蒲春宏，黃 榮

(成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，功能分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

隨著人類生活水平提升，肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化等代謝相關(guān)疾病威脅著人類的健康，而現(xiàn)有藥物服用后的效果不佳，因此，開發(fā)天然、安全有效的食源性產(chǎn)品調(diào)節(jié)人體代謝有著極為重要的意義[1]?？喙?，葫蘆科苦瓜屬，又名錦荔枝、賴葡萄、涼瓜等，是一年生攀援性草本植物，原產(chǎn)亞熱帶，分布于溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]?？喙系臓I養(yǎng)價(jià)值比較高，含有多種營養(yǎng)成分，是人們?nèi)粘Ｉ钪械乃幨硟捎檬称?。苦瓜含有多糖、皂苷、黃酮、多肽、生物堿、維生素、氨基酸等多種天然生物活性成分以及豐富的鋅、鎂、鐵和鉻等微量元素[3-4]，近年來國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜及活性提取物具有降糖降脂、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)免疫力等功能特性[5-6]。

現(xiàn)代研究表明，皂苷類、蒽醌類、蛋白質(zhì)類、黃酮類、生物堿類、活性多糖類等多種活性成分具有良好的降糖降脂作用?？喙现泻胸S富的皂苷、黃酮、多糖等活性成分[7-8]，具有較強(qiáng)的降血脂、降血糖的功效[9-10]，并且苦瓜皂苷聯(lián)合其他植物多糖或黃酮后具有更好的降糖降脂效果，聯(lián)合使用比單獨(dú)使用時(shí)的降糖降脂功效明顯增強(qiáng)，對肝腎的保護(hù)作用也加強(qiáng)，效果更加顯著，且黃酮類化合物具有抗癌防癌、提高免疫力、抗氧化、抗衰老等多種生物活性[11-13]。隨著相關(guān)研究的深入，苦瓜活性成分的降糖降脂的作用機(jī)制在近年來也有了更加全面的進(jìn)展，因此人們將目光越來越多的聚集到苦瓜有效利用的研究上。

目前，苦瓜活性成分的提取大多是單一成分，至多為兩種成分的研究，從苦瓜中復(fù)合提取皂苷、黃酮和多糖工藝未見報(bào)道，傳統(tǒng)單一成分的提取工藝沒有充分利用原料，只提取出苦瓜中一種或兩種有效成分，對資源造成很大的浪費(fèi)。因此，亟須研究出多種成分復(fù)合提取的工藝，以填補(bǔ)區(qū)域空白，合理有效地利用資源。

1 試劑與儀器

1.1 主要試劑

苦瓜粉(過60目篩，烘至恒重)，乙醇，甲醇，乙酸，硫酸，香草醛，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，苯酚均為分析純級；人參皂苷Rg1、無水葡萄糖(HPLC>98%)，成都康邦生物科技有限公司；蘆丁(HPLC>98%)，成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； TG16.5高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司； XY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海翔雅儀器設(shè)備有限公司；LC-520冷卻液循環(huán)裝置，上海翔雅儀器設(shè)備有限公司；SHB-111循環(huán)水式真空泵，上海翔雅儀器設(shè)備有限公司。

2 苦瓜中連續(xù)提取皂苷、黃酮和多糖的方法

根據(jù)相似相溶原理，隨著皂苷、黃酮、多糖的極性逐漸增大，浸提溶劑的極性也應(yīng)逐漸增大，選用乙醇/水作為提取工藝的浸提溶劑，乙醇的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)逐漸減小[14]。本實(shí)驗(yàn)選用95%～75%乙醇溶液提取皂苷，60%～40%乙醇溶液提取黃酮，10%～0%乙醇溶液提取多糖。并使用超聲波輔助提取，采用三因素三水平正交試驗(yàn)對乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比進(jìn)行條件優(yōu)化，篩選出最優(yōu)提取方案。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.1.1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取25 mg人參皂苷Rg1，加入適量的甲醇使其溶解后，后將其轉(zhuǎn)移定容至25 mL容量瓶中，制成1 mg·mL-1的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液0.75、105、135、165、195 μL于10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入新制5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和80%濃硫酸0.8 mL，密塞，搖勻，60 ℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻10 min，加入5 mL冰乙酸稀釋，搖勻，靜置15 min后于549 nm處測定吸光度[15]，以吸光度為縱坐標(biāo)，皂苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制吸光度-皂苷質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程式y(tǒng)=0.0381x-0.2085(R2=0.9995)。

2.1.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取干燥后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，加入適量80%乙醇并在水浴鍋中邊加熱邊搖晃直至溶解，后將其轉(zhuǎn)移定容至 100 mL容量瓶，配制成0.25 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)試劑，分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 25 mL容量瓶中，分別加入0.75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2，搖勻，放置 5 min后加入0.75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3，6 min后再加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4 %的NaOH溶液，混勻，用80%乙醇稀釋至刻度，10 min后于波長510 nm處測定吸光度[16]。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制吸光度-蘆丁質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程式y(tǒng)=0.0124x+0.0404(R2=0.9999)。

2.1.3 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取10 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量超純水溶解，后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，配成0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，分別精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)試劑0、0.05、0.15、0.25、0.35、 0.45 mL于10 mL具塞試管中，加水補(bǔ)至2 mL，加0.4 mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加4.5 mL濃H2SO4，60 ℃水浴 10 min，冷卻至室溫，于493 nm處測定吸光度[17]。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制吸光度-葡萄糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.0452x+0.3431(R2=0.9991)。

2.2 提取率計(jì)算公式

式中：C——樣品濃度，mg·L-1；V——提取液的體積與稀釋倍數(shù)的乘積，L；W——稱取樣品苦瓜粉的質(zhì)量，g。

2.3 從苦瓜中連續(xù)提取皂苷、黃酮和多糖的條件實(shí)驗(yàn)

2.3.1 提取皂苷正交實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取3.0 g干燥的苦瓜粉，加入乙醇溶液，濃度為95%、80%、75%，料液比為1:25、1:20、1:15 g/mL， 60 ℃下超聲，超聲時(shí)間40 min、35 min、30 min。抽濾，將提取液減壓旋蒸回收乙醇，用甲醇將濃縮液定容至25 mL容量瓶中，測定含量，計(jì)算皂苷提取率，篩選最優(yōu)提取條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1 提取皂苷正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for extraction of saponins

2.3.2 提取黃酮正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2.3.1最佳提取條件：乙醇濃度95%，料液比1: 20 g/mL，超聲時(shí)間30 min，提取皂苷后得濾渣1，將濾渣1干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取3.0 g，加入乙醇溶液，濃度為60%、50%、40%，料液比為1:25、1:20、1:15 g/mL，60 ℃下超聲，超聲時(shí)間35 min、30 min、25 min。抽濾，將提取液減壓旋蒸回收乙醇，用80%乙醇將濃縮液定容至100 mL容量瓶中，測定含量，計(jì)算黃酮提取率，篩選出最優(yōu)提取條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表2。

表2 提取黃酮正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for extraction of flavonoids

2.3.3 提取多糖正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2.3.2最佳提取條件：乙醇濃度60%，超聲時(shí)間 35 min，料液比1:25 g/mL，提取黃酮后得濾渣2，將濾渣2干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取3.0 g，加入乙醇溶液，濃度為10%、5%、0%，料液比為1:25、1:20、1:15 g/mL，70℃下超聲，超聲時(shí)間30 min、25 min、20 min。超聲完后6000 r·min-1離心20 min，再進(jìn)行抽濾，用水將濾液定容至100 mL容量瓶中，測定含量，計(jì)算多糖提取率，篩選出最優(yōu)提取條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表3。

表3 提取多糖正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test for extraction of polysaccharides

2.4 從苦瓜中連續(xù)提取皂苷、黃酮和多糖的復(fù)合實(shí)驗(yàn)

稱取10 g干燥的苦瓜粉，按優(yōu)化的皂苷提取實(shí)驗(yàn)條件，提取苦瓜皂苷，抽濾得濾渣1、濾液1，檢測濾液1中的皂苷含量。按優(yōu)化的黃酮提取實(shí)驗(yàn)條件，提取上一步濾渣1中的黃酮，抽濾得濾渣2、濾液2，檢測濾液2中的黃酮含量。按優(yōu)化的多糖提取實(shí)驗(yàn)條件，提取上一步濾渣2中的多糖，抽濾后得濾液3，檢測濾液3中的多糖含量，分別計(jì)算苦瓜皂苷、黃酮、多糖的提取率。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取皂苷正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1進(jìn)行皂苷提取的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Design and results of orthogonal experiment for extraction of saponins

根據(jù)表4極差分析可知，三個(gè)因素影響苦瓜中皂苷的提取率程度不同，料液比影響最大，乙醇濃度影響較小，超聲時(shí)間影響最小。影響順序即是：C>A>B。同時(shí)，由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可得出，C2A1B3是提取苦瓜皂苷的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，即料液比1:20 g/mL，乙醇濃度95%，超聲時(shí)間30 min，此時(shí)苦瓜皂苷提取效果最佳。

3.2 提取黃酮正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2進(jìn)行黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Design and results of orthogonal experiment for extraction of flavonoids

根據(jù)表5極差分析可知，三個(gè)因素影響苦瓜中黃酮的提取率程度不同，乙醇濃度影響最大，料液比影響較小，超聲時(shí)間影響最小。影響順序即是：A>C>B。同時(shí)，由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可得出，A1C1B1是提取苦瓜黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，即乙醇濃度60%，料液比1:25 g/mL，超聲時(shí)間35 min，此時(shí)苦瓜黃酮提取效果最佳。

3.3 提取多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表3進(jìn)行多糖提取的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Design and results of orthogonal experiment for extraction of polysaccharides

續(xù)表6

根據(jù)表6極差分析可知，三個(gè)因素影響苦瓜中多糖的提取率程度不同，乙醇濃度影響最大，超聲時(shí)間影響較小，料液比影響最小。影響順序即是：A>B>C。同時(shí)，由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可得出，A3B1C3是提取苦瓜黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，即乙醇濃度0%(蒸餾水)，超聲時(shí)間30 min，料液比1:15 g/mL，此時(shí)苦瓜多糖提取效果最佳。

3.4 復(fù)合提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)提取苦瓜皂苷、黃酮、多糖的正交實(shí)驗(yàn)得到相應(yīng)的最佳提取條件，提取皂苷：料液比1:20 g/mL，乙醇濃度95%，超聲時(shí)間30 min；提取黃酮：乙醇濃度60%，料液比 1:25 g/mL，超聲時(shí)間35 min；提取多糖：乙醇濃度0%(蒸餾水)，超聲時(shí)間30 min，料液比1:15 g/mL。取10 g苦瓜粉按最優(yōu)條件進(jìn)行連續(xù)提取，得皂苷提取率為2.76%、黃酮提取率為0.29%、多糖提取率為5.29%。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用高、中、低體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取溶劑，并使用超聲波輔助的方法，按照皂苷、黃酮、多糖的順序從苦瓜中連續(xù)提取出皂苷、黃酮和多糖，用正交實(shí)驗(yàn)得到了復(fù)合提取工藝條件：料液比1:20 g/mL，乙醇濃度95 %，超聲時(shí)間30 min提取皂苷，皂苷提取率為2.76%；乙醇濃度60%，料液比1:25 g/mL，超聲時(shí)間35 min提取黃酮，黃酮提取率為0.29%；乙醇濃度0%(蒸餾水)，超聲時(shí)間30 min，料液比 1:15 g/mL提取多糖，多糖提取率為5.29%。

該復(fù)合提取工藝的提取溶劑僅使用乙醇溶液，提取液黏度小，易于過濾與分離，方便回收進(jìn)行二次利用，綠色、環(huán)保無毒，符合現(xiàn)如今的綠色環(huán)保新發(fā)展理念。與傳統(tǒng)活性成分的浸提相比，利用超聲波的空化現(xiàn)象以及震動作用，加快了提取速度。并且本復(fù)合提取工藝流程簡便，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)僅從同一份苦瓜原料中，就可以提取出多種活性成分，原料得到了充分的利用，使得生產(chǎn)成本降低，有一定的參考價(jià)值，也可為苦瓜活性成分開發(fā)及深入研究提供參考。