王珺，喬亞玲，劉亞蓉（青海省藥品檢驗檢測院 國家藥品監(jiān)督管理局中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點(diǎn)實驗室 青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實驗室，西寧 810000）

愈傷靈膠囊為活血化瘀、消腫止痛的中成藥，由土鱉蟲、紅花、自然銅（煅），冰片、黃瓜子（炒）、續(xù)斷、三七、當(dāng)歸、落新婦提取物組成，用于跌打損傷，筋骨瘀血腫痛，亦可用于骨折的輔助治療。全國共有17 家生產(chǎn)企業(yè)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第八冊》WS-B-1662-93，以及修訂標(biāo)準(zhǔn)WS-B-1662-93-1、WS-B-1 6 6 2-9 3-2、WS-B-1662-93-3、WS-B-1662-93-4、WS-B-1662-93-5、WS-B-1662-93-6、WS-B-1662-93-7、WS-B-1662-93-8、WS-B-1662-93-9。由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品質(zhì)量參差不齊。據(jù)相關(guān)資料所知，紅花黃色素和羥基紅花黃色素A為紅花的主要成分；巖白菜素和11-

O

-沒食子酰巖白菜素為落新婦的主要成分；阿魏酸和藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸的主要成分；馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷、續(xù)斷苷B 為續(xù)斷的成分。故本文選擇這10 種成分，建立雙波長高效液相色譜測定方法，為愈傷靈膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260 高效液相色譜儀（安捷倫），XS105DU 電子天平（上海梅特勒），BSA224S-CW電子天平（賽多利斯），Milli-Q-Advantage A10 超純水儀（默克密理博）。

阿魏酸（批號：110773-201012，純度：99.6%）、當(dāng)藥苷（批號：111742-200501，純度：100%）、馬錢苷（批號：111640-201808，純度：99.0%）、馬錢苷酸（批號：111865-210403，純度：94.7%）、巖白菜素（批號：111532-200202，純度：100%）、羥基紅花黃色素A（批號：111637-201106，純度：92.5%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；11-

O

-沒食子酰巖白菜素（批號：B30511，純度：98%）和續(xù)斷苷B（批號：B50175，純度：90%）（對照品，上海源葉生物科技有限公司）；藁本內(nèi)酯對照品（批號：160816，純度：98%，北京世紀(jì)奧科有限公司）；紅花黃色素對照品（批號：AF2040951，純度：95%，成都埃法生物科技有限公司）。9 個生產(chǎn)企業(yè)的愈傷靈膠囊樣品信息見表2。水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ACE Excel C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A 為甲醇，B 為0.1%磷酸，梯度洗脫（0 ～10 min，2%～20%A；10 ～27 min，20% ～25%A；27 ～61 min，25% ～70%A；61 ～70 min，70%～2%A；70 ～73 min，2%A）；流速1.0 mL·min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長244 nm（羥基紅花黃色素A、當(dāng)藥苷、馬錢苷、11-

O

-沒食子酰巖白菜素、續(xù)斷苷B）及325 nm（巖白菜素、馬錢苷酸、阿魏酸、紅花黃色素、藁本內(nèi)酯）。色譜圖見圖1。

圖1 愈傷靈膠囊HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Yushangling capsule

2.2 對照品溶液的制備

取對照品各適量，加甲醇制成含阿魏酸0.3061 mg·mL、當(dāng)藥苷0.2170 mg·mL、馬錢苷0.1631 mg·mL、馬錢苷酸0.2551 mg·mL、11-

O

-沒食子酰巖白菜素0.2111 mg·mL、續(xù)斷苷B 0.1319 mg·mL、 藁本內(nèi)酯0.2221 mg·mL、紅花黃色素0.2742 mg·mL、巖白菜素0.1822 mg·mL、羥基紅花黃色素A 0.0931 mg·mL的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物粉末3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%乙醇50 mL，稱定重量，靜置2 h，再超聲1 h，冷卻后，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品儲備液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 置于同一10 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密吸取系列混合對照品溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（

X

，μg·mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（

Y

）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果10 種成分在各自線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（見表1）。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果
Tab 1 Linear relationship

化合物回歸方程r線性范圍/（μg·mL－1）巖白菜素Y ＝30.03X－33.610.9996 1.82 ～91.00阿魏酸Y ＝13.66X ＋6.9540.9994 3.06 ～153.05藁本內(nèi)酯Y ＝9.533X ＋6.7470.9991 2.22 ～111.05馬錢苷酸Y ＝35.32X－35.250.9990 2.55 ～127.55當(dāng)藥苷Y ＝25.40X ＋23.950.9990 2.17 ～108.50馬錢苷Y ＝7.416X－2.4320.9995 1.63 ～81.55 11-O-沒食子酰巖白菜素Y ＝7.918X ＋1.4680.9994 2.11 ～105.55紅花黃色素Y ＝4.436X ＋6.2090.9996 2.74 ～137.10續(xù)斷苷BY ＝33.63X ＋40.200.9992 1.32 ～65.95羥基紅花黃色素A Y ＝11.51X ＋0.3527 0.9990 0.93 ～46.55

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品儲備液，稀釋10 倍后連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果巖白菜素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷、11-

O

-沒食子酰巖白菜素、紅花黃色素、續(xù)斷苷B、羥基紅花黃色素A 峰面積的

RSD

在0.22%～2.4%。2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：20191001），分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果巖白菜素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷、11-

O

-沒食子酰巖白菜素、紅花黃色素、續(xù)斷苷B、羥基紅花黃色素A 峰面積的

RSD

在0.13%～1.5%。2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一供試品粉末6 份（批號：20191001），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果巖白菜素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷、11-

O

-沒食子酰巖白菜素、紅花黃色素、續(xù)斷苷B、羥基紅花黃色素A 含量的平均值分別為13.4843、0.0773、0.3683、4.7476、2.6203、0.7226、0.8903、7.5646、1.4583、0.7706 mg·g，

RSD

在0.60%～2.2%。2.4.5 加樣回收試驗 取已知含量的供試品粉末6 份（批號：20191001），每份約1.5 g，精密稱定，分別置于錐形瓶中，再分別精密加入混合對照品溶液10 mL（巖白菜素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷、11-

O

-沒食子酰巖白菜素、紅花黃色素、續(xù)斷苷B、羥基紅花黃色素A質(zhì)量濃度分別為1.0012、0.0112、0.0514、0.6381、0.5124、0.1548、0.1215、0.8487、0.2251、0.1254 mg·mL），按“2.2”項下方法制備，再進(jìn)樣測定，計算得巖白菜素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷、11-

O

-沒食子酰巖白菜素、紅花黃色素、續(xù)斷苷B、羥基紅花黃色素A 的平均回收率為98.87%、93.34%、93.95%、94.54%、97.98%、94.62%、96.78%、96.01%、97.00%、94.88%，

RSD

分別為0.35%、0.87%、0.95%、0.65%、0.81%、1.1%、0.94%、0.35%、0.56%、1.2%。

2.5 檢測限測定

確立3 倍基線噪音為檢測限，10 倍基線噪音為定量限，巖白菜素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷、11-

O

-沒食子酰巖白菜素、紅花黃色素、續(xù)斷苷B、羥基紅花黃色素A的檢測限分別為0.123、0.411、0.017、0.301、0.044、0.038、0.079、0.017、0.053、0.049 μg·mL，定量限分別為0.410、1.370、0.057、1.003、0.147、0.127、0.263、0.057、0.177、0.163 μg·mL。

2.6 樣品測定

將9 批樣品和混合對照品采用“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定各成分含量，結(jié)果見表2。

表2 愈傷靈膠囊各成分含量結(jié)果(mg·g)
Tab 2 Content of each ingredient in Yushangling capsules (mg·g)

注（Note）：/.未檢出或低于檢測限（“/”mean not detected or lower than LOD）。

批號生產(chǎn)企業(yè)巖白菜素 馬錢苷酸 阿魏酸紅花黃色素藁本內(nèi)酯羥基紅花黃色素A當(dāng)藥苷馬錢苷11-O-沒食子酰巖白菜素續(xù)斷苷B 20191001BSD13.4843 4.7476 0.0773 7.5646 0.3683 0.7706 2.6203 0.7226 0.8903 1.4583 1911211GLDD10.7536 1.8026 0.1020 10.5353 0.3563 1.9290 0.2600 0.1833 0.7136 0.3236 20190801HB22.1020 0.6806 0.0850 8.7530 0.5663 2.1516 0.4616 0.1340 0.5606 0.5160 2001202HS15.9120 1.2166 0.0153 /0.4830 / 0.5670 0.3283 0.5333 0.3653 190602SQ29.8333 0.3813 / 3.9210 0.1856 / 0.4106 0.2920 1.1600 0.2216 20190202WSL25.2213 4.0370 ///1.3950 0.6883 0.4363 0.5690 0.5313 190502YF23.0366 1.2243 0.1250 13.1890 1.0403 2.1240 0.4600 0.1743 0.7556 0.4706 20191203YL 5.3280 0.5210 0.0500 7.0893 0.1930 1.3466 0.1323 /0.6356 0.1696 190709ZBYD10.6686 0.2990 / 1.5840 0.0886 / 0.5183 0.1303 0.2976 0.1553平均值17.3710 1.6566 0.0757 7.5194 0.4101 1.6194 0.6798 0.3001 0.6795 0.4679

HS 生產(chǎn)的樣品中未檢出紅花黃色素和羥基紅花黃色素A，紅花投料未達(dá)標(biāo)；WSL 生產(chǎn)的樣品中未檢出阿魏酸、藁本內(nèi)酯和紅花黃色素，當(dāng)歸投料未達(dá)標(biāo)及紅花投料質(zhì)量較次；SQ 和ZBYD生產(chǎn)的樣品中未檢出阿魏酸和羥基紅花黃色素A，可能存在當(dāng)歸和紅花質(zhì)量較次的情況；YL 生產(chǎn)的樣品中未檢出馬錢苷，可能存在續(xù)斷質(zhì)量較次的情況。不同生產(chǎn)企業(yè)樣品中各成分指標(biāo)的值不盡相同，各生產(chǎn)企業(yè)之間愈傷靈膠囊質(zhì)量差異較大。

3 小結(jié)

本研究建立的雙波長高效液相色譜法簡便、精密度好，可用于愈傷靈膠囊中10 種成分的含量測定及質(zhì)量控制。