姜洞彬 李梁和 程海玉 徐 偉 張建棟 陳忠勝 楊 勤 詹 瑋

(1 貴州醫(yī)科大學外科學教研室，貴陽市 550004，電子郵箱:jiangjdb@qq.com；2 貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，貴陽市 550000；3 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肛腸外科，貴陽市 550004;4 貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室，貴陽市 550004)

2020年全球最新癌癥統(tǒng)計數據顯示，約有1 930萬新發(fā)病例和1 000萬死亡病例，且預計有增加的趨勢，其中肝癌作為生存率較低的惡性腫瘤，在全球前10位癌癥中新發(fā)病例(占4.7%)及死亡病例(占8.3%)分別位于第6位及第3位；我國作為肝病大國，在所有癌癥中肝癌新發(fā)病例(占9%)及死亡病例(占13%)分別位于第5位及第2位[1]。目前，肝癌的發(fā)病機制尚不明確且治療效果欠佳，探討其發(fā)病機制和防治手段成為眾多學者研究的重點。已有研究表明，肝癌的發(fā)病機制可能與組蛋白乙?；揎椝疆惓Ｃ芮邢嚓P，但對乙?；稽c修飾的具體研究卻少之又少[2]。

藍莓花青素是一類天然營養(yǎng)素，具有抗炎、抗腫瘤等功效，但其防治腫瘤的具體機制不詳。近年來，表觀遺傳學的興起為研究癌癥的發(fā)病機制提供了新思路，從分子水平探討其發(fā)病機制成為熱門話題。因此，或許可從表觀遺傳學角度出發(fā)，探討藍莓花青素對肝癌細胞增殖的抑制作用。本研究通過實時無標記動態(tài)細胞分析技術(Real Time Cellular Analysis，RTCA)、免疫熒光法、蛋白免疫印跡法，從表觀遺傳學角度探討不同濃度藍莓花青素對高侵襲性人肝癌LM3細胞增殖的抑制作用以及對細胞組蛋白(包括H3K14、H3K18、H3K27)乙酰化修飾的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌LM3細胞株、藍莓花青素為實驗室凍存；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)購于上海語純生物科技有限公司(批號：YC-2049)；青霉素-鏈霉素(批號：2321134)、谷氨酰胺(批號：21051024)、胎牛血清(批號：2139378CP)、胰蛋白酶/EDTA溶液(批號：2192619)、彩虹Marker(批號：20616)均由Thermo Fisher Scientific公司提供；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細胞凋亡檢測試劑盒(批號：D253071)、細胞裂解液(批號：P0013)、二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號：P0012S)均購自上海碧云天生物技術有限公司；錐蟲藍(批號：QT6229)購于華美生物工程公司；抗H3抗體、抗乙?；疕3K14(acetylated H3K14,acH3K14)抗體、抗乙?；疕3K18(acetylated H3K18,acH3K18)抗體、抗乙?；疕3K27(acetylated H3K27,acH3K27)抗體、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)均購自Abcam公司(批號：ab1791、ab52946、ab40888、ab4729、ab150077)。

1.2 實驗儀器 倒置生物顯微鏡(型號：EVOS XL Core細胞成像系統(tǒng))由Thermo Fisher Scientific公司提供；倒置熒光顯微鏡(型號：BZ-X800E)由基恩士(中國)有限公司提供；CENCE湘儀離心機(型號：TDZ5-WS)由蘇州雨澤儀器有限公司提供；xCELLigence RTCA儀、E-Plate 16檢測板由艾森生物(杭州)有限公司提供；ChemiDoc Touch化學發(fā)光成像系統(tǒng)由武漢世紀珞珈科有限公司提供；Image J圖像處理軟件由National Institutes of Health開發(fā)。

1.3 實驗方法

1.3.1 LM3細胞的培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清及1%鏈霉素-青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)LM3細胞，放置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，進行傳代培養(yǎng)，每周測一次pH值，調整pH維持在7.0左右；每兩周于培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺(每100 mL培養(yǎng)液中加入2 mL谷氨酰胺，調整終濃度為4 mmol/L)，取呈對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 干預方法：于6 cm的培養(yǎng)皿中鋪1×105個細胞進行傳代培養(yǎng)，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，取出培養(yǎng)皿，觀察培養(yǎng)皿顏色、清澈度等，須保證無污染等情況，倒出培養(yǎng)液并用平衡鹽溶液沖洗3次，向各培養(yǎng)皿中分別加入配置好的5種不同濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的藍莓花青素1 mL，其中以0 μg/mL為對照組。

1.3.3 LM3細胞生長形態(tài)的觀察：取1.3.2中不同濃度藍莓花青素干預的LM3細胞繼續(xù)置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h后，顯微鏡下觀察細胞生長情況。棄培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，靜置1～2 min后終止消化，平衡鹽溶液沖洗掉消化液并制備細胞懸液，取懸液0.5 mL并加入0.3%錐蟲藍染液0.5 mL，3～5 min后滴入細胞計數板上，生物顯微鏡下計數4大格內細胞數量，細胞數(個/mL)=4個大格細胞總數/4×稀釋倍數×104，實驗重復3次。

1.3.4 免疫熒光法觀察細胞凋亡現(xiàn)象：取1.3.2中不同濃度藍莓花青素干預的LM3細胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h后的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液移至離心管中，平衡鹽溶液洗滌貼壁細胞1次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，室溫孵育1～2 min，吸除消化液，避免胰酶過度消化；用離心管中的培養(yǎng)液將細胞吹打下來，移至離心管，置于離心機中2 000 r/min離心5 min，棄上清并收集細胞，平衡鹽溶液洗滌2次，重復前面離心步驟，棄上清并收集細胞，利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。細胞中加入195 μL結合緩沖液懸浮細胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光搖床孵育20 min，涂片后于倒置熒光顯微鏡下觀察不同濃度藍莓花青素處理后細胞的凋亡情況。Annexin V-FITC可使早期凋亡細胞綠染，PI能夠透過細胞膜使細胞核染紅，紅染增多說明中晚期的凋亡細胞增多。重復實驗3次。

1.3.5 RTCA法檢測細胞增殖情況：向E-Plate檢測板中加入150 μL DMEM培養(yǎng)液并測定基線(未加入細胞時的阻抗值)，保證每個實驗孔的細胞指數(cell index,CI)低于0.063。取對數生長期的LM3細胞制備細胞懸液并計數(細胞密度為5×104個/mL)，取出E-Plate檢測板，加入適量體積的細胞，確保各孔道細胞數目為5 000個/100 μL。E-Plate檢測板在室溫超凈臺內放置30 min后，放入RTCA 工作臺上進行實時動態(tài)的細胞生長、增殖、貼壁檢測。過夜檢測(共19 h)后，參照相關文獻[3]的藥物濃度設置，在各培養(yǎng)孔中分別加入配置好的5種不同濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的藍莓花青素100 μL并繼續(xù)進行實時動態(tài)檢測，每間隔15 min利用RTCA系統(tǒng)檢測一次，檢測至藍莓花青素干預34 h?；跍y量到的電極阻抗值自動獲取相應的CI，即用CI表示貼壁細胞引起的阻抗值，CI=(n時間點阻抗值-不存在細胞時阻抗值)/標稱阻抗值(標稱阻抗值是指xCELLigence RTCA儀器上標注的阻抗值)。實驗重復3次。實時動態(tài)檢測各時間點藍莓花青素干預LM3細胞后的增殖狀況，進而分析出藍莓花青素處理LM3細胞的最適濃度和時間。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測LM3細胞中組蛋白乙?；稽c修飾水平：按1.3.2的步驟使用0 μg/mL、100 μg/mL藍莓花青素干預LM3細胞。干預34 h后收集細胞，分別加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min后，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清棄沉淀，按照二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒使用說明書的操作步驟進行蛋白定量檢測。蛋白定量后，制膠并加入內槽液、外槽液，取40 μg總蛋白上樣，中間加入Marker 10 μL，通電80 V 2 h，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，室溫下?lián)u床2 h，倒掉封閉液，加TBST蓋過膜，搖床7 min/次，分別加入抗acH3K14抗體(1 ∶1 000)、抗acH3K18抗體(1 ∶1 000)、抗acH3K27抗體(1 ∶1 000)、抗H3抗體(1 ∶400)，4℃低溫過夜，TBST洗膜3次(7 min/次)，加入按1 ∶1 000稀釋的Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)，搖床處理1 h，TBST洗膜3次(7 min/次)，采用化學發(fā)光法顯色，成像系統(tǒng)曝光拍照。實驗重復3次。以H3為內參照，用Image J圖像處理軟件檢測所得條帶灰度值并進行含量分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度藍莓花青素處理后LM3細胞的形態(tài)變化 沒有加入藍莓花青素(0 μg/mL)的LM3細胞生長旺盛；經過藍莓花青素干預后的細胞體積縮小，細胞數目減少，且隨藍莓花青素濃度升高，LM3細胞形態(tài)改變更加明顯，即LM3細胞體積更小，數目越少。見圖1。與0 μg/mL藍莓花青素干預的LM3細胞相比，50、100、150、200 μg/mL藍莓花青素干預后的LM3細胞數減少(均P<0.05)，其中100 μg/mL及以上濃度藍莓花青素處理后細胞數減少50%及以上。見表1。

表1 不同濃度藍莓花青素干預后LM3細胞數(x±s，×106個/mL)

圖1 不同濃度藍莓花青素處理后LM3細胞的形態(tài)(×200)

2.2 不同濃度藍莓花青素處理后LM3細胞凋亡情況 隨著藍莓花青素濃度的增高，中晚期LM3細胞凋亡數目逐漸增多。見圖2。

圖2 不同濃度藍莓花青素處理LM3細胞的凋亡情況(×200)

2.3 不同濃度藍莓花青素處理后LM3細胞增殖情況 與0 μg/mL藍莓花青素相比，除干預12 h時的50 μg/mL藍莓花青素外，各時間點不同濃度藍莓花青素干預后LM3細胞的增殖水平均減弱(均P<0.05)，且具有劑量依賴性(均P<0.05)。在干預34 h時，100 μg/mL藍莓花青素對LM3細胞的增殖抑制率超過50%，150 μg/mL、200 μg/mL藍莓花青素的抑制率明顯大于50%，故可選取100 μg/mL藍莓花青素干預34 h作為處理LM3細胞的最適濃度和時間進行后續(xù)實驗。見表2和圖3。

表2 不同濃度藍莓花青素干預LM3細胞后的增殖情況(x±s，CI值)

圖3 不同濃度藍莓花青素處理LM3細胞的增殖時-效曲線

2.4 最適濃度藍莓花青素對LM3細胞組蛋白乙?；挠绊?與0 μg/mL藍莓花青素相比，100 μg/mL藍莓花青素干預34 h后LM3細胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相對表達水平均增加(均P<0.05)。見表3和圖4。

表3 0、100 μg/mL藍莓花青素干預34 h后LM3細胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的相對表達水平(x±s)

圖4 0、100 μg/mL藍莓花青素干預34 h后LM3細胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的表達情況

3 討 論

近年來，天然植物營養(yǎng)素防治腫瘤的作用引起了眾多學者的關注。藍莓是當前廣受歡迎的水果之一，其富含類黃酮(主要成分為花青素)，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[4]。有研究表明，藍莓花青素可顯著減少肝纖維化中脂質過氧化和氧化損傷的產物，緩解肝纖維化[5]；藍莓可通過錦葵色素-3-半乳糖苷在體內、外途徑抑制肝癌細胞的增殖[6]。但缺乏藍莓花青素對高侵襲性肝癌細胞的影響的相關研究。故本研究選擇高侵襲性人肝癌LM3細胞作為研究對象，評估藍莓花青素對該細胞增殖的抑制作用。結果顯示，經50、100、150、200 μg/mL藍莓花青素干預后，高侵襲性人肝癌LM3細胞的數量減少，中晚期凋亡細胞增多，增殖活性減弱，且隨著干預濃度增加，上述現(xiàn)象更為顯著，提示一定濃度的藍莓花青素可劑量依賴性地通過抑制增殖活性、誘導凋亡來控制高侵襲性肝癌細胞的生長，這與其對胃腺癌BGC-823細胞增殖的抑制作用[7]相符。

組蛋白修飾是在相關酶作用下N末端賴氨酸殘基側鏈被乙?；〈倪^程，多發(fā)生在H3上的14、18、27等位點，這些位點可激活或沉默基因[8-9]。組蛋白修飾是表觀遺傳學修飾中的一種，指不改變DNA序列而產生可遺傳的表型變化，進而導致癌癥的發(fā)生和發(fā)展[10]。例如，Guo等[11]發(fā)現(xiàn)，上調乳腺癌細胞組蛋白乙酰化修飾水平可以延緩乳腺癌的進展。肝癌的發(fā)生和發(fā)展機制研究已進入分子水平階段，其已被證實是一種基因組疾病，但具體發(fā)病機制尚未明確[12]。而有研究表明，在肝癌發(fā)生過程中存在多種表觀遺傳變異[13]。Niu等[14]發(fā)現(xiàn)，人肝癌細胞中的H3組蛋白乙酰化修飾水平明顯降低。但目前有關表觀遺傳學中組蛋白乙酰化修飾水平與肝癌關系的相關研究仍較少。有學者指出天然營養(yǎng)素的抗癌作用與癌細胞中組蛋白的翻譯后修飾水平有關，其中包括肝癌、宮頸癌、胃癌等癌細胞[15-17]。本課題組的前期動物實驗結果也提示，藍莓中的營養(yǎng)成分可改善肝纖維化大鼠肝功能，這可能與其提高大鼠肝組織組蛋白乙?；揎椝接嘘P[18]。故本研究通過體外實驗，進一步探討藍莓花青素抑制人肝癌LM3細胞增殖的作用機制。結合當前國內外研究現(xiàn)狀，本研究選取組蛋白H3K14、H3K18、H3K27位點進行分析。蛋白免疫印跡結果顯示，100 μg/mL藍莓花青素干預34 h后LM3細胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相對表達水平均增加(均P<0.05)。在抗腫瘤藥物中，組蛋白修飾已成為熱門靶點，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)在干預癌癥中發(fā)揮重要作用，其通過提高組蛋白乙?；酱龠M基因轉錄，從而達到預防和治療疾病的目的[19-20]，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準應用于腫瘤治療。由此我們推測，藍莓花青素抑制高侵襲性人肝癌LM3細胞的作用機制與HDACI類似，即可抑制組蛋白去乙酰作用，上調癌細胞相關位點組蛋白乙酰化修飾水平[21]，進而抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡。

綜上所述，藍莓花青素可劑量依賴性地抑制高侵襲性人肝癌LM3細胞的增殖，促進其凋亡，這可能與其提高細胞組蛋白H3K14、H3K18、H3K27乙?；揎椝接嘘P。藍莓花青素或可成為具有巨大潛力的HDACI，為肝癌的綜合治療模式提供新思路，但尚需深入研究闡明具體機制。本實驗僅初步研究了藍莓花青素上調細胞部分組蛋白乙?；揎椢稽c的情況，而細胞凋亡是一個復雜的程序性死亡[22]，組蛋白相關位點乙?；缴吲c細胞凋亡的內在聯(lián)系仍有待進一步研究。