馬忠平 葉楠 張志峰 楊毅峰 楊云

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是最常見的骨骼疾病, 是一種以骨量低，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。骨質(zhì)疏松癥通常無癥狀或輕微，是臨床病理性骨折的常見原因，也是影響人類健康高危因素之一[2]。相關(guān)研究[3-4]報(bào)道，世界范圍內(nèi)，骨質(zhì)疏松癥在超過50歲人群中的影響率為15%，在80歲以上的人群中其影響率為70%。骨質(zhì)疏松癥的患病人群中，2%～8%的男性和9%～38%的女性受到骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)并發(fā)癥的嚴(yán)重影響[5]。目前全世界近5 000萬人患有骨質(zhì)疏松癥，超過1 800萬人骨量低于正常，形成了龐大的骨質(zhì)疏松癥的高危人群[4]。近期研究[6-7]指出，遺傳因素、生理、環(huán)境和生活方式對(duì)骨量均有重要影響，手術(shù)切除卵巢、酒精中毒、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、厭食癥、腎臟疾病等多種疾病可以誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥，另外，化療、抗癲癇藥物、質(zhì)子泵抑制劑、糖皮質(zhì)激素藥物和選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等一些藥物也可以引起骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥其發(fā)病相關(guān)分子機(jī)制尚未明確，臨床表現(xiàn)及預(yù)后均較為復(fù)雜，且病程遷延，尚未有有效治療方法。

芝麻素是從花椒植物的表皮和芝麻油中分離得到的一類木脂素，通常被用作膳食減脂補(bǔ)充劑。其主要代謝產(chǎn)物是腸內(nèi)酯，半衰期小于6 h。芝麻素是芝麻油的次要成分，平均僅占芝麻油總重量的0.14 %[8-9]。Orawan等[10]證實(shí)芝麻素可以通過激活p38和ERK/MAPK途徑來觸發(fā)人類胎兒成骨細(xì)胞和人類脂肪來源干細(xì)胞的成骨分化。相關(guān)研究指出，芝麻素通過調(diào)節(jié)Wnt/b-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，其對(duì)重塑大鼠骨結(jié)構(gòu)有一定影響。然而，芝麻素對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用影響鮮有研究，故而在病理狀態(tài)下，芝麻素對(duì)骨代謝是否有影響尚不得而知。本研究建立OVX大鼠模型，進(jìn)行大鼠的芝麻素灌胃干預(yù)，行Micro-CT并檢測(cè)OCN含量以及I型膠原表達(dá)，以探究芝麻素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步為應(yīng)用芝麻素治療骨質(zhì)疏松奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 芝麻素制備

芝麻素(S9314，Sigma-Aldrich)使用二甲基亞砜(DMSO，Sigma) 溶解為14.22 mmol/L的溶液，儲(chǔ)存于-20 ℃。

1.2 大鼠飼養(yǎng)

Sprague Dawley(SD)大鼠購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。雌性SD大鼠18只，10個(gè)月齡，體重(72±6) g，維持標(biāo)準(zhǔn)大鼠飲食和自由飲水，飼養(yǎng)于溫度(22±2) ℃，濕度(50±5)%，12 h光暗循環(huán)的動(dòng)物室內(nèi)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)家衛(wèi)生研究院“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理原則指南” 進(jìn)行(NIP出版物85-23, 1996年修訂)，并經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(項(xiàng)目編號(hào)為2017032, 日期為2017年7月15日)。

1.3 去卵巢(ovariectomized, OVX)大鼠模型制備

共18只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(每組6只)：OVX組(去卵巢大鼠未干預(yù))、OVX+S(去卵巢大鼠芝麻素干預(yù))組和Sham組(假手術(shù))。OVX組和OVX+S組大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除，建立低雌激素水平的OVX模型。Sham組大鼠卵巢膜脂肪組織暴露后縫合。3組SD大鼠手術(shù)條件及手術(shù)時(shí)間均相同。

1.4 芝麻素灌胃干預(yù)

OVX+S組大鼠在上午10:00至上午12:00之間給予芝麻素(80 mg/kg)灌胃，每天1次；OVX組和Sham組大鼠在相同時(shí)間給予生理鹽水(0.9%)灌胃，每天1次。實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組其他條件均相同，大鼠連續(xù)喂養(yǎng)12周。

1.5 大鼠股骨Micro-CT測(cè)量

連續(xù)飼養(yǎng)12周后，所有研究大鼠均用戊巴比妥鈉(150 mg/kg)(Sigma)進(jìn)行安樂死。分離大鼠股骨，并去除周圍的軟組織。股骨樣品在4%多聚甲醛中固定72 h。使用Micro-CT系統(tǒng)(SCANCOCT80; Medical AG)，固定參數(shù)設(shè)置為55 kV及145 μA，測(cè)量參數(shù)包括骨密度(bone mineral density, BMD)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)和小梁間距(trabecular spacing, Tb.Sp)，可視化定量分析股骨三維微結(jié)構(gòu)。

1.6 大鼠股骨OCN的免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)

大鼠股骨標(biāo)本由2名病理科醫(yī)師共同切片。將切片的股骨樣本于70 ℃下干燥30 min。脫蠟和逐級(jí)乙醇水合后，將切片EDTA孵育30 min，后于37 ℃下經(jīng)3% H2O2孵育30 min。給予山羊血清于37 ℃封閉30 min，后與兔抗鼠骨鈣素(OCN)抗體(1∶100，ab13420，Abcam)于4 ℃的濕盒中孵育過夜。添加山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶1 000，ab6721，Abcam)于37 ℃孵育30 min。室溫條件DAB(碧云天)染色及蘇木精-伊紅(H&E)(碧云天)染色，顯微鏡下觀察樣本顏色變化，及時(shí)終止。逐級(jí)脫水后，中性樹脂密封切片。Image-Pro Plus 6.0分析陽性O(shè)CN的OD值。

1.7 大鼠股骨I型膠原的免疫熒光(ICC/IF)檢測(cè)

大鼠股骨標(biāo)本由2名病理科醫(yī)師協(xié)商切片。將切片的股骨樣本于70 ℃下干燥30 min。脫蠟和逐級(jí)乙醇水合后，將切片EDTA孵育30 min，后于37 ℃下經(jīng)3% H2O2孵育30 min。給予山羊血清于37 ℃封閉30 min，使用兔抗鼠Ⅰ型膠原(1∶500，ab34710，Abcam)抗體于25 ℃孵育1 h。加入Fluor?488山羊抗兔抗體(1∶500，ZSGB)室溫(25 ℃)避光孵育1 h。后經(jīng)DAPI核染，激光共聚焦顯微鏡觀察切片。結(jié)果經(jīng)Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 芝麻素處理大鼠后對(duì)各組股骨Micro-CT結(jié)果的影響

芝麻素對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥有積極作用，在圖1中，Micro-CT顯示OVX組BMD(F=34.84,P=0.000 3)及Tb.N(F=13.12，P=0.003 7)低于sham組，而Tb.Sp(F=64.16，P<0.000 1)高于Sham組，表明骨質(zhì)疏松大鼠的建模成功。與OVX組相比，OVX+S組大鼠BMD (T2=6.737，P<0.05)增加，Tb.Sp(T2=7.124，P<0.05)降低，Tb.N差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OVX+S組和Sham組的BMD和Tb.N差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Tb.Sp差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T3=3.769，P<0.05)。

2.2 芝麻素處理大鼠后各組股骨中OCN的免疫組化表達(dá)

圖2顯示OVX組(t=5.083，P<0.0 5)和OVX+S組(t=3.995，P<0.05)的OCN明顯低于Sham組。OVX+S組OCN高于OVX組，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 芝麻素處理大鼠后各組股骨中I型膠原的免疫熒光表達(dá)

圖3顯示OVX組I型膠原低于Sham組(t=10.40，P<0.05)。OVX+S組和Sham組I型膠原水平相近，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究中，Micro-CT證實(shí)了成功建立的OVX大鼠模型，該模型具有較低的BMD和Tb.N，且具有較高的Tb.Sp，與臨床表征相符。給予80 mg/kg芝麻素灌胃可提高去勢(shì)大鼠股骨BMD和Tb.N，降低Tb.Sp，對(duì)去勢(shì)的骨質(zhì)疏松癥模型的骨量丟失有抑制作用。同時(shí)IHC及ICC/IF可知芝麻素對(duì)OCN和I型膠原的丟失具有預(yù)防作用并可促進(jìn)OCN和I型膠原的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明芝麻素(80 mg/kg)對(duì)骨骼結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

所有人在老年階段都會(huì)經(jīng)歷骨密度下降[11]。圍絕經(jīng)期婦女在早期存在更快速度的骨量丟失，導(dǎo)致更高的骨折風(fēng)險(xiǎn)[12]。性腺功能減退是導(dǎo)致男性骨密度下降的重要危險(xiǎn)因素[13]。一些生物標(biāo)志物已被證實(shí)在骨質(zhì)疏松的發(fā)展中具有重要檢測(cè)意義。BMD、Tb.N以及Tb.Sp已被證實(shí)與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，與健康人相比，骨質(zhì)疏松患者的BMD和Tb.N通常較低而同時(shí)Tb.Sp較高。此外，OCN以及I型膠原為骨質(zhì)主要成分，其降低在骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)中最具代表性[14]。

前期研究[15]已經(jīng)證明芝麻素可以通過激活p38和ERK/MAPK途徑以及Wnt/b-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)成骨分化。本研究中，芝麻素處理提高了BMD、Tb.N、OCN以及I型膠原水平，而下調(diào)了Tb.Sp水平，表明芝麻素在大鼠機(jī)體復(fù)雜結(jié)構(gòu)環(huán)境中亦具有促進(jìn)成骨的能力，其對(duì)本實(shí)驗(yàn)條件下大鼠的骨量丟失具有保護(hù)作用，對(duì)骨質(zhì)疏松具有治療和預(yù)防作用。以芝麻素為切入靶點(diǎn)的基于人體的相關(guān)研究厄待開展。

綜上，本研究初步證實(shí)芝麻素對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松癥有一定的治療和預(yù)防作用，為進(jìn)一步探究芝麻素對(duì)人骨質(zhì)疏松癥的臨床治療作用奠定理論基礎(chǔ)。

注：與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。圖3 芝麻素處理大鼠后各組股骨中I型膠原的免疫熒光表達(dá)Fig.3 Immunofluorescence expression of type I collagen in the femurs after administration of different dose of sesamin in rats