田思宇，韓新宇，任金妹，叢卉婧，崔欣冉，唐景玲*（.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 50086；.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院，上海 0700）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是迄今為止臨床抗腫瘤最有效的藥物之一，其抗腫瘤活性強(qiáng)，作用范圍廣。但紫杉醇的溶解性差，且存在耐藥性，紫杉醇口服給藥后會(huì)被腫瘤部位的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）外排，導(dǎo)致其口服給藥的生物利用度低。使用P-gp 抑制劑可以提高紫杉醇的口服生物利用度進(jìn)而提高治療作用。胡椒堿（piperine，Pip）是胡椒的主要成分，是P-gp 的逆轉(zhuǎn)劑，但難溶于水，有研究表明胡椒堿和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用后紫杉醇的生物利用度增加。傳統(tǒng)的紫杉醇劑型穩(wěn)定性低、粒徑大、多分散指數(shù)高、制備工藝?yán)щy。固體脂質(zhì)納米粒（SLN）是近年來(lái)被廣泛研究的給藥系統(tǒng)，SLN 以脂質(zhì)作為載體材料將藥物包裹在其中，避免了藥物與外界環(huán)境接觸，增加了藥物的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了藥物的半衰期，同時(shí)也可將水溶性差的藥物包裹在脂質(zhì)中。本文采用單硬脂酸甘油酯包載紫杉醇與胡椒堿制備成固體脂質(zhì)納米粒（PP-SLN），以提高紫杉醇和胡椒堿的溶解度，進(jìn)而提高其生物利用度并對(duì)該制劑進(jìn)行體外釋放的評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 Infinity 液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；SZCL-4 數(shù)顯智能恒溫磁力攪拌器（上海卓康生物科技有限公司）；KQ5200E 醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA124SCW 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；PHS-3C 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)（上海霄盛儀器制造有限公司）；HZQ-C 空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；Nano 微射流均質(zhì)機(jī)（上海諾澤流體科技有限公司）。

1.2 試藥

PTX、Pip（美倫生物技術(shù)有限公司）；大豆磷脂（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯（嘉法獅上海貿(mào)易有限公司）；吐溫80（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司）；無(wú)水乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 PP-SLN 的制備

稱取一定量的PTX、Pip 和單硬脂酸甘油酯于西林瓶中，加入適量無(wú)水乙醇后于75 ℃水浴鍋中加熱使藥物和脂質(zhì)溶解作為油相。稱取一定量Tween-80 和大豆磷脂于100 mL 燒杯中，加入25 mL 水于75℃的水浴鍋中加熱攪拌使助乳化劑溶解作為水相。當(dāng)油相和水相全部溶解后，將油相緩慢滴加到水相中，保持溫度為75℃，繼續(xù)攪拌至無(wú)水乙醇揮干，使用高壓均質(zhì)機(jī)使其分散均勻后于4℃條件下固化得到PP-SLN。制備的PPSLN 外觀澄清透明并伴有淡藍(lán)色乳光，并且在4℃放置24 h 后無(wú)明顯改變。

2.2 PP-SLN 的外觀形態(tài)

將一滴新鮮制備的PP-SLN 溶液滴到覆有支撐膜的銅網(wǎng)上，自然干燥，置于透射電子顯微鏡下觀察。PP-SLN 透射電鏡圖見圖1，PP-SLN 外觀為光滑的類球狀顆粒，無(wú)聚集與粘連，粒徑較小且分散良好。

圖1 PP-SLN 的透射電鏡圖Fig 1 Transmission electron microscopy of PP-SLN

2.3 PP-SLN 粒徑和Zeta 電位的測(cè)定

取新鮮制備的PP-SLN 10 μL 用去離子水稀釋至1 mL，輕輕混勻后使用NanoZS90 馬爾文激光粒徑分析儀對(duì)其粒徑及粒度分布進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2A 所示，PP-SLN 的粒徑為（53.72±1.43）nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.208。取適量新鮮制備的PP-SLN，使用NanoZS90 馬爾文激光粒徑分析儀對(duì)其Zeta 電位進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2B 所示，PP-SLN 的Zeta 電位為（－19.4±3.31）mV。

圖2 PP-SLN 的粒徑（A）和Zeta 電位（B）結(jié)果Fig 2 Particle size（A）and Zeta potential（B）of PP-SLN

2.4 PP-SLN 的體外釋放研究

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（75∶25）；流速為1.0 mL·min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.4.2 溶液的配制

① 空白溶液（釋放介質(zhì)）：配制含20%無(wú)水乙醇的PBS（pH 6.8）為空白溶液。

② 對(duì)照品溶液：精密稱定1 mg PTX 對(duì)照品，用釋放介質(zhì)定容于10 mL 量瓶中，即得100 μg·mL的PTX 對(duì)照品母液。

③ 樣品溶液：取100 μL PP-SLN 溶液置10 mL 量瓶，使用含20%無(wú)水乙醇的PBS（pH 6.8）定容后，即得樣品溶液。

2.4.3 專屬性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下3 種溶液，進(jìn)樣，考察方法專屬性。色譜圖如圖3 所示，藥物峰形尖銳且為單峰，釋放介質(zhì)及微量雜質(zhì)不干擾PTX 的含量測(cè)定，表明此方法專屬性良好。

圖3 紫杉醇色譜圖Fig 3 Chromatogram of paclitaxel

2.4.4 線性關(guān)系考察 根據(jù)信噪比大于20 來(lái)確定藥物的定量下限為1.0 μg·mL，根據(jù)信噪比等于3 確定檢測(cè)限為0.1 μg·mL。取“2.4.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，用釋放介質(zhì)稀釋成1.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 和18.0 μg·mL系列溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，依序進(jìn)樣并記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果回歸方程為：

A

＝38.36

C

＋6.5917，

r

＝0.9999，表明PTX 在1.0 ～18.0 μg·mL時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好。2.4.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，用釋放介質(zhì)稀釋成低（3.0 μg·mL）、中（9.0 μg·mL）和高（15.0 μg·mL）3 種質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)樣分析。連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d 進(jìn)樣，測(cè)定日間精密度。結(jié)果表明日內(nèi)、日間的

RSD

均小于2%，該方法的精密性符合要求。

2.4.6 回收試驗(yàn) 吸取適量的釋放介質(zhì)溶液，加入適量的PTX 對(duì)照品，制備低（3 μg·mL）、中（4.8 μg·mL）和高（6.0 μg·mL）3 種質(zhì)量濃度的藥物溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算3 種濃度的回收率。結(jié)果表明3 種濃度的回收率均在98%～102%，表明此方法的回收率滿足分析方法的要求，該方法準(zhǔn)確性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試樣品在0、2、4、6、8、10、24 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積，考察其放置穩(wěn)定性。結(jié)果24 h 內(nèi)PTX 含量的

RSD

小于2%，表明供試品溶液放置24 h 內(nèi)其含量幾乎無(wú)變化，穩(wěn)定性符合要求。2.4.8 PP-SLN 中PTX 的體外釋放研究方法 采用正向動(dòng)態(tài)膜透析法，選擇含20%無(wú)水乙醇的PBS（pH 6.8）作為釋放介質(zhì)，滿足漏槽條件。分別移取l mL 新制的PTX 混懸液和PP-SLN 至預(yù)先處理好的透析袋（截留分子量：8000 ～14 000）中，夾緊透析袋后放于盛有100 mL 釋放介質(zhì)的燒杯中，將燒杯擺放在恒溫振蕩器內(nèi)，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速100 r·min，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、24、36 和48 h 用移液槍取1 mL 釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充1 mL 新鮮備用介質(zhì)。平行取樣3 組，進(jìn)樣測(cè)定，記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的峰面積，計(jì)算累積釋放量。累積釋放量（

Q

）及累積釋放百分?jǐn)?shù)（

Q

，%）由以下公式計(jì)算求得：

其中：

C

為在

t

時(shí)刻PTX 的測(cè)定濃度，

C

為

t

時(shí)刻之前測(cè)定的PTX 濃度，

V

為接受池中加入的溶液體積，

V

為每次取樣體積，

Q

為起始時(shí)給藥池中PTX 總量。PTX 混懸液和PP-SLN 在48 h 內(nèi)的釋放結(jié)果如圖4 所示，PTX 混懸液中PTX 48 h 的累積釋放量約為30%，PP-SLN 中PTX 48 h 的累積釋放量約為76%。PP-SLN 與PTX 混懸液相比明顯增加了PTX 的體外釋放量。

圖4 PTX 在PP-SLN（A）及PTX 混懸液（B）中的累積釋放曲線（x± s，n ＝6）Fig 4 In vitro release curve of PTX from PP-SLN and PTX suspension（±s，n ＝6）

3 討論

本試驗(yàn)采用溶劑揮發(fā)-高壓均質(zhì)法制備的PP-SLN，外觀呈類球形，均勻分布，其粒徑為（53.72±1.43）nm，PDI 為0.208，該制劑提高了PTX 及Pip 的溶解度，減小了粒徑和多分散系數(shù)；PP-SLN 帶有一定的負(fù)電荷，在放置過(guò)程中不易發(fā)生凝聚、沉淀，有利于PP-SLN 的儲(chǔ)存。試驗(yàn)另外測(cè)定PP-SLN 中PTX 的包封率高達(dá)98.4%，載藥量為6.02%（待另文發(fā)表）。體外釋放試驗(yàn)以pH 6.8 的PBS 作為釋放介質(zhì)是為了模擬腸液的環(huán)境，結(jié)果表明PP-SLN 與PTX 混懸液相比明顯增加了PTX 的體外釋放量。PTX 混懸液中的紫杉醇于24 h 達(dá)到最大釋放后，其累積釋放量不再增加，而PP-SLN 中的紫杉醇持續(xù)緩慢釋放，達(dá)到緩釋目的。本試驗(yàn)制備的PP-SLN 達(dá)到預(yù)期增加紫杉醇口服生物利用度的目的，胡椒堿作為逆轉(zhuǎn)劑提高紫杉醇口服生物利用度的研究有著廣闊的發(fā)展前景。