機(jī)。現(xiàn)代藥理研究也證實(shí)了葛根芩連湯治療糖尿病的有效性。

中藥發(fā)酵技術(shù)可謂現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥研究的交叉結(jié)合，它利用微生物強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力來(lái)生產(chǎn)新型中藥，在中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)和中藥材資源的保護(hù)與利用等方面給我們提供了新的思路。課題組前期采用中藥發(fā)酵技術(shù)對(duì)葛根芩連湯進(jìn)行發(fā)酵處理，確定了最佳優(yōu)化的發(fā)酵條件。

氧化應(yīng)激可引起胰島素分泌不足及胰島素抵抗，反之胰島素分泌不足及胰島素抵抗也可影響氧化應(yīng)激，說(shuō)明2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)可能通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)其發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)T2DM大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，旨在闡明葛根芩連湯發(fā)酵液防治T2DM的增效作用及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物葛根芩連湯水煎液、葛根芩連湯煮散劑、葛根芩連湯發(fā)酵液均由山西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心制備。以上制劑的藥物組成及用藥比例均為葛根∶黃芩∶黃連∶甘草=8∶3∶3∶2。具體制備方法如下：葛根芩連湯水煎液的制備：將飲片加5倍藥物重量的水浸泡30 min后，煎煮30 min，紗布粗濾取藥液；藥渣加4倍藥物重量的水，煎煮30 min，紗布粗濾去渣，混合兩次藥液，水浴50 ℃，濃縮至全方生藥量為2 g/ml。葛根芩連湯煮散劑的制備：葛根、黃芩、黃連、甘草分別粉碎為60目的粉末，按照上述用量比例混合均勻，將藥物粉末加5倍藥物重量的水浸泡30 min后，煎煮30 min，持續(xù)攪拌，500 rpm/min，紗布粗濾取藥液；藥渣加4倍藥物重量的水，煎煮30 min，持續(xù)攪拌，500 rpm/min，紗布粗濾去渣，混合兩次藥液，水浴50 ℃，濃縮至全方生藥量為2 g/ml。葛根芩連湯發(fā)酵液的制備：將葛根芩連湯發(fā)酵液離心，取上清液，置于超凈工作臺(tái)，水浴50 ℃，濃縮至1/10時(shí)，發(fā)酵基質(zhì)(即藥渣)按照上述煮散劑的制備方法，濃縮后與發(fā)酵濃縮液合并至全方生藥量為2 g/ml。格列美脲片：由上海天賜福生物工程有限公司生產(chǎn)，規(guī)格2 mg×30片，批號(hào)：20141202。

1.2 試劑鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，批號(hào)：1126C0314)來(lái)自Sigma S0130，Solarbio 分裝；檸檬酸鈉(批號(hào)：20150116)、檸檬酸(批號(hào)：20141108)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水(0.9%NaCl，批號(hào)：15032411)購(gòu)自山東華魯制藥有限公司；水合氯醛(批號(hào)：20150306)購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；大鼠胰島素定量elisa試劑盒(批號(hào)：20150730)購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20150728)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20150415)、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20150608)、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶(GSH-px)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20150512)、考馬斯亮藍(lán)法蛋白檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20150608)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物Sprague Dawley(SD)大鼠，85只，SPF級(jí)，雄性，180～220 g/只，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0013。

1.4 飼料高糖高脂飼料(配方：豬油10%，蔗糖5%，蛋黃粉5%，膽固醇1%，膽鹽0.1%，基礎(chǔ)飼料78.9%，批號(hào)：20150328)，購(gòu)自北京諾康源有限公司)；常規(guī)飼料(大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，批號(hào)：15033151)，購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

2 方法

2.1 造模方法動(dòng)物購(gòu)置后適應(yīng)性喂飼1周，除隨機(jī)選取10只喂飼常規(guī)飼料外，其余75只喂飼高糖高脂飼料4周，在第5周的第1天早晨，空腹腹腔注射STZ溶液35 mg/kg/次，喂飼常規(guī)飼料的大鼠注射檸檬酸緩沖液。7 d后大鼠尾尖取血采用血糖儀檢測(cè)空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L者視為造模成功。

2.2 分組及處理喂飼常規(guī)飼料的10只大鼠繼續(xù)喂飼常規(guī)飼料，作為正常對(duì)照組，灌胃給予生理鹽水。將造模成功的T2DM大鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組、葛根芩連湯水煎液組(以下簡(jiǎn)稱GGQLT水煎液組)、葛根芩連湯煮散劑組(以下簡(jiǎn)稱GGQLT煮散劑組)、葛根芩連湯發(fā)酵液組(以下簡(jiǎn)稱GGQLT發(fā)酵液組)，仍喂飼高糖高脂飼料，分別灌胃給予生理鹽水、格列美脲(0.67 mg/kg)、葛根芩連湯水煎液(生藥量為20 g/kg)、葛根芩連湯煮散劑(生藥量為20 g/kg)、葛根芩連湯發(fā)酵液(生藥量為20 g/kg)，持續(xù)8周。末次給藥后，各組動(dòng)物禁食12 h，腹腔注射5%水合氯醛，麻醉后腹主動(dòng)脈采血，靜置30 min，2500 rpm/min離心10 min，分離血清并分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取血后，剪取右大腿股四頭肌放凍存管中，迅速置于液氮中，待檢。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 空腹血糖(FBG)分別于造模(注射STZ)前1天，及造模成功后當(dāng)天(第0周)與第2、4、6、8周的第7天早晨(禁食12 h后)尾尖取血采用血糖儀測(cè)定FBG。

2.3.2 空腹胰島素(FINS)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)FINS采用雙抗體夾心ELISA法，計(jì)算ISI= Ln[1/(FBG×FINS)]，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

2.3.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)血清超氧化物歧化酶(SOD)采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)；血清丙二醛(MDA)含量采用TBA法；血清過(guò)氧化氫酶(CAT)采用可見(jiàn)光法；血清谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶(GSH-px)采用比色法。

3 結(jié)果

3.1 葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)T2DM大鼠FBG的影響造模前，各組FBG均在5.0～6.5 mmol/L，且各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后的各組FBG與正常對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.01)，且各組FBG均值>11.1 mmol/L，符合T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明該模型大鼠造模成功。隨著給藥時(shí)間推移，給藥組FBG均有降低趨勢(shì)，至第4周，陽(yáng)性藥對(duì)照組、GGQLT水煎液組及GGQLT發(fā)酵液組大鼠FBG顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)；第6周，各給藥組FBG均顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)；第8周，各給藥組FBG均顯著低于模型對(duì)照組(P<0.01)，其中GGQLT發(fā)酵液組FBG均值低于其余給藥組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。葛根芩連湯不同劑型降糖作用存在一定的時(shí)-效關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠FBG比較 (只，

3.2 葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)T2DM大鼠FINS、ISI、HOMA-IR的影響模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，F(xiàn)INS水平顯著升高(P<0.01)，ISI顯著降低(P<0.01)，HOMA-IR顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明模型對(duì)照組出現(xiàn)了高胰島素血癥及胰島素抵抗。各給藥組與模型對(duì)照組相比，F(xiàn)INS顯著降低(P<0.01)，ISI顯著升高(P<0.01)，HOMA-IR顯著降低(P<0.01)。GGQLT發(fā)酵液組FINS水平顯著低于其余給藥組(P<0.01)；GGQLT發(fā)酵液組ISI均值高于其余給藥組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GGQLT發(fā)酵液組HOMA-IR顯著低于GGQLT水煎液組(P<0.05)，GGQLT發(fā)酵液組HOMA-IR均值低于陽(yáng)性對(duì)照藥組、GGQLT煮散劑組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠FINS、ISI、HOMA-IR比較 (只，

3.3 葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)T2DM大鼠氧化應(yīng)激的影響模型對(duì)照組血清MDA含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，SOD及CAT活性顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，GSH-px低于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性藥對(duì)照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組SOD活性顯著高于模型對(duì)照組(P<0.01)。GGQLT發(fā)酵液組SOD活性顯著高于陽(yáng)性藥對(duì)照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組(P<0.05，P<0.01)。陽(yáng)性藥對(duì)照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組MDA含量顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組MDA含量低于陽(yáng)性藥對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GGQLT煮散劑組CAT活性顯著高于模型對(duì)照組(P<0.05)，陽(yáng)性藥對(duì)照組、GGQLT水煎液組及GGQLT發(fā)酵液組CAT活性均有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性藥對(duì)照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組GSH-px活性較模型對(duì)照組有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 (只，

4 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到各種有害刺激后，體內(nèi)高活性分子如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)產(chǎn)生過(guò)多，打破了機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化動(dòng)態(tài)平衡，抗氧化能力下降，造成機(jī)體組織細(xì)胞及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子氧化損傷的一種嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[1]。

氧化應(yīng)激標(biāo)志物是一系列能反映機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的生物化學(xué)物質(zhì)。脂質(zhì)過(guò)氧化水平常被作為反映氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)之一，能反映機(jī)體受氧化應(yīng)激損傷的程度。脂質(zhì)過(guò)氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類分解產(chǎn)物，而且通過(guò)鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用，使之攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用，同時(shí)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，造成細(xì)胞損傷[2]。目前用于檢測(cè)的主要產(chǎn)物為丙二醛(malondialdehyde，MDA)。MDA 含量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。

機(jī)體內(nèi)存在著兩類抗氧化系統(tǒng)，一類是酶抗氧化系統(tǒng)，現(xiàn)在廣泛研究的抗氧化酶類包括：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)等，可以阻止新的自由基生成，或者清除已經(jīng)生成但尚未發(fā)生反應(yīng)的自由基；另一類是非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素C、維生素E等[3]。

研究表明，氧化應(yīng)激與T2DM密切相關(guān)，是引起T2DM發(fā)生發(fā)展的重要因素[4]。高血糖是產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要因素，可增加機(jī)體內(nèi)的 ROS 與RNS 含量，主要是通過(guò)葡萄糖自氧化、線粒體電子傳遞鏈和多元醇通路等途徑產(chǎn)生，當(dāng)超氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生速率超過(guò)其移除速率時(shí)即會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[5，6]。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能損傷及外周胰島素抵抗，誘發(fā)糖尿病的形成，嚴(yán)重者更會(huì)導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病、糖尿病視網(wǎng)膜病和糖尿病心血管病等多種并發(fā)癥的形成[7-9]。

氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰退的主要原因之一，其機(jī)制可能為：①ROS 可直接損傷β細(xì)胞，主要是以破壞細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)為特點(diǎn)，進(jìn)一步促進(jìn)β細(xì)胞凋亡[10]；②抑制胰十二指腸同源盒因子1(PDX-1)的活性，如C-Jun氨基末端激酶(C-jun N-terminal kinase，JNK)的過(guò)度激活可降低PDX-1的活性，改變其磷酸化狀態(tài)，引起PDX-1與DNA的結(jié)合力下降，造成胰島素基因轉(zhuǎn)錄障礙和β細(xì)胞功能減退，導(dǎo)致胰島素合成和分泌減少等[11，12]；③ ROS可激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)等胰島素信號(hào)通路，間接損傷β細(xì)胞功能，如引起β細(xì)胞炎癥反應(yīng)[13]；④影響細(xì)胞能量代謝：如降低3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的活性，抑制了糖酵解過(guò)程和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)穿梭系統(tǒng)，致使ATP合成不足，使葡萄糖刺激的胰島素第一時(shí)相分泌減少[14]。

大量基礎(chǔ)研究已經(jīng)表明氧化應(yīng)激是糖尿病發(fā)病中的關(guān)鍵因素之一，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)為防治糖尿病及其慢性并發(fā)癥提供了新的視角?！翱寡趸笔乾F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的概念，因此在開(kāi)展中藥復(fù)方抗氧化活性基礎(chǔ)研究及臨床研究時(shí)無(wú)法借鑒古人的經(jīng)驗(yàn)，且復(fù)方研究又受到如炮制、提取、溶劑、貯存等諸多因素的影響，若僅僅根據(jù)中藥藥理研究的結(jié)果選擇藥物，又不符合中醫(yī)辨證論治的思想。因此盡量選擇藥味精煉的中藥復(fù)方，通過(guò)基礎(chǔ)及臨床研究，觀察中藥復(fù)方抗氧化活性，將有益于改善氧化應(yīng)激，從而更好地防治糖尿病及其慢性并發(fā)癥。

方藥防治糖尿病在過(guò)去幾十年的藥理研究中，總是局限于觀察降糖療效為主，隨著氧化應(yīng)激與糖尿病相關(guān)性的研究進(jìn)展，本研究著重于觀察葛根芩連湯對(duì)于2型糖尿病大鼠的抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組與正常對(duì)照組比較，SOD、GSH-px、CAT活性均升高，MDA含量降低，說(shuō)明T2DM與氧化應(yīng)激之間存在直接或間接關(guān)系。T2DM發(fā)病后，持續(xù)的高血糖可進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激，而氧自由基的大量堆積，又反過(guò)來(lái)加重T2DM的病情，相互影響。糖尿病產(chǎn)生過(guò)多的自由基，消耗了內(nèi)源性SOD、GSH-px、CAT，SOD、GSH-px、CAT發(fā)生糖基化后活性下降，抗氧化能力降低，氧自由基通過(guò)與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)形成MDA。

給予模型大鼠葛根芩連湯發(fā)酵液8周后，可以顯著升高T2DM大鼠血清SOD 活性，降低 MDA 含量，對(duì)CAT及GSH-px活性有升高趨勢(shì)。GGQLT發(fā)酵液組SOD活性顯著高于陽(yáng)性藥對(duì)照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組，GGQLT發(fā)酵液組MDA含量均值低于陽(yáng)性藥對(duì)照組。研究結(jié)果證實(shí)，葛根芩連湯發(fā)酵液可通過(guò)提高模型大鼠抗氧化物酶的活性和降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量，從而增強(qiáng)自由基清除能力和降低ROS的產(chǎn)生，起到抗氧化應(yīng)激、防止氧化損傷的效果，最終達(dá)到抗糖尿病、保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，改善胰島素抵抗的作用。分析其原因，可能是由于葛根芩連湯方中四味藥均有抗氧化作用，經(jīng)過(guò)復(fù)方配伍后發(fā)生協(xié)同作用而產(chǎn)生。發(fā)酵也是其增效的重要因素，通過(guò)發(fā)酵，復(fù)方中的大分子物質(zhì)可以轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，更有利于機(jī)體的吸收。