王斌 麥彩園 曹燕明 胡暉 黃春梅 林燁澎 鄧杏容 徐茂森 董俊球*

1.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山528100

2.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州510010

3.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州510260

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是常見的代謝性骨疾病，臨床特征以骨量及質量、骨強度下降為主[1]。我國骨質疏松癥患者數(shù)量超過了7 000萬，50歲以上女性患病率為20.7 %[2]。由于絕經后雌激素減少導致內分泌紊亂，進而影響鈣質吸收利用，導致鈣質流失出現(xiàn)骨量減少、骨骼破壞，以及腰背部疼痛癥狀，OP在絕經后婦女的發(fā)病率為未絕經女性的2～3倍[3]。OP的發(fā)病率逐年升高，骨質疏松不僅影響患者生活質量，也是重大的健康-經濟-社會問題[4]。

破骨細胞(osteoclast，OC)和成骨細胞(osteoblast，OB)使骨骼處于重塑狀態(tài)并維持正常的結構與功能[5]，它們維持的平衡被打破時，骨構建功能會異常，骨質疏松或骨代謝疾病等將發(fā)生[6]。MicroRNA (miRNA)是一種非編碼蛋白單鏈小分子RNA，已經在腫瘤、骨代謝等多個領域被廣泛研究[7]。miRNA主要通過與靶基因的3′端非編碼區(qū)結合，對靶因子產生負性調控作用，導致其降解或停止翻譯，從而影響細胞的增殖、遷移、凋亡[8]。近年來，miRNA在BMSCs及成骨與破骨中的生物作用越來越受到廣泛的關注。miRNA是可以調控BMSCs向OB分化的，其對骨質疏松等相關疾病的治療有重要價值[9]。miR-124-3p可通過抑制糖尿病性骨質疏松大鼠的GSK-3β/β-catenin信號傳導途徑促進BMSC成骨[10]。有研究[11]認為miR-124-3p通過靶向作用抑制Axin1促進乳腺癌生長。也有報道[12]Axin1作為OP的靶點，Axin1的缺失導致OPG增加和OC形成減少。

Wnt通路中，游離的β-catenin與GSK-3β結合后磷酸化，隨后降解，如果Wnt信號被激活，Wnt與LRP5/6、FZD相互結合形成復合體，招集Dvl和降解復合物(由Axin、APC、GSK-3β等組成)，抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化。未磷酸化的β-catenin逐漸積累，進入到細胞核和TCF/LEF轉錄因子相結合，進而激活下游靶基因并轉錄表達[13]。軸抑制蛋白(Axin)是一種抑癌基因，在胚胎發(fā)育過程中控制體軸的形成，在許多重要的信號途徑中扮演著重要的角色[14]。

Wnt通路中的Axin1是否可以作為miR-124-3p的靶點對BMSCs調節(jié)及機制還不清楚。本研究將探討miR-124-3p對BMSCs調節(jié)的分子機制。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1儀器：紫外分光光度計、實時PCR檢測系統(tǒng)、流式細胞儀、電泳儀及轉膜儀：Bio-Rad公司，美國。熒光素酶報告檢測系統(tǒng)：Progmega公司，美國。

1.1.2試劑：RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、引物：Takara公司，中國。BCA蛋白定量試劑盒：鐸洋生物有限公司，中國。Western-Blotting一、二抗體：Abcam公司，美國。ALP試劑盒、茜素紅染色試劑盒、載體：Bio-Rad公司，美國。DMEM高糖培養(yǎng)基、成骨分化培養(yǎng)液：Sigma公司，美國。胎牛血清、p-MiR report質粒、脂質體Lipofectamine 2000、293 T細胞：Invitrogen公司，美國。質粒抽提試劑盒：QIAGEN公司，德國。MiRNA模擬物及對照物及抑制物、RNAiMAX、Trizol試劑：吉瑪制藥公司，中國。

1.2 研究對象

1.2.1病例信息：研究方案按照1964年赫爾辛斯基宣言有關規(guī)定，經由佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院的臨床試驗倫理委員會審查通過，患者知情同意并簽署知情同意書。本研究選擇2020年1月至2020年12月在人民醫(yī)院招募的絕經后婦女(股骨骨折，需手術并擴髓或暴露髓腔)20例，分為對照組10例和PMOP組10例?；颊邆盎顒幽芰Α⑼耆袷滦袨槟芰φ?，無精神及認知障礙。入院后登記姓名、年齡、身高、體重等各項資料，所有受試者檢測：腰椎骨密度均值及T值；骨轉換標志物β-CTX、PINP、N-MID-OT、25(OH)D; 雌二醇。

1.2.2納入及排除標準：PMOP組入組標準：滿足前述條件；雙能X線骨密度儀測骨密度T值≤-2.5，診斷為PMOP，可參照《絕經后骨質疏松的影像學表現(xiàn)及診斷標準》[15]；對照組入組標準：滿足前述條件；雙能X線骨密度儀測骨密度T值≥-1.0；排除標準：伴有嚴重慢性疾?。灰鹄^發(fā)性PMOP的內分泌性等代謝異常的疾?。?年內因為OP接受相關藥物或者激素治療。

1.2.3骨標本收集患者在傷后3～7 d內根據(jù)骨折類型分別行髖關節(jié)置換術(6例)、有限切開骨折復位髓內釘內固定術(11例)、切開復位鋼板內固定術(3例)。術中擴髓及髓腔刮出骨髓組織 5 mL，置于枸櫞酸鋰抗凝管中。

1.3 研究方法

1.3.1BMSCs細胞培養(yǎng)：術中從髓腔抽取骨髓5 mL，置于枸櫞酸鋰抗凝管中。建立BMSCs的體外培養(yǎng)體系及成骨分化：將骨髓與等體積的含l %雙抗的DMEM培養(yǎng)液均勻混合。室溫離心分離，去除上清。DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，并將細胞懸液緩慢注入等體積Percoll分離液，室溫離心，吸取中間的單個核細胞層，加入完全培養(yǎng)基，充分吹打混勻后可獲得含有BMSCs細胞的懸液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每24 h換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、大小及分布。胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基調節(jié)細胞濃度至2×105個/mL并接種于細胞培養(yǎng)板內培養(yǎng)。待細胞融合度達到70%～80 %后，胰酶消化傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期第3代BMSCs，加入成骨誘導液(含胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉) 誘導2周，收取細胞并提取RNA，進行RT-qPCR。

1.3.2BMSCs鑒定：將分離培養(yǎng)的細胞于室溫下離心并懸于PBS液中，分裝于1.5 mL EP 管中(約1×106個細胞/管)，再離心后棄PBS液，保留50 μL PBS剩余減少以細胞丟失，于每管細胞樣品中加用FITC標記的CD34、CD45、CD73、CD90、CD105以及單克隆抗體各10 μL，同時予以設立空白對照組，避光4 ℃環(huán)境下孵育30 min，應用適量PBS液輕柔清洗細胞兩次以去除未標記抗體，用500 μL PBS液輕柔吹打重懸細胞后，流式細胞儀進行檢測。

1.3.3RT-qPCR：取樣品，移至1 mL RNAiso Plus液的EP管，混勻，加入氯仿0.2 mL，混勻，離心。上層水相移至離心管，加異丙醇，離心。移去上清液，加入乙醇?；靹?，離心棄去上清，加無RNA酶水40 μL，讀取OD值。參照反轉錄試劑盒反轉錄將RNA合成cDNA。用Primer Premier5.0軟件設計、Takara公司合成的引物(引物序列5’to3’：miR-124-3p-F ACACTCCAGCTGGG, miR-124-3p-R CTCAACTGG TGTCGTGGA; Runx2-F CTCCTACCTGAGCCAGAT GACG, Runx2-R GTGTAAGTAAAGGTGGCTG GATAGT; Osterix-F CCAAGTGGGTGGTATAGAG, Osterix-R GGGATGGTGGGTGTAAGA; Axin1-F GGTTTCCCCTTGGACCTCG, Axin1-R CCGTCGA AGTCTCACCTTTAATG; GAPDH-F GGCATGG ACTGTGGTCATGAG, GAPDH-R TGCACCACCA ACTGCTTAGC; U6-F GGTGGTGGAGAACTCTTCA，U6-R GAGCAGCGTCTTCAGGAGCA)。反應體系：TaqMan?Fast Advanced Master Mix(2×)10 μL, TaqMan?Advanced miRNA Assay(20×)1 μL, cDNA反應液(1∶10 dilution)5 μL，Nuelease-free water 4 μL。按以下條件擴增：95 ℃預變性20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。選擇U6做內參基因，其他因子的內參為GAPDH。使用qPCR儀自帶Rotor-Gene Q Software進行計算所有樣品的Ct值，用2-ΔΔCT表示PMOP組因子相比對照組因子表達變化的相對表達量。

1.3.4Western Blotting(WB)：收集的PMOP組細胞用裂解液進行裂解，細胞冰上裂解30 min，離心，吸取上清液，依BCA蛋白標準液的方法配制工作液，在96孔板內上樣，檢測吸光度，再繪制標準曲線，計算出樣品蛋白的濃度。蛋白加上樣緩沖液(5×)，98 ℃加熱10 min，然后根據(jù)濃度于各孔加入上樣量及蛋白Marker。電泳60 V 30 min；105 V 1.5 h；轉膜105V 1.5 h；脫脂奶粉孵育。將封閉后的NC膜置于脫色搖床上一抗4 ℃過夜14 h，取出膜洗滌，二抗于室溫孵育1 h，洗滌膜，暗房顯色劑顯色。β-action為內參蛋白。軟件Image J定量對比灰度值，算出各個蛋白相對表達值即為該蛋白表達水平。

1.3.5堿性磷酸酶(ALP)染色：根據(jù)ALP制造商的程序說明，測試ALP的活性。收集PMOP組BMSCs并用預冷的裂解緩沖液裂解。2 500g離心15 min收集上清液，然后用對硝基苯磷酸酯(PNPP)進行孵育。最后使用酶標儀在570 nm下測試OD值。

1.3.6茜素紅染色：將PMOP組細胞用PBS洗滌3次并4 %多聚甲醛固定(15 min)，然后用0.2 %茜素紅溶液染色30 min。用蒸餾水洗3遍后對染色的細胞照相。茜素紅染色陽性檢測細胞鈣沉積，用來反應成骨細胞的鈣化。

1.3.7細胞轉染：購買上?；蛑扑幱邢薰镜膍iR-124-3p模擬物(mimics)(5’-UAAGGCACG CGGUGAAUGCC-3′) 和相應的陰性對照(NC group)(NC, 5’-GAUGCACGGACGUGCGAAU-3′)、miR-124-3p 抑制物(inhibitor)和對照NC。細胞密度5×105鋪于6孔板中，等細胞融合度達到90%后，吸出培養(yǎng)液并用PBS緩沖液沖洗2遍，更換為Opti-MEM培養(yǎng)液，每孔3 mL，并用Opti-MEM培養(yǎng)液將質粒分別稀釋至20 μmol/L，同時用轉染試劑稀釋，取對應分組的RNA加入到轉染試劑中，孵育20 min后加入到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后換普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行表達量驗證。miR-124-3p過表達48 h后更換成骨誘導培養(yǎng)基進行成骨誘導培養(yǎng)。在誘導的7、14、21 天分別收集各組細胞進行檢測ALP和茜素紅染色。共分為BMSC組、BMSC+成骨分化液組、BMSC+過表達miR-124-3p對照組(NC)、BMSC+過表達miR-124-3p組(mimics)。成骨誘導第7 天 用RT-qPCR、Western Blotting檢測各組BMSCs成骨特異性基因Runx2和Osterix的表達及靶因子A的表達。

1.3.8雙重熒光素酶報告基因檢測：利用http://www.targetscan.org/vert_71/網(wǎng)站預測，miR-124-3p可能結合的Wnt通路靶位點因子A-Axin1。為了驗證結合位點，我們進行熒光素酶結合試驗，將包含預測的miR-124-3p結合位點的Axin1 3′-UTR克隆到pMIR-REPORTTM miRNA Expression Reporter載體中，并將所得質粒命名為pMIR-Axin1-WT(野生型)。使用定點誘變試劑盒，通過突變結合位點(GUGCCUU)區(qū)域創(chuàng)建了一個突變的Axin1報告基因，并將其命名為pMIR-Axin1-MT(突變型)。為了進行轉染，將細胞接種到24孔板中，并使用Lipofectamine 2000將100 ng pMIR-Axin1-WT或者pMIR-Axin1-MT熒光報告載體和50ng miR-124-3p mimics共轉染到293 T細胞中。48 h后，根據(jù)說明用熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega)測量熒光素酶活性。

以上所有樣本實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 患者一般資料、骨轉換標志物

患者一般資料見表1，骨轉換標志物等見表2。

表1 對照組和PMOP組內一般資料比較Table 1 Comparison of general data between control group and PMOP

表2 對照組和PMOP組骨轉換標志物的比較Table 2 Comparison of bone turn over markers between control group and PMOP

2.2 BMSCs培養(yǎng)及鑒定

流式細胞術分析BMSCs(圖1)，CD73、CD90和CD105的表達為陽性，而 CD34 和 CD45 的表達呈陰性。符合間充質干細胞的抗原特點，證實為BMSCs。

2.3 RT-qPCR法檢測miR-124-3p在對照組與PMOP組的BMSCs中表達

miR-124-3p在BMSCs中的相對表達值，對照組為3.66±0.04，PMOP組為1.24±0.05(P< 0.05)。

2.4 RT-qPCR驗證miR-124-3p過表達

將模擬物過表達轉染48 h的細胞收集并提取RNA，后進行RT-qPCR實驗，結果顯示模擬物過表達轉染后細胞miR-124-3p表達水平顯著升高，相對表達值由2.54±0.87升高至6.98±1.65(P<0.05)。

2.5 過表達miR-124-3p后成骨能力

同時將各組傳代細胞進行miR-124-3p過表達轉染。48 h后，將培養(yǎng)液更換為成骨誘導液培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第7、14、21天，進行ALP和茜素紅染色實驗。結果顯示過表達miR-124-3p后隨著誘導時間的延長，細胞培養(yǎng)液中ALP水平逐漸升高，茜素紅染色可見結節(jié)沉積逐增加(圖2、3)。

在培養(yǎng)第7天收集細胞并提取RNA，RT-qPCR顯示各組BMSCs成骨特異性基因Runx2和Osterix的表達，BMSC+成骨分化液組明顯高于BMSC組，BMSC+過表達miR-124-3p組較對照組明顯升高；特異性靶因子Axin1的表達：BMSC+成骨分化液組明顯低于BMSC組，BMSC+過表達miR-124-3p組較對照組明顯降低(圖4)。

2.6 miR-124-3p與A-Axin1結合位點驗證

使用數(shù)據(jù)庫驗證miR-124-3p與Axin1的潛在結合靶點，其結合位點如圖5所示。而熒光素酶報告基因結果顯示miR-124-3p可顯著抑制野生型pMIR-Axin1-WT(野生型)的螢光素酶活性，而不影響突變型熒光報告基因活性(圖6)。對293 T細胞進行了WB檢測，結果顯示miR-124-3p過表達組Axin1表達顯著下降(P<0.05)，而miR-124-3p抑制組表達顯著升高(P<0.05)，Axin1表達與miR-124-3p表達水平呈負相關，見圖7。

3 討論

絕經后骨質疏松(PMOP)是由于女性絕經后體內雌激素水平迅速下降，破骨細胞增加導致的骨吸收大大增加，導致骨吸收大于骨形成引起的代謝性疾病[15]。BMSCs醫(yī)學上也被成為“多能細胞”，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞等，研究表明在老齡OP狀態(tài)時，BMSCs成骨分化紊亂，成骨分化能力下降[16]。BMSCs在成骨活性的研究對骨缺損、成骨減少和障礙類疾病具有重要指導意義[17]。miRNA作為一種具有調控功能的非編碼單鏈RNA，大量存在于BMSCs內，影響成骨、破骨細胞的增殖、遷移和分化等多種生物學功能過程[9-10]。近年來，miRNA對BMSCs分化及對破骨細胞、成骨細胞分化的影響已成為熱點問題, miR-124-3p在PMOP調控成骨和破骨中發(fā)揮一定的作用[10]。

Qadir等[18]發(fā)現(xiàn)在人BMSCs的分化過程中miR-124-3p的表達改變可能影響了BMSCs的生物學功能。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)對mrl/lpr BMSCs的凋亡小體進行處理后，miR-124-3p表達增加。RANKL降低破骨細胞形成過程中miR-124的表達，miR-124降低破骨細胞前體的增殖和活力[20]。有實驗[10]證實miR-124-3p可以促進成骨分化，并且通過抑制GSK-3β調控絕經后骨質疏松癥大鼠BMSC成骨的發(fā)生。

另一方面，已有研究[10,21-22]顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路與BMSCs成骨分化相關，研究及數(shù)據(jù)庫表明miR-124-3p可能參與Wnt信號通路，其作用靶點包括Frizzled、LRP5/6、GSK-3β、Axin1等。Shu等[12]研究OB前體細胞中Axin1的缺失導致OPG增加和破骨細胞形成減少。張磊等[23]已經研究證實了包括 Axin在內的多個信號分子均可能參與BMSCs的成骨分化，沉默或過表達個別基因的表達可以促進BMSCs的成骨分化，對骨組織工程學研究及其相關疾病的治療具有重要意義。在本研究中，通過RT-qPCR方法分析檢測miR-124-3p在BMSCs誘導分化為成骨細胞的表達，結果顯示過表達miR-124-3p后BMSCs成骨分化能力明顯增強；miR-124-3p在PMOP組降低；模擬物過表達轉染后細胞miR-124-3p表達水平也顯著升高，說明miR-124-3p可能參與PMOP的形成過程。

通過miRNA靶基因預測網(wǎng)站，根據(jù)miRNA的序列信息預測靶基因A-Axin1與miR-124-3p的潛在結合位點。合成了靶基因Axin1野生型和突變型的結合序列。導入miR-124-3p的模擬物與Axin1野生型熒光素酶的mRNA3’-UTR插入的目的序列能夠結合，pMIR- Axin1-WT+ miR-124-3p模擬物組的熒光強度顯著降低，說明Axin1是miR-124-3p的靶基因。而在成骨誘導第7天，Runx2和Osterix的表達：BMSC+成骨分化液組明顯高于BMSC組，BMSC+過表達miR-124-3p組較對照組明顯升高；Axin1的表達：BMSC+成骨分化液組明顯低于BMSC組，BMSC+過表達miR-124-3p組較對照組顯降低。推論Axin1可能是miR-124-3p的潛在結合靶點。進一步在293 T細胞中進行了WB檢測，WB結果顯示miR-124-3p過表達組Axin1表達顯著下降，而miR-124-3p抑制組Axin1表達顯著升高，因此，Axin1表達與miR-124-3p表達水平呈負相關。從而為miR-124-3p通過調控Axin1從而影響B(tài)MSCs的成骨分化提供了證據(jù)。

本實驗也存在一些不足，沒有進一步驗證在過表達靶基因Axin1后，驗證miR-124-3p對骨細胞功能的調節(jié)作用。綜上所述，本研究證實miR-124-3p可通過Wnt通路靶點Axin1調節(jié)BMSCs的成骨分化進而參與PMOP的形成過程。本研究可為PMOP患者診治及研究提供相關依據(jù)。