藍(lán)莓花青素對高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞株增殖的抑制作用及對細(xì)胞組蛋白乙?；揎椝降挠绊憽?/h1>
2022-03-29 13:02:48姜洞彬李梁和程海玉張建棟陳忠勝
廣西醫(yī)學(xué) 2022年1期
姜洞彬 李梁和 程海玉 徐 偉 張建棟 陳忠勝 楊 勤 詹 瑋
(1 貴州醫(yī)科大學(xué)外科學(xué)教研室，貴陽市 550004，電子郵箱:jiangjdb@qq.com；2 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，貴陽市 550000；3 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸外科，貴陽市 550004;4 貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴陽市 550004)
2020年全球最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，約有1 930萬新發(fā)病例和1 000萬死亡病例，且預(yù)計(jì)有增加的趨勢，其中肝癌作為生存率較低的惡性腫瘤，在全球前10位癌癥中新發(fā)病例(占4.7%)及死亡病例(占8.3%)分別位于第6位及第3位；我國作為肝病大國，在所有癌癥中肝癌新發(fā)病例(占9%)及死亡病例(占13%)分別位于第5位及第2位[1]。目前，肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確且治療效果欠佳，探討其發(fā)病機(jī)制和防治手段成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。已有研究表明，肝癌的發(fā)病機(jī)制可能與組蛋白乙酰化修飾水平異常密切相關(guān)，但對乙酰化位點(diǎn)修飾的具體研究卻少之又少[2]。
藍(lán)莓花青素是一類天然營養(yǎng)素，具有抗炎、抗腫瘤等功效，但其防治腫瘤的具體機(jī)制不詳。近年來，表觀遺傳學(xué)的興起為研究癌癥的發(fā)病機(jī)制提供了新思路，從分子水平探討其發(fā)病機(jī)制成為熱門話題。因此，或許可從表觀遺傳學(xué)角度出發(fā)，探討藍(lán)莓花青素對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。本研究通過實(shí)時(shí)無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)(Real Time Cellular Analysis，RTCA)、免疫熒光法、蛋白免疫印跡法，從表觀遺傳學(xué)角度探討不同濃度藍(lán)莓花青素對高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞增殖的抑制作用以及對細(xì)胞組蛋白(包括H3K14、H3K18、H3K27)乙?；揎椀挠绊?。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌LM3細(xì)胞株、藍(lán)莓花青素為實(shí)驗(yàn)室凍存；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)購于上海語純生物科技有限公司(批號：YC-2049)；青霉素-鏈霉素(批號：2321134)、谷氨酰胺(批號：21051024)、胎牛血清(批號：2139378CP)、胰蛋白酶/EDTA溶液(批號：2192619)、彩虹Marker(批號：20616)均由Thermo Fisher Scientific公司提供；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：D253071)、細(xì)胞裂解液(批號：P0013)、二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號：P0012S)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；錐蟲藍(lán)(批號：QT6229)購于華美生物工程公司；抗H3抗體、抗乙?；疕3K14(acetylated H3K14,acH3K14)抗體、抗乙?；疕3K18(acetylated H3K18,acH3K18)抗體、抗乙?；疕3K27(acetylated H3K27,acH3K27)抗體、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均購自Abcam公司(批號：ab1791、ab52946、ab40888、ab4729、ab150077)。
1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 倒置生物顯微鏡(型號：EVOS XL Core細(xì)胞成像系統(tǒng))由Thermo Fisher Scientific公司提供；倒置熒光顯微鏡(型號：BZ-X800E)由基恩士(中國)有限公司提供；CENCE湘儀離心機(jī)(型號：TDZ5-WS)由蘇州雨澤儀器有限公司提供；xCELLigence RTCA儀、E-Plate 16檢測板由艾森生物(杭州)有限公司提供；ChemiDoc Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)由武漢世紀(jì)珞珈科有限公司提供；Image J圖像處理軟件由National Institutes of Health開發(fā)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 LM3細(xì)胞的培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清及1%鏈霉素-青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)LM3細(xì)胞，放置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每周測一次pH值，調(diào)整pH維持在7.0左右；每兩周于培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺(每100 mL培養(yǎng)液中加入2 mL谷氨酰胺，調(diào)整終濃度為4 mmol/L)，取呈對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.3.2 干預(yù)方法：于6 cm的培養(yǎng)皿中鋪1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，取出培養(yǎng)皿，觀察培養(yǎng)皿顏色、清澈度等，須保證無污染等情況，倒出培養(yǎng)液并用平衡鹽溶液沖洗3次，向各培養(yǎng)皿中分別加入配置好的5種不同濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的藍(lán)莓花青素1 mL，其中以0 μg/mL為對照組。
1.3.3 LM3細(xì)胞生長形態(tài)的觀察：取1.3.2中不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)的LM3細(xì)胞繼續(xù)置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。棄培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，靜置1～2 min后終止消化，平衡鹽溶液沖洗掉消化液并制備細(xì)胞懸液，取懸液0.5 mL并加入0.3%錐蟲藍(lán)染液0.5 mL，3～5 min后滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，生物顯微鏡下計(jì)數(shù)4大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mL)=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.3.4 免疫熒光法觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象：取1.3.2中不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)的LM3細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h后的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液移至離心管中，平衡鹽溶液洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，室溫孵育1～2 min，吸除消化液，避免胰酶過度消化；用離心管中的培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打下來，移至離心管，置于離心機(jī)中2 000 r/min離心5 min，棄上清并收集細(xì)胞，平衡鹽溶液洗滌2次，重復(fù)前面離心步驟，棄上清并收集細(xì)胞，利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞中加入195 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光搖床孵育20 min，涂片后于倒置熒光顯微鏡下觀察不同濃度藍(lán)莓花青素處理后細(xì)胞的凋亡情況。Annexin V-FITC可使早期凋亡細(xì)胞綠染，PI能夠透過細(xì)胞膜使細(xì)胞核染紅，紅染增多說明中晚期的凋亡細(xì)胞增多。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
1.3.5 RTCA法檢測細(xì)胞增殖情況：向E-Plate檢測板中加入150 μL DMEM培養(yǎng)液并測定基線(未加入細(xì)胞時(shí)的阻抗值)，保證每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔的細(xì)胞指數(shù)(cell index,CI)低于0.063。取對數(shù)生長期的LM3細(xì)胞制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)(細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL)，取出E-Plate檢測板，加入適量體積的細(xì)胞，確保各孔道細(xì)胞數(shù)目為5 000個(gè)/100 μL。E-Plate檢測板在室溫超凈臺內(nèi)放置30 min后，放入RTCA 工作臺上進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)的細(xì)胞生長、增殖、貼壁檢測。過夜檢測(共19 h)后，參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]的藥物濃度設(shè)置，在各培養(yǎng)孔中分別加入配置好的5種不同濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的藍(lán)莓花青素100 μL并繼續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)檢測，每間隔15 min利用RTCA系統(tǒng)檢測一次，檢測至藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h?；跍y量到的電極阻抗值自動獲取相應(yīng)的CI，即用CI表示貼壁細(xì)胞引起的阻抗值，CI=(n時(shí)間點(diǎn)阻抗值-不存在細(xì)胞時(shí)阻抗值)/標(biāo)稱阻抗值(標(biāo)稱阻抗值是指xCELLigence RTCA儀器上標(biāo)注的阻抗值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)時(shí)動態(tài)檢測各時(shí)間點(diǎn)藍(lán)莓花青素干預(yù)LM3細(xì)胞后的增殖狀況，進(jìn)而分析出藍(lán)莓花青素處理LM3細(xì)胞的最適濃度和時(shí)間。
1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測LM3細(xì)胞中組蛋白乙?；稽c(diǎn)修飾水平：按1.3.2的步驟使用0 μg/mL、100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)LM3細(xì)胞。干預(yù)34 h后收集細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min后，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清棄沉淀，按照二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒使用說明書的操作步驟進(jìn)行蛋白定量檢測。蛋白定量后，制膠并加入內(nèi)槽液、外槽液，取40 μg總蛋白上樣，中間加入Marker 10 μL，通電80 V 2 h，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，室溫下?lián)u床2 h，倒掉封閉液，加TBST蓋過膜，搖床7 min/次，分別加入抗acH3K14抗體(1 ∶1 000)、抗acH3K18抗體(1 ∶1 000)、抗acH3K27抗體(1 ∶1 000)、抗H3抗體(1 ∶400)，4℃低溫過夜，TBST洗膜3次(7 min/次)，加入按1 ∶1 000稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，搖床處理1 h，TBST洗膜3次(7 min/次)，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，成像系統(tǒng)曝光拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以H3為內(nèi)參照，用Image J圖像處理軟件檢測所得條帶灰度值并進(jìn)行含量分析。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞的形態(tài)變化 沒有加入藍(lán)莓花青素(0 μg/mL)的LM3細(xì)胞生長旺盛；經(jīng)過藍(lán)莓花青素干預(yù)后的細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞數(shù)目減少，且隨藍(lán)莓花青素濃度升高，LM3細(xì)胞形態(tài)改變更加明顯，即LM3細(xì)胞體積更小，數(shù)目越少。見圖1。與0 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)的LM3細(xì)胞相比，50、100、150、200 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)后的LM3細(xì)胞數(shù)減少(均P<0.05)，其中100 μg/mL及以上濃度藍(lán)莓花青素處理后細(xì)胞數(shù)減少50%及以上。見表1。
表1 不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)后LM3細(xì)胞數(shù)(x±s，×106個(gè)/mL)
圖1 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞的形態(tài)(×200)
2.2 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞凋亡情況 隨著藍(lán)莓花青素濃度的增高，中晚期LM3細(xì)胞凋亡數(shù)目逐漸增多。見圖2。
圖2 不同濃度藍(lán)莓花青素處理LM3細(xì)胞的凋亡情況(×200)
2.3 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞增殖情況 與0 μg/mL藍(lán)莓花青素相比，除干預(yù)12 h時(shí)的50 μg/mL藍(lán)莓花青素外，各時(shí)間點(diǎn)不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)后LM3細(xì)胞的增殖水平均減弱(均P<0.05)，且具有劑量依賴性(均P<0.05)。在干預(yù)34 h時(shí)，100 μg/mL藍(lán)莓花青素對LM3細(xì)胞的增殖抑制率超過50%，150 μg/mL、200 μg/mL藍(lán)莓花青素的抑制率明顯大于50%，故可選取100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h作為處理LM3細(xì)胞的最適濃度和時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2和圖3。
表2 不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)LM3細(xì)胞后的增殖情況(x±s，CI值)
圖3 不同濃度藍(lán)莓花青素處理LM3細(xì)胞的增殖時(shí)-效曲線
2.4 最適濃度藍(lán)莓花青素對LM3細(xì)胞組蛋白乙?；挠绊?與0 μg/mL藍(lán)莓花青素相比，100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相對表達(dá)水平均增加(均P<0.05)。見表3和圖4。
表3 0、100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的相對表達(dá)水平(x±s)
圖4 0、100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的表達(dá)情況
3 討 論
近年來，天然植物營養(yǎng)素防治腫瘤的作用引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。藍(lán)莓是當(dāng)前廣受歡迎的水果之一，其富含類黃酮(主要成分為花青素)，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[4]。有研究表明，藍(lán)莓花青素可顯著減少肝纖維化中脂質(zhì)過氧化和氧化損傷的產(chǎn)物，緩解肝纖維化[5]；藍(lán)莓可通過錦葵色素-3-半乳糖苷在體內(nèi)、外途徑抑制肝癌細(xì)胞的增殖[6]。但缺乏藍(lán)莓花青素對高侵襲性肝癌細(xì)胞的影響的相關(guān)研究。故本研究選擇高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞作為研究對象，評估藍(lán)莓花青素對該細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，經(jīng)50、100、150、200 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)后，高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞的數(shù)量減少，中晚期凋亡細(xì)胞增多，增殖活性減弱，且隨著干預(yù)濃度增加，上述現(xiàn)象更為顯著，提示一定濃度的藍(lán)莓花青素可劑量依賴性地通過抑制增殖活性、誘導(dǎo)凋亡來控制高侵襲性肝癌細(xì)胞的生長，這與其對胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用[7]相符。
組蛋白修飾是在相關(guān)酶作用下N末端賴氨酸殘基側(cè)鏈被乙?；〈倪^程，多發(fā)生在H3上的14、18、27等位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可激活或沉默基因[8-9]。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)修飾中的一種，指不改變DNA序列而產(chǎn)生可遺傳的表型變化，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展[10]。例如，Guo等[11]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞組蛋白乙?；揎椝娇梢匝泳徣橄侔┑倪M(jìn)展。肝癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制研究已進(jìn)入分子水平階段，其已被證實(shí)是一種基因組疾病，但具體發(fā)病機(jī)制尚未明確[12]。而有研究表明，在肝癌發(fā)生過程中存在多種表觀遺傳變異[13]。Niu等[14]發(fā)現(xiàn)，人肝癌細(xì)胞中的H3組蛋白乙?；揎椝矫黠@降低。但目前有關(guān)表觀遺傳學(xué)中組蛋白乙酰化修飾水平與肝癌關(guān)系的相關(guān)研究仍較少。有學(xué)者指出天然營養(yǎng)素的抗癌作用與癌細(xì)胞中組蛋白的翻譯后修飾水平有關(guān)，其中包括肝癌、宮頸癌、胃癌等癌細(xì)胞[15-17]。本課題組的前期動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，藍(lán)莓中的營養(yǎng)成分可改善肝纖維化大鼠肝功能，這可能與其提高大鼠肝組織組蛋白乙?；揎椝接嘘P(guān)[18]。故本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討藍(lán)莓花青素抑制人肝癌LM3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。結(jié)合當(dāng)前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，本研究選取組蛋白H3K14、H3K18、H3K27位點(diǎn)進(jìn)行分析。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相對表達(dá)水平均增加(均P<0.05)。在抗腫瘤藥物中，組蛋白修飾已成為熱門靶點(diǎn)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)在干預(yù)癌癥中發(fā)揮重要作用，其通過提高組蛋白乙酰化水平促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的[19-20]，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于腫瘤治療。由此我們推測，藍(lán)莓花青素抑制高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞的作用機(jī)制與HDACI類似，即可抑制組蛋白去乙酰作用，上調(diào)癌細(xì)胞相關(guān)位點(diǎn)組蛋白乙?；揎椝絒21]，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。
綜上所述，藍(lán)莓花青素可劑量依賴性地抑制高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，這可能與其提高細(xì)胞組蛋白H3K14、H3K18、H3K27乙?；揎椝接嘘P(guān)。藍(lán)莓花青素或可成為具有巨大潛力的HDACI，為肝癌的綜合治療模式提供新思路，但尚需深入研究闡明具體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)僅初步研究了藍(lán)莓花青素上調(diào)細(xì)胞部分組蛋白乙酰化修飾位點(diǎn)的情況，而細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的程序性死亡[22]，組蛋白相關(guān)位點(diǎn)乙酰化水平升高與細(xì)胞凋亡的內(nèi)在聯(lián)系仍有待進(jìn)一步研究。
猜你喜歡
抑癌蛋白p53乙酰化修飾的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)(2022年8期)2022-09-08 00:39:50 藍(lán)莓建園技術(shù)河北果樹(2021年4期)2021-12-02 01:15:08 藍(lán)莓姑娘音樂教育與創(chuàng)作(2020年2期)2020-06-19 06:45:46 原花青素B2通過Akt/FoxO4通路拮抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年11期)2018-11-30 02:06:28 西海岸的藍(lán)莓名片商周刊(2017年5期)2017-08-22 03:35:22 甜甜的藍(lán)莓果作文周刊·小學(xué)一年級版(2017年26期)2017-08-10 20:31:15 花青素對非小細(xì)胞肺癌組織細(xì)胞GST-π表達(dá)的影響中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12 山楸梅漿果中花青素提取方法的優(yōu)化和測定中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:41 慢性支氣管哮喘小鼠肺組織中組蛋白H3乙?；揎椩鰪?qiáng)中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53 原花青素對腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護(hù)作用中國康復(fù)理論與實(shí)踐(2015年10期)2015-12-24 05:42:43
姜洞彬 李梁和 程海玉 徐 偉 張建棟 陳忠勝 楊 勤 詹 瑋
(1 貴州醫(yī)科大學(xué)外科學(xué)教研室，貴陽市 550004，電子郵箱:jiangjdb@qq.com；2 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，貴陽市 550000；3 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸外科，貴陽市 550004;4 貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴陽市 550004)
2020年全球最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，約有1 930萬新發(fā)病例和1 000萬死亡病例，且預(yù)計(jì)有增加的趨勢，其中肝癌作為生存率較低的惡性腫瘤，在全球前10位癌癥中新發(fā)病例(占4.7%)及死亡病例(占8.3%)分別位于第6位及第3位；我國作為肝病大國，在所有癌癥中肝癌新發(fā)病例(占9%)及死亡病例(占13%)分別位于第5位及第2位[1]。目前，肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確且治療效果欠佳，探討其發(fā)病機(jī)制和防治手段成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。已有研究表明，肝癌的發(fā)病機(jī)制可能與組蛋白乙酰化修飾水平異常密切相關(guān)，但對乙酰化位點(diǎn)修飾的具體研究卻少之又少[2]。
藍(lán)莓花青素是一類天然營養(yǎng)素，具有抗炎、抗腫瘤等功效，但其防治腫瘤的具體機(jī)制不詳。近年來，表觀遺傳學(xué)的興起為研究癌癥的發(fā)病機(jī)制提供了新思路，從分子水平探討其發(fā)病機(jī)制成為熱門話題。因此，或許可從表觀遺傳學(xué)角度出發(fā)，探討藍(lán)莓花青素對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。本研究通過實(shí)時(shí)無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)(Real Time Cellular Analysis，RTCA)、免疫熒光法、蛋白免疫印跡法，從表觀遺傳學(xué)角度探討不同濃度藍(lán)莓花青素對高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞增殖的抑制作用以及對細(xì)胞組蛋白(包括H3K14、H3K18、H3K27)乙?；揎椀挠绊?。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌LM3細(xì)胞株、藍(lán)莓花青素為實(shí)驗(yàn)室凍存；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)購于上海語純生物科技有限公司(批號：YC-2049)；青霉素-鏈霉素(批號：2321134)、谷氨酰胺(批號：21051024)、胎牛血清(批號：2139378CP)、胰蛋白酶/EDTA溶液(批號：2192619)、彩虹Marker(批號：20616)均由Thermo Fisher Scientific公司提供；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：D253071)、細(xì)胞裂解液(批號：P0013)、二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號：P0012S)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；錐蟲藍(lán)(批號：QT6229)購于華美生物工程公司；抗H3抗體、抗乙?；疕3K14(acetylated H3K14,acH3K14)抗體、抗乙?；疕3K18(acetylated H3K18,acH3K18)抗體、抗乙?；疕3K27(acetylated H3K27,acH3K27)抗體、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均購自Abcam公司(批號：ab1791、ab52946、ab40888、ab4729、ab150077)。
1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 倒置生物顯微鏡(型號：EVOS XL Core細(xì)胞成像系統(tǒng))由Thermo Fisher Scientific公司提供；倒置熒光顯微鏡(型號：BZ-X800E)由基恩士(中國)有限公司提供；CENCE湘儀離心機(jī)(型號：TDZ5-WS)由蘇州雨澤儀器有限公司提供；xCELLigence RTCA儀、E-Plate 16檢測板由艾森生物(杭州)有限公司提供；ChemiDoc Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)由武漢世紀(jì)珞珈科有限公司提供；Image J圖像處理軟件由National Institutes of Health開發(fā)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 LM3細(xì)胞的培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清及1%鏈霉素-青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)LM3細(xì)胞，放置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每周測一次pH值，調(diào)整pH維持在7.0左右；每兩周于培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺(每100 mL培養(yǎng)液中加入2 mL谷氨酰胺，調(diào)整終濃度為4 mmol/L)，取呈對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.3.2 干預(yù)方法：于6 cm的培養(yǎng)皿中鋪1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，取出培養(yǎng)皿，觀察培養(yǎng)皿顏色、清澈度等，須保證無污染等情況，倒出培養(yǎng)液并用平衡鹽溶液沖洗3次，向各培養(yǎng)皿中分別加入配置好的5種不同濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的藍(lán)莓花青素1 mL，其中以0 μg/mL為對照組。
1.3.3 LM3細(xì)胞生長形態(tài)的觀察：取1.3.2中不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)的LM3細(xì)胞繼續(xù)置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。棄培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，靜置1～2 min后終止消化，平衡鹽溶液沖洗掉消化液并制備細(xì)胞懸液，取懸液0.5 mL并加入0.3%錐蟲藍(lán)染液0.5 mL，3～5 min后滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，生物顯微鏡下計(jì)數(shù)4大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mL)=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.3.4 免疫熒光法觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象：取1.3.2中不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)的LM3細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h后的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液移至離心管中，平衡鹽溶液洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，室溫孵育1～2 min，吸除消化液，避免胰酶過度消化；用離心管中的培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打下來，移至離心管，置于離心機(jī)中2 000 r/min離心5 min，棄上清并收集細(xì)胞，平衡鹽溶液洗滌2次，重復(fù)前面離心步驟，棄上清并收集細(xì)胞，利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞中加入195 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光搖床孵育20 min，涂片后于倒置熒光顯微鏡下觀察不同濃度藍(lán)莓花青素處理后細(xì)胞的凋亡情況。Annexin V-FITC可使早期凋亡細(xì)胞綠染，PI能夠透過細(xì)胞膜使細(xì)胞核染紅，紅染增多說明中晚期的凋亡細(xì)胞增多。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
1.3.5 RTCA法檢測細(xì)胞增殖情況：向E-Plate檢測板中加入150 μL DMEM培養(yǎng)液并測定基線(未加入細(xì)胞時(shí)的阻抗值)，保證每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔的細(xì)胞指數(shù)(cell index,CI)低于0.063。取對數(shù)生長期的LM3細(xì)胞制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)(細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL)，取出E-Plate檢測板，加入適量體積的細(xì)胞，確保各孔道細(xì)胞數(shù)目為5 000個(gè)/100 μL。E-Plate檢測板在室溫超凈臺內(nèi)放置30 min后，放入RTCA 工作臺上進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)的細(xì)胞生長、增殖、貼壁檢測。過夜檢測(共19 h)后，參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]的藥物濃度設(shè)置，在各培養(yǎng)孔中分別加入配置好的5種不同濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的藍(lán)莓花青素100 μL并繼續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)檢測，每間隔15 min利用RTCA系統(tǒng)檢測一次，檢測至藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h?；跍y量到的電極阻抗值自動獲取相應(yīng)的CI，即用CI表示貼壁細(xì)胞引起的阻抗值，CI=(n時(shí)間點(diǎn)阻抗值-不存在細(xì)胞時(shí)阻抗值)/標(biāo)稱阻抗值(標(biāo)稱阻抗值是指xCELLigence RTCA儀器上標(biāo)注的阻抗值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)時(shí)動態(tài)檢測各時(shí)間點(diǎn)藍(lán)莓花青素干預(yù)LM3細(xì)胞后的增殖狀況，進(jìn)而分析出藍(lán)莓花青素處理LM3細(xì)胞的最適濃度和時(shí)間。
1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測LM3細(xì)胞中組蛋白乙?；稽c(diǎn)修飾水平：按1.3.2的步驟使用0 μg/mL、100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)LM3細(xì)胞。干預(yù)34 h后收集細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min后，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清棄沉淀，按照二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒使用說明書的操作步驟進(jìn)行蛋白定量檢測。蛋白定量后，制膠并加入內(nèi)槽液、外槽液，取40 μg總蛋白上樣，中間加入Marker 10 μL，通電80 V 2 h，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，室溫下?lián)u床2 h，倒掉封閉液，加TBST蓋過膜，搖床7 min/次，分別加入抗acH3K14抗體(1 ∶1 000)、抗acH3K18抗體(1 ∶1 000)、抗acH3K27抗體(1 ∶1 000)、抗H3抗體(1 ∶400)，4℃低溫過夜，TBST洗膜3次(7 min/次)，加入按1 ∶1 000稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，搖床處理1 h，TBST洗膜3次(7 min/次)，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，成像系統(tǒng)曝光拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以H3為內(nèi)參照，用Image J圖像處理軟件檢測所得條帶灰度值并進(jìn)行含量分析。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞的形態(tài)變化 沒有加入藍(lán)莓花青素(0 μg/mL)的LM3細(xì)胞生長旺盛；經(jīng)過藍(lán)莓花青素干預(yù)后的細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞數(shù)目減少，且隨藍(lán)莓花青素濃度升高，LM3細(xì)胞形態(tài)改變更加明顯，即LM3細(xì)胞體積更小，數(shù)目越少。見圖1。與0 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)的LM3細(xì)胞相比，50、100、150、200 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)后的LM3細(xì)胞數(shù)減少(均P<0.05)，其中100 μg/mL及以上濃度藍(lán)莓花青素處理后細(xì)胞數(shù)減少50%及以上。見表1。
表1 不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)后LM3細(xì)胞數(shù)(x±s，×106個(gè)/mL)
圖1 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞的形態(tài)(×200)
2.2 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞凋亡情況 隨著藍(lán)莓花青素濃度的增高，中晚期LM3細(xì)胞凋亡數(shù)目逐漸增多。見圖2。
圖2 不同濃度藍(lán)莓花青素處理LM3細(xì)胞的凋亡情況(×200)
2.3 不同濃度藍(lán)莓花青素處理后LM3細(xì)胞增殖情況 與0 μg/mL藍(lán)莓花青素相比，除干預(yù)12 h時(shí)的50 μg/mL藍(lán)莓花青素外，各時(shí)間點(diǎn)不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)后LM3細(xì)胞的增殖水平均減弱(均P<0.05)，且具有劑量依賴性(均P<0.05)。在干預(yù)34 h時(shí)，100 μg/mL藍(lán)莓花青素對LM3細(xì)胞的增殖抑制率超過50%，150 μg/mL、200 μg/mL藍(lán)莓花青素的抑制率明顯大于50%，故可選取100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h作為處理LM3細(xì)胞的最適濃度和時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2和圖3。
表2 不同濃度藍(lán)莓花青素干預(yù)LM3細(xì)胞后的增殖情況(x±s，CI值)
圖3 不同濃度藍(lán)莓花青素處理LM3細(xì)胞的增殖時(shí)-效曲線
2.4 最適濃度藍(lán)莓花青素對LM3細(xì)胞組蛋白乙?；挠绊?與0 μg/mL藍(lán)莓花青素相比，100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相對表達(dá)水平均增加(均P<0.05)。見表3和圖4。
表3 0、100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的相對表達(dá)水平(x±s)
圖4 0、100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的表達(dá)情況
3 討 論
近年來，天然植物營養(yǎng)素防治腫瘤的作用引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。藍(lán)莓是當(dāng)前廣受歡迎的水果之一，其富含類黃酮(主要成分為花青素)，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[4]。有研究表明，藍(lán)莓花青素可顯著減少肝纖維化中脂質(zhì)過氧化和氧化損傷的產(chǎn)物，緩解肝纖維化[5]；藍(lán)莓可通過錦葵色素-3-半乳糖苷在體內(nèi)、外途徑抑制肝癌細(xì)胞的增殖[6]。但缺乏藍(lán)莓花青素對高侵襲性肝癌細(xì)胞的影響的相關(guān)研究。故本研究選擇高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞作為研究對象，評估藍(lán)莓花青素對該細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，經(jīng)50、100、150、200 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)后，高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞的數(shù)量減少，中晚期凋亡細(xì)胞增多，增殖活性減弱，且隨著干預(yù)濃度增加，上述現(xiàn)象更為顯著，提示一定濃度的藍(lán)莓花青素可劑量依賴性地通過抑制增殖活性、誘導(dǎo)凋亡來控制高侵襲性肝癌細(xì)胞的生長，這與其對胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用[7]相符。
組蛋白修飾是在相關(guān)酶作用下N末端賴氨酸殘基側(cè)鏈被乙?；〈倪^程，多發(fā)生在H3上的14、18、27等位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可激活或沉默基因[8-9]。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)修飾中的一種，指不改變DNA序列而產(chǎn)生可遺傳的表型變化，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展[10]。例如，Guo等[11]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞組蛋白乙?；揎椝娇梢匝泳徣橄侔┑倪M(jìn)展。肝癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制研究已進(jìn)入分子水平階段，其已被證實(shí)是一種基因組疾病，但具體發(fā)病機(jī)制尚未明確[12]。而有研究表明，在肝癌發(fā)生過程中存在多種表觀遺傳變異[13]。Niu等[14]發(fā)現(xiàn)，人肝癌細(xì)胞中的H3組蛋白乙?；揎椝矫黠@降低。但目前有關(guān)表觀遺傳學(xué)中組蛋白乙酰化修飾水平與肝癌關(guān)系的相關(guān)研究仍較少。有學(xué)者指出天然營養(yǎng)素的抗癌作用與癌細(xì)胞中組蛋白的翻譯后修飾水平有關(guān)，其中包括肝癌、宮頸癌、胃癌等癌細(xì)胞[15-17]。本課題組的前期動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，藍(lán)莓中的營養(yǎng)成分可改善肝纖維化大鼠肝功能，這可能與其提高大鼠肝組織組蛋白乙?；揎椝接嘘P(guān)[18]。故本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討藍(lán)莓花青素抑制人肝癌LM3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。結(jié)合當(dāng)前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，本研究選取組蛋白H3K14、H3K18、H3K27位點(diǎn)進(jìn)行分析。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，100 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)34 h后LM3細(xì)胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相對表達(dá)水平均增加(均P<0.05)。在抗腫瘤藥物中，組蛋白修飾已成為熱門靶點(diǎn)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)在干預(yù)癌癥中發(fā)揮重要作用，其通過提高組蛋白乙酰化水平促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的[19-20]，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于腫瘤治療。由此我們推測，藍(lán)莓花青素抑制高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞的作用機(jī)制與HDACI類似，即可抑制組蛋白去乙酰作用，上調(diào)癌細(xì)胞相關(guān)位點(diǎn)組蛋白乙?；揎椝絒21]，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。
綜上所述，藍(lán)莓花青素可劑量依賴性地抑制高侵襲性人肝癌LM3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，這可能與其提高細(xì)胞組蛋白H3K14、H3K18、H3K27乙?；揎椝接嘘P(guān)。藍(lán)莓花青素或可成為具有巨大潛力的HDACI，為肝癌的綜合治療模式提供新思路，但尚需深入研究闡明具體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)僅初步研究了藍(lán)莓花青素上調(diào)細(xì)胞部分組蛋白乙酰化修飾位點(diǎn)的情況，而細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的程序性死亡[22]，組蛋白相關(guān)位點(diǎn)乙酰化水平升高與細(xì)胞凋亡的內(nèi)在聯(lián)系仍有待進(jìn)一步研究。
猜你喜歡
中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)(2022年8期)2022-09-08 00:39:50
河北果樹(2021年4期)2021-12-02 01:15:08
音樂教育與創(chuàng)作(2020年2期)2020-06-19 06:45:46
天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年11期)2018-11-30 02:06:28
商周刊(2017年5期)2017-08-22 03:35:22
作文周刊·小學(xué)一年級版(2017年26期)2017-08-10 20:31:15
中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:41
中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53
中國康復(fù)理論與實(shí)踐(2015年10期)2015-12-24 05:42:43
