陳鏡 馮正平

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400016

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和骨質(zhì)疏松癥是常見的慢性疾病，其患病率逐年上升。目前我國(guó)的糖尿病患病率高達(dá)11.2%，50歲以上人群骨質(zhì)疏松患病率高達(dá)19.2%。2型糖尿病患者因?yàn)槌掷m(xù)高血糖狀態(tài)、胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺乏、糖尿病微血管病變及體內(nèi)激素水平的改變等原因，其患骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高[1]。信號(hào)素3A(semaphorin3A，Sema3A)作為信號(hào)素家族中的一員，是胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)及骨發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[2-3]。在骨重建過程中，Sema3A通過抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成發(fā)揮骨保護(hù)作用[4-5]。動(dòng)物研究[6]表明高糖可降低Sema3A及其受體神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp1)的表達(dá)，并且降低成骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制成骨分化。有關(guān)糖尿病患者血清Sema3A水平與骨代謝的相關(guān)性尚無報(bào)道。本研究旨在觀察2型糖尿病患者血清Sema3A水平與骨密度、骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床防治糖尿病合并骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年3月至2021年1月于重醫(yī)附一院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者共129例。根據(jù)DXA測(cè)定的腰椎(L1～L4)或股骨頸或全髖骨密度，按T值分成骨質(zhì)疏松組(62例，T值≤-2.5)和非骨質(zhì)疏松組(67例，T值>-2.5)，其中非骨質(zhì)疏松組包括低骨量和正常骨量患者。該研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，由于ELISA檢測(cè)標(biāo)本來自內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室廢棄血標(biāo)本，故免除知情同意。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)1999年WHO的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷2型糖尿??；②自然絕經(jīng)后女性；③男性年齡≥50歲。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)：①1型糖尿病、妊娠糖尿病、特殊類型糖尿病或合并糖尿病急性并發(fā)癥(如高血糖高滲狀態(tài)、酮癥酸中毒)；②合并有惡性腫瘤、甲狀腺或甲狀旁腺疾病、腸胃營(yíng)養(yǎng)不良、嚴(yán)重感染等影響骨代謝的其他內(nèi)分泌疾病或慢性疾?。虎酆喜⒂羞^敏性鼻炎、過敏性哮喘、自身免疫性疾病等；④嚴(yán)重的肝腎功能不全；⑤近6個(gè)月內(nèi)有急性心腦血管事件發(fā)生者；⑥服用影響骨代謝藥物或接受過抗骨質(zhì)疏松治療(如雙膦酸鹽、甲狀旁腺素、雌激素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等)。

1.2 研究方法

1.2.1臨床資料的收集：收集兩組患者的臨床資料，包括性別、年齡、糖尿病病程、身高、體重，并計(jì)算BMI。

1.2.2骨密度的測(cè)定：采用美國(guó)HOLOGIC公司的Discovery A(S/N 87352)骨密度儀雙能X線吸收法(DXA)測(cè)定腰椎(L1～L4)、全髖及股骨頸骨密度，單位為g/cm2，CV值為1.0%。

1.2.3Sema3A的測(cè)定：清晨空腹采集靜脈血，分裝于離心試管中在室溫放置2 h，然后1 000 r/min離心15 min，取上清液將其置于-80 ℃低溫冰箱保存待測(cè)。采用江萊生物的人Sema3A ELISA試劑盒測(cè)定，板內(nèi)CV值<9%，板間CV值<11%。每例血清樣本均設(shè)2個(gè)測(cè)試孔，最終反應(yīng)板在酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)450 nm處讀取吸光度值，并取其2個(gè)測(cè)試孔吸光度平均值，在Excel工作表中繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.2.4骨代謝指標(biāo)及各生化指標(biāo)的測(cè)定：①血PINP、血OC、血β-CTX均采用電化學(xué)法測(cè)定；②血BALP、血PTH均采用化學(xué)發(fā)光法；③血25(OH)D采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法；④血Ca、血Mg、血P采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；⑤隨機(jī)UALB/Cr采用透射比濁法；⑥ HbA1c采用高壓液相離子交換層析法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，正態(tài)性檢驗(yàn)采用單個(gè)樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。滿足正態(tài)分布計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)范圍)[M(P25～P75)]表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，采用卡方檢驗(yàn)。兩個(gè)連續(xù)性數(shù)值變量采用Spearman相關(guān)分析。血清Sema3A水平與骨密度及骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性采用多元線性回歸分析方法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病患者的臨床資料

2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松組和非骨質(zhì)疏松組間糖尿病病程、HbA1c、隨機(jī)UALB/Cr相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。兩組間性別比例、年齡、BMI相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，其中骨質(zhì)疏松組年齡高于非骨質(zhì)疏松組，而BMI水平低于非骨質(zhì)疏松組。與非骨質(zhì)疏松組相比，骨質(zhì)疏松組患者女性占比明顯更高。見表1。

表1 2型糖尿病患者的臨床資料Table 1 The clinical data of T2DM

2.2 2型糖尿病患者的血清Sema3A、骨密度、骨代謝指標(biāo)

2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松組腰椎骨密度、全髖骨密度、股骨頸骨密度明顯低于非骨質(zhì)疏松組(均P<0.01)。血清Sema3A水平骨質(zhì)疏松組顯著低于非骨質(zhì)疏松組(P<0.05)。血清β-CTX在骨質(zhì)疏松組較非骨質(zhì)疏松組明顯升高(P<0.05)。和非骨質(zhì)疏松組患者相比，骨質(zhì)疏松組血PINP、OC、BALP、PTH升高，25(OH)D降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 2型糖尿病患者的血清Sema3A、骨密度、骨代謝指標(biāo)Table 2 Serum Sema3A, BMD, and bone metabolic indicators in T2DM

2.3 2型糖尿病患者血清Sema3A水平與各參數(shù)間的相關(guān)性

2型糖尿病患者血清Sema3A水平與腰椎骨密度、全髖骨密度、股骨頸骨密度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.310、0.239、0.203，P值分別為<0.001、0.006、0.021。血清Sema3A水平與OC呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為-0.177，P值為0.045。Sema3A與PINP、β-CTX、BALP、PTH呈負(fù)相關(guān)，與25(OH)D呈正相關(guān)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 2型糖尿病患者血清Sema3A水平與各參數(shù)間的相關(guān)性Table 3 The association between serum Sema3A level and other variables

2.4 2型糖尿病患者血清Sema3A與骨密度、骨代謝指標(biāo)的多元回歸分析

多元回歸分析結(jié)果顯示，校正可能的混雜因素年齡、糖尿病病程、BMI、HbA1c后，血清Sema3A與腰椎骨密度、全髖骨密度、股骨頸骨密度均呈正相關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步校正性別后，血清Sema3A水平與腰椎骨密度仍呈正相關(guān)(B=0.002，P=0.035)；與全髖骨密度、股骨頸骨密度呈正相關(guān)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在校正年齡、糖尿病病程、BMI、HbA1c后Sema3A與PINP呈負(fù)相關(guān)(B=-0.340，P=0.048)；與OC、β-CTX呈負(fù)相關(guān)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 2型糖尿病患者血清Sema3A與骨密度、骨代謝指標(biāo)的多元回歸分析Table 4 Multiple regression analysis between Sema3A and BMD and bone metabolic indicators in T2DM patients

3 討論

骨質(zhì)疏松癥多見于絕經(jīng)后女性及老年男性，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病患者中，絕經(jīng)后女性比男性更容易患骨質(zhì)疏松，與以往的研究結(jié)果一致。這與絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平降低后對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，導(dǎo)致其骨吸收功能增強(qiáng)有關(guān)[7]。在2型糖尿病患者中，骨質(zhì)疏松組年齡大于非骨質(zhì)疏松組，表明了骨質(zhì)疏松癥是一種與增齡相關(guān)的代謝性疾病[8]。首先，增齡可以導(dǎo)致骨重建失衡，骨吸收與骨形成的比值升高，從而導(dǎo)致進(jìn)行性的骨量丟失；其次，增齡可以使免疫系統(tǒng)呈低度活化狀態(tài)，白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性反應(yīng)介質(zhì)可以刺激核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)表達(dá)，從而刺激破骨細(xì)胞，抑制成骨細(xì)胞，造成骨量的減少。有研究[9-10]表明肥胖可能會(huì)導(dǎo)致骨密度增加，與骨密度呈正相關(guān)，與骨質(zhì)疏松呈負(fù)相關(guān)。BMI下降或低BMI是老年女性和男性骨折發(fā)生率較高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松組患者BMI更低，這可能與體內(nèi)較低的17β-雌二醇水平和較低的機(jī)械負(fù)荷有關(guān)。

Sema3A是脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)信號(hào)素。它最初被認(rèn)為是一種可擴(kuò)散的軸突導(dǎo)向分子，誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)和發(fā)育。然而，研究發(fā)現(xiàn)Sema3A在骨重建中也發(fā)揮著重要作用。Sema3A基因敲除小鼠的原代成骨細(xì)胞存在分化缺陷，成骨細(xì)胞標(biāo)志物Runx2和Bglap2表達(dá)降低[12]，而骨保護(hù)素(OPG)缺陷的小鼠顱骨細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Sema3A能抑制破骨細(xì)胞的成熟。在一項(xiàng)基于Sema3A基因治療的骨靶向給藥系統(tǒng)的研究[13]顯示，經(jīng)過Sema3A治療的小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，骨密度、骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁厚度(TB.Th)均顯著高于對(duì)照組。靜脈注射Sema3A可加速鉆孔損傷所致皮質(zhì)骨缺損小鼠模型的骨再生，去卵巢(ovariectomized，OVX)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠模型也顯示Sema3A可以減少卵巢切除后所致的骨量丟失[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病患者中，骨質(zhì)疏松組患者血清Sema3A水平明顯低于非骨質(zhì)疏松組，Sema3A與各部位骨密度呈正相關(guān)。其可能的機(jī)制有如下幾個(gè)方面：一方面Sema3A與從狀蛋白-A1(plexin-A1)和Nrp1受體復(fù)合物結(jié)合后影響免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)信號(hào)通路和RhoA激活，從而抑制破骨細(xì)胞分化和破骨前體細(xì)胞遷移；另一方面Sema3A和Nrp1的結(jié)合還可以增加Rac1的表達(dá)，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，增加成骨細(xì)胞分化、增殖[12]。而高糖可以降低Sema3A及受體Nrp1的表達(dá)，顯著抑制成骨分化。Ma等[14]研究也表明糖尿病可能通過調(diào)節(jié)Sema3A/IGF-1/β-catenin信號(hào)通路來干擾骨代謝?；诖?，調(diào)節(jié)血清Sema3A水平可能成為骨質(zhì)疏松治療的新靶點(diǎn)，特別是為糖尿病合并骨質(zhì)疏松患者的治療提供新思路。

既往有研究[15]表明在人體中血清Sema3A水平隨年齡的增長(zhǎng)或絕經(jīng)而降低。而本研究顯示年齡與Sema3A無明顯相關(guān)性，分析可能與本研究選取的研究對(duì)象年齡較大，不能代表一般人群Sema3A水平有關(guān)。OC是一種由成骨細(xì)胞分化后期分泌的非膠原性、依賴維生素K的蛋白質(zhì)，其不僅能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的活性，還是骨礦化速率的調(diào)節(jié)因子。本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松組OC、PINP、β-CTX水平更高，血清Sema3A水平與OC、PINP、β-CTX呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，這可能與骨質(zhì)疏松患者骨轉(zhuǎn)換增加，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)有關(guān)。

本研究也存在一定局限性。首先，因?yàn)檠芯康臉颖玖坑邢?，未能?duì)研究對(duì)象進(jìn)行更詳細(xì)的分層分析，若后續(xù)研究中能夠繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，可按照T值進(jìn)行更詳細(xì)的分組。其次，由于研究對(duì)象為2型糖尿病病人，糖尿病病程相對(duì)較長(zhǎng)，雖然已調(diào)整了一些混雜因素，但可能存在部分混雜因素如血糖等仍未被調(diào)整。

本研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松患者血清Sema3A水平明顯降低，校正骨質(zhì)疏松的可能影響因素后血清Sema3A水平與腰椎骨密度仍呈正相關(guān)，與PINP、OC、β-CTX等骨代謝指標(biāo)有一定相關(guān)性。未來Sema3A可能成為篩選抗骨質(zhì)疏松藥物的新的靶點(diǎn)。