趙 卓，籍昊天，，肖業(yè)臣

(1.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone morphogenetic protein 4，BMP4)是骨形成蛋白家族的一員，隸屬于TGF-β超家族，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化和成人組織穩(wěn)態(tài)等方面起重要的調(diào)控作用[1].Kl?sch等[2-3]將鼠源BMP4在重組大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，但表達(dá)系統(tǒng)不能對(duì)外源蛋白進(jìn)行修飾，會(huì)形成不溶解、無(wú)活性的包涵體，并存在后期蛋白復(fù)性實(shí)驗(yàn)煩瑣、復(fù)性率較低等問(wèn)題；Cha等[4-5]將人源BMP4在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果證明哺乳動(dòng)物活細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在大量生產(chǎn)蛋白時(shí)成本較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn).在BMP4蛋白純化方面，普遍選擇使用親和層析技術(shù)，如免疫親和層析、染料-配體親和層析、固定化金屬離子親和層析等[6]，但親和層析技術(shù)雖然操作方便，卻同樣存在成本較高、不宜大規(guī)模生產(chǎn)等問(wèn)題.因此，優(yōu)化BMP4表達(dá)方法、提高利用效率、降低純化成本，對(duì)后續(xù)研發(fā)和生產(chǎn)至關(guān)重要.

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前較為常見(jiàn)的表達(dá)系統(tǒng)之一，其優(yōu)點(diǎn)在于表達(dá)高效、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低，可根據(jù)需要選擇胞內(nèi)或胞外分泌路徑.其中，胞外分泌表達(dá)純化工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)[7].離子交換層析方法可以根據(jù)電荷性質(zhì)差異分離電離分子，具有處理能力強(qiáng)、適用廣泛、成本適中等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還有易于放大和自動(dòng)化處理等特性，在大批量生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用.本文通過(guò)設(shè)計(jì)合成BMP4-Fc目的基因序列，利用巴斯德畢赤酵母作為BMP4表達(dá)系統(tǒng)，采用離子交換層析法分離、純化目的蛋白，通過(guò)BMP4形成二聚體時(shí)具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的特性，驗(yàn)證了BMP4-Fc融合蛋白的活性.

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需材料、試劑分別為：限制性內(nèi)切酶Xho I、Xba I、Sac I和限制性內(nèi)切酶緩沖液(美國(guó)NEB公司)；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物(英國(guó)OXOID公司)；DNA電泳標(biāo)準(zhǔn)品(Marker)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)標(biāo)準(zhǔn)品(Marker)和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(中國(guó)全式金公司)；博來(lái)霉素(美國(guó)Invitrogen公司)；質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒、切膠回收試劑盒(中國(guó)康為公司)；載體pPICZα(中國(guó)南京中鼎生物公司)，X33畢赤酵母(中國(guó)華越洋生物公司)；BMP4單克隆抗體、Fc單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(中國(guó)Bioss公司)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)(美國(guó)Millipore公司)；PCR mix酶和BMP4蛋白(中國(guó)聚合美公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting Kit-8，CCK-8)(美國(guó)MedChem Express公司).聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)引物設(shè)計(jì)合成由中國(guó)生工公司完成.

1.2 載體構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索，獲得BMP4的氨基酸序列(登錄號(hào)：NP 001193.2)，設(shè)計(jì)合成蛋白基因序列(由南京鐘鼎公司完成).合成基因全長(zhǎng)1 169 bp，在5′端插入Xho I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在3′端插入Xba I和Sac I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(由南京鐘鼎公司完成)，并保存于大腸桿菌中.

1.2.2 構(gòu)建BMP4-Fc表達(dá)載體

取10 μL大腸桿菌培養(yǎng)液，加至150 mL含博來(lái)霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng).當(dāng)D(600)=0.6～0.8時(shí)，用質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，用Xho I、Xba I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，并將質(zhì)粒送到上海生工公司進(jìn)行測(cè)序和驗(yàn)證.確認(rèn)重組質(zhì)粒準(zhǔn)確無(wú)誤后，用Sac I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切，線性化質(zhì)粒經(jīng)DNA凝膠電泳、切膠回收試劑盒回收，-20 ℃保存.

1.2.3 制備重組質(zhì)粒X33畢赤酵母

將X33畢赤酵母制備成感受態(tài)酵母細(xì)胞后與線性化重組質(zhì)?；旌?，將混合液加入電轉(zhuǎn)杯，在BTXecm830型方波電穿孔儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化.轉(zhuǎn)化后的酵母菌在28 ℃的培養(yǎng)箱中靜置2 h后，取部分菌液涂布在含有100 μg/mL博來(lái)霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板培養(yǎng)基中，倒置培養(yǎng)24～48 h.

1.2.4 鑒定克隆載體

挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落接種于含有博來(lái)霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)至底部出現(xiàn)菌種沉淀，吸取100 μL菌液進(jìn)行PCR.將菌液懸浮充分混勻后取500 μL加入到50 mL含甘油的緩沖性完全培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng).D(600)=2～6時(shí)，將酵母菌轉(zhuǎn)移至含甲醇的緩沖性復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng).每24 h補(bǔ)充1%甲醇誘導(dǎo)分泌蛋白.96 h后收取上清液進(jìn)行蛋白印跡 (Western-blot)測(cè)定，觀察目標(biāo)蛋白位置及分泌量，選擇分泌較好的酵母菌菌種保存.

1.2.5 優(yōu)化重組菌種誘導(dǎo)條件

取重組菌種進(jìn)行培養(yǎng)，分別設(shè)置0，1%，2%，3%，4%，5%的甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，取不同組上清液進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot測(cè)定，使用Fc和BMP4抗體檢測(cè)重組蛋白表達(dá)量.

1.3 分析重組蛋白活性

1.3.1 重組蛋白純化

取上清液用超濾管濃縮提純，將濃縮蛋白進(jìn)行陰離子交換層析，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液沖洗.用20 mmol/L Tris-HCl和不同濃度NaCl混合液分3次洗脫.每次洗脫過(guò)程中，NaCl濃度依次設(shè)置為100，50，10 mmol/L.

1.3.2 重組蛋白活性測(cè)定

復(fù)蘇間充質(zhì)干細(xì)胞，將培養(yǎng)細(xì)胞接種到96孔板中，每孔接種1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞.將磷酸緩沖鹽溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品、純化重組蛋白樣品分別加入到培養(yǎng)孔中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h；向樣品孔中加入10 μL CCK-8試劑，輕微震蕩混勻，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品D(450)值.

1.4 結(jié)果分析

使用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANNOVA分析，顯著性水平P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒單雙酶切鑒定

通過(guò)Sac I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切，將質(zhì)粒線性化，結(jié)果見(jiàn)圖1.通過(guò)Xho I、Xba I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，得到的目的片段結(jié)果見(jiàn)圖2，單酶切和雙酶切結(jié)果顯示，目的基因己插入，目的質(zhì)粒構(gòu)建成功.

1重組質(zhì)粒，2重組質(zhì)粒BMP4-Fc

1重組質(zhì)粒，2重組質(zhì)粒BMP4-Fc

2.2 重組質(zhì)粒X33畢赤酵母鑒定與篩選

將目的質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組X33畢赤酵母表達(dá)載體，酵母菌菌落PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示2，3，4號(hào)菌種有PCR產(chǎn)物，證明目的基因已導(dǎo)入到酵母菌中.SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量為45 000 處，1—4號(hào)菌種均有蛋白分泌.

1—4菌種編號(hào)，5其他質(zhì)粒，6雙蒸水

1菌種1培養(yǎng)0 h，2菌種1培養(yǎng)48 h，3菌種2培養(yǎng)0 h，4菌種2培養(yǎng)48 h，5菌種3培養(yǎng)0 h，6菌種3培養(yǎng)48 h，7菌種4培養(yǎng)0 h，8 菌種4培養(yǎng)48 h

2.3 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)同一菌種進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果(見(jiàn)圖5)表明，1%，2%和3%的甲醇誘導(dǎo)，在相對(duì)分子質(zhì)量為45 000 處均有蛋白條帶.用Fc抗體和BMP4抗體進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果(見(jiàn)圖6、圖7)發(fā)現(xiàn)，1%甲醇誘導(dǎo)的酵母菌分泌的目的蛋白較多.將同一菌種用1%甲醇連續(xù)誘導(dǎo)96 h，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖8)表明，誘導(dǎo)72和96 h的酵母菌分泌的蛋白結(jié)果相同，說(shuō)明甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)蛋白最優(yōu)時(shí)間為72 h.

1—6：0，1%，2%，3%，4%，5%甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)上清液

1—6：0，1%，2%，3%，4%，5%甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)上清液

1—6：0，1%，2%，3%，4%，5%甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)上清液

1—5：培養(yǎng)0，24，48，72，96 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)上清液

2.4 重組蛋白純化

重組蛋白陰離子交換層析：將蛋白原液加入陰離子柱，用20 mmol/L Tris-HCl和不同濃度梯度的NaCl混合液進(jìn)行洗脫.當(dāng)NaCl濃度為100 mmol/L時(shí)，洗脫結(jié)果見(jiàn)圖9，目的蛋白被300 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫；當(dāng)NaCl濃度為50 mmol/L時(shí)，洗脫結(jié)果見(jiàn)圖10，目的蛋白被250 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫；當(dāng)NaCl濃度為10 mmol/L時(shí)，洗脫結(jié)果見(jiàn)圖11，目的蛋白被230 mmol/L NaCl和 20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫，說(shuō)明該濃度洗脫液可得到較高純度目的蛋白.

1：蛋白原液；2：流穿液；3：20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；4：100 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；5：200 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；6：300 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；7：400 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；8：1 000 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰

1：經(jīng)過(guò)30 000超濾管濃縮的蛋白原液；2：20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；3：200 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；4：250 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；5：300 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；6：1 000 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰

1：蛋白原液；2：200 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；3：220mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；4：230mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；5：300 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；6：1 000 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰

2.5 重組蛋白活性測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

分別用磷酸緩沖鹽溶液、商品化BMP4與純化后的BMP4-Fc，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行刺激，培養(yǎng)48 h后加入10 μL細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑CCK-8培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)D(450)值，結(jié)果見(jiàn)圖12.分析結(jié)果顯示，商品化BMP4組D(450)比PBS組顯著增高，BMP4-Fc組D(450)比PBS組顯著增高，商品化BMP4組D(450)略高于BMP4-Fc組但差異不顯著，說(shuō)明BMP4-Fc對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的刺激程度較低，接近商品化BMP4對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的刺激水平.

*P<0.05

3 討論

蛋白類藥物通過(guò)血液進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)時(shí)，由于半衰期比較短通常需要對(duì)患者加大給藥劑量，因而會(huì)產(chǎn)生副作用.BMP4作為骨形成蛋白家族的一員，對(duì)其生理活性的研究與功能開(kāi)發(fā)利用一直受到眾多學(xué)者的重視.近年來(lái)對(duì)IgG-Fc標(biāo)簽的研究越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)Fc標(biāo)簽可以促進(jìn)蛋白形成穩(wěn)定二聚體，可延長(zhǎng)在血液中的半衰期，降低蛋白免疫原性，從而減少患者給藥量、減輕對(duì)患者的毒副作用.本文依據(jù)BMP4可通過(guò)形成二聚體發(fā)揮其生理作用的特點(diǎn)，在BMP4基因組中加入了IgG-Fc標(biāo)簽.研究結(jié)果顯示，當(dāng)BMP4與IgG-Fc融合后會(huì)促使BMP4-Fc融合蛋白形成不易降解的穩(wěn)定二聚體；同時(shí)，BMP4-Fc融合蛋白對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用，說(shuō)明在BMP4中加入IgG-Fc形成二聚體后可以更好地發(fā)揮生理活性.

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可對(duì)目的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，具有高效分泌表達(dá)的真核表達(dá)系統(tǒng).有研究報(bào)道，整合到畢赤酵母基因組內(nèi)目的基因的拷貝數(shù)量決定畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌的蛋白量，但本文進(jìn)行的PCR目的基因擴(kuò)增和初步誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這種情況并不相符，表明不同蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量存在差異.為此，本文進(jìn)一步純化了重組蛋白、優(yōu)化了DEAE離子交換層析條件，發(fā)現(xiàn)在230 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫條件下，可以除去大部分雜蛋白，得到純度較高、生理活性好、接近商業(yè)化純品水平的目的蛋白，為BMP4的進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)和利用提供了參考依據(jù).