張慧，白桂昌，羅軼，羅永強(qiáng)，張贊（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

啟脾丸處方由六神曲（炒）、蓮子（炒）、麩炒白術(shù)、茯苓、人參、山藥、炒山楂、陳皮、炒麥芽、甘草、澤瀉等中藥組成，臨床用于健脾和胃。中藥材從采集到成藥環(huán)節(jié)繁雜，由于藥材含糖、蛋白質(zhì)、油脂等成分較高，在栽培生產(chǎn)、加工炮制、儲(chǔ)藏運(yùn)輸?shù)冗^程容易霉變污染，而霉變產(chǎn)生的代謝物中毒性最強(qiáng)的為黃曲霉毒素（aflatoxin，AF），黃曲霉毒素在中藥材中主要含有黃曲霉毒素B、B、G、G，其中黃曲霉毒素 B毒性最大。在啟脾丸的11 味藥材中，蓮子、陳皮、炒麥芽、六神曲、甘草等易受黃曲霉毒素污染，進(jìn)而引入啟脾丸中?！吨袊?guó)藥典》一部中部分藥材品種制定了黃曲霉毒素的檢測(cè)項(xiàng)目，但對(duì)中成藥并未規(guī)定，為保證用藥安全，有必要考察啟脾丸中黃曲霉毒素的殘留情況。本文將樣品提取后，經(jīng)免疫親和柱處理，利用高效液相色譜（HPLC）-柱后衍生-熒光檢測(cè)器（FLD），建立了啟脾丸中黃曲霉毒素B、B、G、G的含量測(cè)定方法，并對(duì)全國(guó)10 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的64 批啟脾丸樣品進(jìn)行了測(cè)定和安全性評(píng)價(jià)，為其質(zhì)量安全控制提供依據(jù)。

1 材料

HPLC 2695 和FLD 2475（Waters 公司），UVE光化學(xué)衍生器（254 nm）（LCTech 公司），AB204-S電子天平（Mettler Toledo 公司），渦旋混合器（TALBOYS 公司），固相萃取儀（Dikma 公司）。黃曲霉毒素混合對(duì)照品（批號(hào)：610001-201602，黃曲霉毒素B、B、G、G標(biāo)示質(zhì)量濃度分別為1.02、0.43、1.06、0.38 μg·mL，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；黃曲霉毒素總量（B、B、G、G）免疫親和柱（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）；64 批啟脾丸樣品來自全國(guó)10 個(gè)生產(chǎn)廠家，廠家（樣品編號(hào)）分別為A（1 ～4）、B（5 ～11）、C（12）、D（13 ～20）、E（21 ～23）、F（24 ～25）、G（26 ～35）、H（36 ～37）、I（38 ～43）、J（44 ～64）；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK CMGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（30∶13∶57）；流速：1.1 mL·min；進(jìn)樣量：25 μL；柱后UVE 光化學(xué)衍生；檢測(cè)器：FLD，激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：450 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液和隨行加樣對(duì)照品溶液 精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品0.5 mL，置10 mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1 mL，置25 mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得黃曲霉毒素B、B、G、G質(zhì)量濃度為2.04、0.86、2.12、0.76 ng·mL的對(duì)照品溶液。精密量取儲(chǔ)備液0.65 mL，置50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為隨行加樣對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品剪碎，精密稱取3 g，置50 mL 離心管中，加入氯化鈉3 g，水5 mL，渦旋搖散，再精密加入甲醇20 mL，2500 r·min渦旋5 min，9000 r·min離心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL 量瓶中，用磷酸緩沖液（pH 6.5）稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，經(jīng)免疫親和柱處理，流速3 mL·min，用水20 mL 洗脫，洗脫液棄去，用空氣將水排出，再用甲醇1.5 mL 自然洗脫，將洗脫液置2 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照品溶液、陰性樣品（均未檢出黃曲霉毒素B、B、G、G的樣品）、供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，黃曲霉毒素各成分分離完全，分離度大于（

R

）1.5，見圖1。

圖1 黃曲霉毒素HPLC 圖Fig 1 HPLC of aflatoxin

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液配制成系列對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（

X

，pg）為橫坐標(biāo)，峰面積（

Y

）為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程和線性范圍
Tab 1 Regression equation and linear range

黃曲霉毒素線性方程r線性范圍/pg B1Y ＝3.842×104X ＋17.261.0000 9.3 ～55.8 B2Y ＝7.268×103X－16.621.0000 3.0 ～18.0 G1Y ＝2.167×104X－70.431.00009.3 ～55.8 G2Y ＝5.662×104X－51.020.9999 3.5 ～21.0

2.5 加樣回收試驗(yàn)

取未檢出樣品6 份，約3 g，精密稱定，置離心管（50 mL）中，精密加入隨行加樣對(duì)照品溶液20 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃曲霉毒素B、B、G、G平均加樣回收率分別為84.09%、84.38%、83.11%、86.33%，

RSD

分別為2.5%、2.0%、2.8%、1.9%，符合分析要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃曲霉毒素B、B、G、G的

RSD

分別為2.0%、1.5%、2.1%、1.6%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取同一份“2.5”項(xiàng)下的加樣回收供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6 次，結(jié)果黃曲霉毒素B、B、G、G的

RSD

分別為0.64%、0.48%、1.0%、0.57%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份“2.5”項(xiàng)下的加樣回收供試品溶液，分別于0、2、5、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃曲霉毒素B、B、G、G的

RSD

分別為1.3%、1.0%、1.0%、0.99%，表明12 h 內(nèi)各組分均穩(wěn)定。

2.9 檢測(cè)限

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各黃曲霉組分峰的信噪比均大于10，折算各成分檢測(cè)限，結(jié)果黃曲霉毒素B、B、G、G檢測(cè)限分別為0.2、0.1、0.2、0.1 μg·kg。

2.10 樣品測(cè)定

取64 批啟脾丸樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果52 批啟脾丸檢出黃曲霉毒素，檢出率達(dá)81.2%，黃曲霉毒素B的含量為0.0 ～21.8 μg·kg，黃曲霉毒素B的含量為0.0 ～2.5 μg·kg，黃曲霉毒素G和黃曲霉毒素G均未檢出，黃曲霉毒素B、B、G、G總量為0.0 ～24.3 μg·kg，見表2。參考《中國(guó)藥典》2020年版一部的限度（每1 kg 含黃曲霉毒素B不得過5 μg，含黃曲霉毒素B、B、G、G總量不得過10 μg）對(duì)樣品進(jìn)行判斷，結(jié)果6 批樣品超過限度，不合格率為9.4%。表明黃曲霉毒素所造成的安全隱患不容忽視。

表2 啟脾丸樣品中黃曲霉毒素B、B、G、G 測(cè)定結(jié)果(μg·kg)
Tab 2 Determination of aflatoxin B，B，G and G in Qipi pill (μg·kg)

注（Note）：ND 表示未檢出（ND means no detection）。

樣品黃曲霉毒素樣品黃曲霉毒素B1B2G1G2總量B1B2G1G2總量1 12.2 2 9.4 3 21.81.8 NDND14.0 33 1.2 0.1 NDND1.3 1.4 NDND10.8 34 1.3 0.2 NDND1.5 2.5 NDND24.3 35 1.5 0.1 NDND1.6 4 8.9 1.8 NDND10.7 36 2.0 0.3 NDND2.3 5 2.0 0.5 NDND2.5 37 2.2 0.4 NDND2.6 6 1.7 0.3 NDND2.0 38 0.6 0.3 NDND0.9 7 1.9 0.4 NDND2.3 39 NDNDNDNDND 8 2.2 0.4 NDND2.6 40 1.7 0.3 NDND2.0 9 4.5 0.9 NDND5.4 41 1.6 0.4 NDND2.0 10 2.4 0.6 NDND3.0 42 2.4 0.4 NDND2.8 11 7.6 1.1 NDND8.7 43 3.3 0.5 NDND3.8 12 5.6 1.1 NDND6.7 44 1.2 0.2 NDND1.4 13 1.3 0.6 NDND1.9 45 1.3 0.2 NDND1.5 14 1.1 0.5 NDND1.6 46 1.3 0.4 NDND1.7 15 1.4 0.4 NDND1.8 47 1.4 0.2 NDND1.6 16 NDNDNDNDND 48 1.3 0.2 NDND1.5 17 NDNDNDNDND 49 1.0 0.2 NDND1.2 18 NDNDNDNDND 50 1.0 0.3 NDND1.3 19 NDNDNDNDND 51 1.1 0.1 NDND1.2 20 NDNDNDNDND 52 0.6 0.1 NDND0.7 21 2.2 0.5 NDND2.7 53 0.7 0.1 NDND0.8 22 2.5 0.5 NDND3.0 54 0.8 0.1 NDND0.9 23 2.1 0.4 NDND2.5 55 1.7 0.2 NDND1.9 24 NDNDNDNDND 56 NDNDNDNDND 25 NDNDNDNDND 57 NDNDNDNDND 26 1.3 0.2 NDND1.5 58 NDNDNDNDND 27 1.2 0.3 NDND1.5 59 2.1 0.6 NDND2.7 28 2.2 0.3 NDND2.5 60 1.8 0.5 NDND2.3 29 2.6 0.2 NDND2.8 61 2.0 0.5 NDND2.5 30 0.9 0.1 NDND1.0 62 2.5 0.4 NDND2.9 31 0.9 0.1 NDND1.0 63 NDNDNDNDND 32 1.1 0.1 NDND1.2 64 1.9 0.5 NDND2.4

3 討論

啟脾丸由11 味藥組成，制法為全部藥味粉碎后于煉蜜混合直接入藥。黃曲霉毒素的毒性被列為極毒，目前國(guó)際上不建議設(shè)定黃曲霉毒素的安全耐受量和無毒作用劑量，國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中黃曲霉毒素限量的規(guī)定不同，國(guó)際食品法典委員會(huì)、美國(guó)未單獨(dú)對(duì)堅(jiān)果中黃曲霉毒素B做限定，僅規(guī)定黃曲霉毒素總量最高限量為10 ～20 μg·kg；歐盟對(duì)水果及堅(jiān)果類制品規(guī)定最高限量黃曲霉毒素B為2 ～12 μg·kg、黃曲霉毒素總量為4 ～15 μg·kg；中國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB2761-2017）中僅限定了黃曲霉毒素B含量，其中谷物及制品5.0 ～20 μg·kg、豆類及制品5.0 μg·kg、堅(jiān)果及籽類5.0 ～20 μg·kg、油脂及其制品10 ～20 μg·kg、 調(diào)味品5.0 μg·kg、 特殊膳食用食品0.5 μg·kg。除食品之外，德國(guó)、韓國(guó)對(duì)中藥材中黃曲霉毒素B限度為2、10 μg·kg；中國(guó)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中黃曲霉毒素B限度為5 μg·kg，《中國(guó)藥典》對(duì)中藥材中黃曲霉毒素B和黃曲霉毒素總量限量為5 μg·kg和10 μg·kg。但目前均沒有標(biāo)準(zhǔn)單獨(dú)對(duì)黃曲霉毒素B、G、G的限量進(jìn)行規(guī)定，大多通過黃曲霉毒素總量控制其安全性。

在檢出黃曲霉毒素的啟脾丸樣品中，全部為B 族黃曲霉毒素，主要為黃曲霉毒素B。按照《中國(guó)藥典》的限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，有3 家生產(chǎn)企業(yè)6 批樣品超過限度，表明部分企業(yè)對(duì)易感染黃曲霉毒素的投料飲片質(zhì)量控制意識(shí)較差，缺乏有效監(jiān)督。

由于黃曲霉毒素極易污染，在中藥材和中成藥的全過程生產(chǎn)鏈中制訂有效的防控措施十分重要。從源頭來講，先進(jìn)的栽培技術(shù)、合理的采集時(shí)間、嚴(yán)格的儲(chǔ)藏加工運(yùn)輸條件均能有效降低黃曲霉毒素的污染。在黃曲霉毒素產(chǎn)生后，也可通過物理方法（高溫、輻照、精油熏蒸、吸附）、化學(xué)方法（氨處理、臭氧處理）、生物方法（細(xì)菌、真菌、海洋微生物）對(duì)其進(jìn)行降解并減少毒性。同時(shí)應(yīng)根據(jù)中藥的不同特性，在不影響質(zhì)量的前提下選擇合適的防控措施，形成長(zhǎng)效的保障機(jī)制。

黃曲霉毒素易溶于甲醇、三氯甲烷、丙酮、油等有機(jī)溶劑，難溶于水，試驗(yàn)中采用70%甲醇對(duì)啟脾丸樣品進(jìn)行提取后，提取液呈弱酸性，為使免疫親和柱保持良好的吸附性能，比較了水和4 種磷酸緩沖液（pH 6.0、6.5、7.0、7.5）作為提取液的稀釋溶液，結(jié)果選用pH 6.5 的磷酸緩沖液稀釋提取液后再經(jīng)免疫親和柱凈化回收率最好。方法學(xué)研究表明此方法具有回收率好、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，可作為啟脾丸黃曲霉毒素的定量分析方法。