于海玲，張曉巖，李曉宇，蔡萬(wàn)美，高 強(qiáng)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

土壤微生物功能多樣性是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)之一[1]，利用群落水平生理指紋圖譜(Biolog生態(tài)微板)可以測(cè)量土壤微生物群落的功能多樣性，為土壤微生物的各種功能提供全面的信息.Biolog板最初被設(shè)計(jì)用于鑒定細(xì)菌分離物，后來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)這些平板在微生物群落研究中很有用，也被廣泛用于描述各種環(huán)境中的細(xì)菌群落[2].Biolog數(shù)據(jù)非常適合多變量統(tǒng)計(jì)分析，如主成分分析和聚類分析，這些工具可以區(qū)分不同環(huán)境中的微生物群落，也可用于評(píng)價(jià)農(nóng)作物連作障礙對(duì)土壤質(zhì)量的影響[3].相關(guān)研究表明，在盆栽試驗(yàn)中，玉米和花生根際互作促進(jìn)了根際土壤微生物不同碳源的代謝多樣性，提高了玉米根際微生物對(duì)多聚物和糖類的代謝水平[4]，該結(jié)果與間作條件下土壤微生物量的提高和群落結(jié)構(gòu)改變緊密相關(guān)[5].也有研究表明，與單作相比，間作體系中玉米、花生根際土壤微生物AWCD值及多樣性指數(shù)與土壤速效養(yǎng)分指標(biāo)顯著相關(guān)，而糖類、羧酸類和氨基酸類是區(qū)分盆栽間作體系中土壤微生物群落功能多樣性的主要碳源類型[6].Ge L等[7]研究表明，與有機(jī)肥處理相比，無(wú)機(jī)肥施入增強(qiáng)了多聚物、酚酸類和胺類碳源利用率.目前，國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究主要集中在盆栽條件下，玉米、花生連作或間作模式中的作物生長(zhǎng)、養(yǎng)分吸收、根系生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)等方面研究，而農(nóng)田土壤環(huán)境因素對(duì)根際土壤微生物碳源利用的影響報(bào)道較少.本文研究農(nóng)田玉米、花生根際土壤微生物的代謝功能差異，區(qū)分單作和間作模式下，不同施肥處理的土壤碳源利用類型，明確不同土壤微生物對(duì)不同類型碳源的利用差異，探尋玉米、花生間作模式對(duì)吉林省半干旱地區(qū)土壤微生物多樣性的影響和耕作制度的優(yōu)越性，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 供試土壤和作物品種

本試驗(yàn)連續(xù)兩年在吉林省四平市梨樹縣林海鎮(zhèn)李家圍子村進(jìn)行，中心地理坐標(biāo)為123.8°N，43.4°E.年降雨量481.7 mm，平均氣溫18.2 ℃，積溫1 758.3 ℃.屬溫帶半濕潤(rùn)大陸季風(fēng)性氣候，四季分明，雨熱同季.供試玉米品種為吉東21，屬早熟品種；供試花生品種為雙英9號(hào)，屬中晚熟品種.供試土壤類型為風(fēng)沙土，土壤理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)含量6.03 g/kg、堿解氮68.76 mg/kg、速效磷14.08 mg/kg、速效鉀53.89 mg/kg、pH為5.57.

1.2 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

大田試驗(yàn)采用小區(qū)設(shè)計(jì).種植模式上設(shè)3個(gè)處理：玉米單作、花生單作、玉米和花生間作；在施肥量上設(shè)3個(gè)處理：CK(不施肥)，NPK(無(wú)機(jī)肥)，NPKM(無(wú)機(jī)肥+有機(jī)肥).每個(gè)處理3次重復(fù)，共27個(gè)小區(qū)，小區(qū)隨機(jī)排列.小區(qū)面積為40 m2.玉米Ⅱ花生間作區(qū)采用4∶6種植模式(4行玉米間作6行花生)，玉米Ⅱ花生均采用等行距種植模式，行距60 cm.肥料采用壟施，玉米通過(guò)人工播種，花生通過(guò)播種機(jī)播種.玉米種植密度為65 000株/hm2，花生種植密度為100 000株/hm2.2018年玉米采用追肥的方式，追肥日期在6月25日.2019年玉米追肥日期在6月20日.2018年與2019年花生均采用一次性基肥使用方式.2018年于5月10日施基肥，于5月23日播種，2019年于5月20日施基肥并于次日播種.兩年兩種作物均在10月1日收獲.各處理養(yǎng)分投入量如表1所示.

表1 各處理養(yǎng)分投入量 kg/hm2

土壤樣品采集于2019年8月3日，于玉米灌漿期，選取玉米長(zhǎng)勢(shì)良好的多株，將根系部分全部取出，去除多余土壤，抖土法搜集玉米根際土壤，在每個(gè)小區(qū)按Z型取樣5個(gè)點(diǎn)后混合封袋作為一個(gè)重復(fù).采集花生根際土壤用類似的方法.將采集新鮮土樣隨冰袋帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分于4 ℃保存，在2～3 d內(nèi)用培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)一周，然后進(jìn)行微生物功能多樣性測(cè)定.另一部分風(fēng)干后過(guò)1 011 nm篩進(jìn)行土壤理化性質(zhì)測(cè)定.

1.3 樣品測(cè)定方法

采用Biolog-ECO微平板技術(shù)分析土壤微生物對(duì)單一碳源的利用率，對(duì)Garland 和Mills的測(cè)定方法稍加改動(dòng)[2].詳細(xì)步驟：準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于15 g干重的新鮮土樣于滅菌的100 mL 0.75% NaCl溶液中，25 ℃、200 r/min條件下避光震蕩15 min.按照逐步稀釋法，將稀釋液全部接種到微平板中，每孔加150 μL，然后避光連續(xù)培養(yǎng)10 d，每隔24 h測(cè)定一次樣品的吸光值.ECO平板上共有96個(gè)微孔，包含31種碳源，碳源的分布及其分類參照文獻(xiàn)[8]，依據(jù)微孔板上顏色的深淺判斷微生物對(duì)單一碳源的利用程度.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS17.0軟件分析了種植模式和施肥處理及相互作用對(duì)土壤微生物碳源利用能力的雙因素方差分析(Two-way ANOVA).使用Canono for Windows version 4.5進(jìn)行冗余分析(RDA).選取96 h的花生AWCD對(duì)微生物碳源能力進(jìn)行主成分分析(PCA).選取144 h的花生AWCD對(duì)微生物碳源能力進(jìn)行主成分分析(PCA).

2 結(jié)果與分析

2.1 種植模式和施肥處理對(duì)根際土壤微生物群落總體活性的影響

應(yīng)用Biolog微生態(tài)板對(duì)不同處理的根際土壤微生物的碳源代謝多樣性進(jìn)行分析，其結(jié)果可衡量土壤微生物群落對(duì)種植模式的響應(yīng).土壤樣品平均顏色隨時(shí)間變化率(averagewell color development，AWCD)可反映土壤微生物群落碳源利用能力.如圖1所示，花生和玉米土壤開(kāi)始接種培養(yǎng)后，每間隔24 h測(cè)定AWCD的動(dòng)態(tài)變化，研究發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)微生物碳源利用率較低，說(shuō)明微生物內(nèi)部需要調(diào)整從而找到合適的碳源.在不同種植模式條件下，兩種作物土壤的AWCD值都隨時(shí)間增加而增高，特別是24 h之后碳源利用率開(kāi)始逐漸升高，微生物代謝活性也逐漸增加，說(shuō)明微生物生長(zhǎng)進(jìn)入了旺盛期，直到168 h后都基本進(jìn)入平穩(wěn)期，碳源利用率也趨近不變.

a：花生；b：玉米

由圖1可看出，和單作相比，間作提高了花生土壤的AWCD值，降低了玉米土壤的AWCD值.單作條件下，施肥處理降低了花生土壤的碳源利用能力，有機(jī)肥的施入，減緩了微生物對(duì)單一碳源的利用能力，培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到168 h后，微生物碳源利用率又有所下降；施肥處理顯著提高了單作玉米的碳源利用率.間作條件下，施肥處理顯著均提高了花生和玉米的碳源利用率，且有機(jī)肥的施入明顯提高了間作體系下兩種土壤的碳源利用能力.在相同施肥條件下，間作花生的AWCD值較單作顯著提高，而間作玉米的AWCD值較單作均有所降低，說(shuō)明種植模式改變可能引起土壤中微生物組成豐富度的變化.為了清晰描述，花生不同處理方式采用簡(jiǎn)寫，SP：表示單作花生，IP：表示間作花生；SP-CK：表示不施肥條件下單作花生，SP-NPK：表示施用無(wú)機(jī)肥條件下單作花生，SP-NPKM：表示施用無(wú)機(jī)肥和有機(jī)肥條件下單作花生，IP-CK：表示不施肥條件下間作花生，IP-NPK：表示施用無(wú)機(jī)肥條件下間作花生，IP-NPKM：表示施用無(wú)機(jī)肥和有機(jī)肥條件下間作花生；玉米不同處理方式采用簡(jiǎn)寫，SM：表示單作玉米，IM：表示間作玉米；SM-CK：表示不施肥條件下單作玉米，SM-NPK：表示施用無(wú)機(jī)肥條件下單作玉米，SM-NPKM：表示施用無(wú)機(jī)肥和有機(jī)肥條件下單作玉米，IM-CK：表示不施肥條件下間作玉米，IM-NPK：表示施用無(wú)機(jī)肥條件下間作玉米，IM-NPKM：表示施用無(wú)機(jī)肥和有機(jī)肥條件下間作玉米.

2.2 種植模式和施肥處理對(duì)根際土壤微生物各類碳源利用情況的影響

種植模式和施肥處理及相互作用對(duì)玉米和花生土壤碳源利用能力有顯著影響(見(jiàn)表2和3)，同一種植模式下，不同施肥處理后微生物對(duì)6種碳源(碳水化合物、酚酸類、氨基酸類、胺類、羧酸和多聚物)的利用差異顯著(見(jiàn)圖2和3).

表2 種植模式和施肥處理及相互作用對(duì)花生土壤碳源利用能力的方差分析(n=18)

表3 種植模式和施肥處理及相互作用對(duì)玉米土壤碳源利用能力的方差分析(n=18)

由圖2可以看出，花生土壤中微生物利用的碳源主要包括碳水化合物、氨基酸類、羧酸和多聚物，利用能力最高的是碳水化合物，酚酸類和胺類利用率較低.與單作相比，間作提高了花生的碳水化合物、氨基酸類、羧酸和多聚物的利用能力，而間作玉米降低了碳水化合物、氨基酸類、羧酸和多聚物的利用能力(見(jiàn)圖3).

圖2 花生土壤微生物群落對(duì)不同碳源相對(duì)利用情況

圖3 玉米土壤微生物群落對(duì)不同碳源相對(duì)利用情況

單作條件下，與不施肥相比，施肥后花生中微生物對(duì)碳水化合物、氨基酸類利用率分別降低40%和29%，施用有機(jī)肥提高了單作花生對(duì)碳水化合物的利用率，對(duì)其他碳源物質(zhì)影響很小.與不施肥相比，施肥后玉米中微生物對(duì)氨基酸類、羧酸和多聚物利用率分別降低了34%，53%和38%.間作條件下，與不施肥相比，施肥后花生中微生物對(duì)碳水化合物、氨基酸類、羧酸類和多聚物的利用率分別提高了12%，31%，29%和66%，施用有機(jī)肥顯著提高了單作花生對(duì)碳水化合物、氨基酸類和羧酸類的利用率.

與不施肥相比，施肥后玉米中微生物對(duì)碳水化合物、氨基酸類、羧酸和多聚物利用率差異不顯著，不過(guò)酚酸類和胺類利用能力有所回升，而有機(jī)肥的施入顯著影響了間作玉米對(duì)碳水化合物的利用能力.整體上玉米比花生的碳源利用率能力高.由此推斷，花生中微生物對(duì)碳水化合物、氨基酸類、羧酸和多聚物類有所偏好，而玉米中微生物相對(duì)喜好對(duì)碳水化合物、氨基酸類、羧酸、多聚物類和胺類等碳源有所偏好，其中單作玉米中微生物對(duì)酚酸類微生物也有一定利用率.

2.3 玉米、花生間作條件下根際土壤碳源利用能力主成分分析

進(jìn)一步對(duì)不同處理中6類碳源的利用情況進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，不同處理?xiàng)l件下，花生(見(jiàn)圖4a)和玉米(見(jiàn)圖4b)土壤的微生物群落碳源代謝指紋特征有顯著區(qū)分.花生主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別解釋變量方差的68.22%和18.04%，玉米主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別解釋變量方差的75.94%和19.40%.

a：花生；b：玉米

單作花生和間作花生分別分布于第一分類軸的正負(fù)兩端，而且施肥處理的樣品均處于第二分類軸的正方向；不施肥處理樣品均處于第二分類軸的負(fù)方向，該結(jié)果說(shuō)明不同種植模式下花生根際土壤微生物的碳源代謝特征存在顯著差異，而且施肥處理也有顯著區(qū)分.與主成分1(PC1)正相關(guān)系數(shù)較高的碳源依次為碳水化合物、氨基酸類和多聚物類.單作玉米和間作玉米分別分布于第二分類軸的正負(fù)兩端，而且不施肥處理樣品與施肥處理顯著分開(kāi)，該結(jié)果說(shuō)明不同種植模式下玉米根際土壤微生物的碳源代謝特征存在顯著差異.與主成分1(PC1)正相關(guān)系數(shù)較高的碳源依次為碳水化合物、酚酸類和多聚物類.不同作物之間，單作條件下玉米和花生之間的差異最大，間作條件下玉米和花生之間的差異較小.

2.4 玉米、花生間作條件下根際土壤碳源利用能力冗余分析

花生間作(見(jiàn)圖5b)根際土壤中微生物碳源利用率和土壤環(huán)境因素之間的關(guān)系通過(guò)冗余分析(RDA)來(lái)解釋.施肥處理之間顯著分開(kāi)，表明土壤速效磷是影響間作花生(r2=0.652 1，P=0.05)中微生物碳源代謝能力的重要因子，如圖5a所示，總氮是影響單作花生(r2=0.698 9，P=0.034)中微生物碳源代謝能力的重要因子.六類碳源代謝吸光度與不同環(huán)境因子的分析表明，土壤中速效磷很大程度上影響間作花生中微生物對(duì)糖類、氨基酸類、酯類、胺類及酸類碳源的代謝利用.土壤全氮主要影響間作花生中微生物對(duì)醇類物質(zhì)的代謝.

如圖5c和5d所示，玉米不同施肥處理之間顯著分開(kāi)，結(jié)果表明土壤pH是影響單作玉米(r2=0.708 7，P=0.03)中微生物碳源代謝能力的重要因子(圖5c)，速效磷是影響間作玉米(r2=0.554 1，P=0.044)中微生物碳源代謝能力的重要因子(見(jiàn)圖5d)，并且與速效磷成正相關(guān).第一主軸能解釋所有信息的77.78%，第二主軸能解釋所有信息的10.33%，兩者累計(jì)解釋信息量共88.11%，說(shuō)明了還有未列出的某些環(huán)境因素種類及含量影響玉米間作根際土壤中碳源利用能力，從而影響微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu).

3 討論

不同的植物種類以及環(huán)境條件，根系分泌物的化學(xué)組成和含量也表現(xiàn)出顯著差異，進(jìn)而根際微生物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化.許多研究表明，根系分泌的含碳的主要代謝產(chǎn)物，如糖、氨基酸、酚酸以及更復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物能刺激或抑制土壤生物的生長(zhǎng)[9].可見(jiàn)，間作條件下微生物群落結(jié)構(gòu)的改變可能與兩種作物根系分泌物互作緊密相關(guān).

本文應(yīng)用Biolog微生態(tài)板分析了不同地下部互作條件下根際微生物群落對(duì)不同碳源利用水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理玉米土壤對(duì)總碳源的利用水平變化不同，其碳源類型存在差異，單作和間作處理下提高了玉米根際微生物對(duì)胺類和酚酸類的代謝水平；伴隨地下部根際互作，花生根際土壤微生物不僅提高了總體碳源的利用，而且促進(jìn)了對(duì)不同類型碳源(除糖類)的利用水平.該結(jié)果與間作條件下土壤微生物量的提高和群落結(jié)構(gòu)改變緊密相關(guān).同時(shí)發(fā)現(xiàn)根際互作促進(jìn)了玉米、花生根際土壤微生物不同碳源的代謝多樣性.該結(jié)果表明玉米、花生間作條件下促進(jìn)了微生物功能的多樣性，同時(shí)也暗示了根際互作下，提高了根際中分泌物的多樣性及其含量[10].

在本文雙因素方差分析表明，種植模式和施肥處理顯著影響了玉米和花生中碳水化合物、羧酸類、氨基酸類和胺類物質(zhì)代謝能力，而花生中聚合物類和酚酸類物質(zhì)只受施肥效應(yīng)的影響，玉米中僅僅酚酸類物質(zhì)受施肥效應(yīng)的影響.冗余分析表明，土壤理化因子影響微生物活性.pH、有效磷和總氮是影響玉米、花生土壤微生物碳代謝活性的主要因子.有研究表明，土壤有效磷、速效鉀、pH和全氮量均顯著影響土壤中微生物數(shù)量[11].因此可以推斷，理化因子通過(guò)改變土壤微生物量進(jìn)而影響微生物對(duì)碳源利用能力[12].

文獻(xiàn)[13]研究表明施入有機(jī)肥處理后，微生物群落相對(duì)豐富的土壤類似S曲線增長(zhǎng).相反，AWCD線性增長(zhǎng)表明微生物群落貧瘠[14].間作玉米條件下施用有機(jī)肥處理的AWCD值最高，表明有機(jī)肥處理增加了土壤微生物總體活性，對(duì)碳源利用能力較強(qiáng).微生物早期主要利用基質(zhì)是葡萄糖、果糖和半乳糖，后期主要利用的是聚合物類大分子，土壤中微生物群落的改變與可利用養(yǎng)分的充足與否有關(guān)[15].本文碳水化合物、氨基酸和羧酸類在間作花生處理中利用率高，這表明間作處理促進(jìn)了花生根系附近微生物對(duì)簡(jiǎn)單的糖類、碳水化合物快速利用.這與文獻(xiàn)[16]低碳源利用率是大分子碳基質(zhì)長(zhǎng)期累積的研究結(jié)果一致.文獻(xiàn)[8，17]也有類似的結(jié)果，施肥后花生中微生物對(duì)碳水化合物、氨基酸類、羧酸類和多聚物的利用率增高，表明氮的沉積很有可能改變微生物群落的功能和組成，進(jìn)而反饋于生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能演變規(guī)律.

4 小結(jié)

種植模式和施肥處理互作均顯著改變微生物碳源代謝活性，種植模式對(duì)微生物活性的影響更大.根際互作促進(jìn)玉米、花生根際土壤微生物對(duì)不同碳源代謝的多樣性以及利用水平(尤其是花生的根際微生物)，提高了不同碳源的利用水平.土壤全氮、速效磷和pH的差異影響微生物對(duì)不同碳源利用的代謝活性.因此，玉米和花生間作模式可改變根際中微生物碳源利用的多樣性，進(jìn)而改善土壤微生物群落，可能緩解根際土壤微生物營(yíng)養(yǎng)脅迫.