◎ 李 澤，余銀芳，馬紹龍，閆景輝，鐘地長(zhǎng)，胡俊杰

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.江中藥業(yè)股份有限公司中藥矯味（掩味）和感官評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004）

近年來(lái)，全世界對(duì)以健康的人體腸道微生物區(qū)系為目標(biāo)的益生菌和合生元產(chǎn)品的開發(fā)產(chǎn)生了極大的興趣[1-2]。益生菌（Probiotics）是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱[3]。攝取益生菌被認(rèn)為是平衡人體腸道微生物區(qū)系的有效策略，可以改善腸道健康，降低各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如代謝綜合征、皮膚炎癥等[4-5]。而保證“一定數(shù)量”和“活的狀態(tài)”的益生菌是益生菌制劑發(fā)揮功效的前提。為了提高益生菌的存活率，人們探索了各種措施，如篩選高耐受性菌株、包埋、添加多糖和寡糖等[6-8]。

咀嚼片由于攜帶、食用等方便，具有較好的市場(chǎng)前景，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[9]。本試驗(yàn)以發(fā)酵乳桿菌菌粉為主要原料，添加適量輔料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)選益生菌咀嚼片主要輔料，并采用成對(duì)偏愛檢驗(yàn)法，與市售同類型產(chǎn)品口感對(duì)比測(cè)評(píng)。本試驗(yàn)旨在通過(guò)益生菌咀嚼片研制，為益生菌類制劑研究提供一定的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所）；麥芽糖醇（浙江華康藥業(yè)股份有限公司）；山梨糖醇（浙江華康藥業(yè)股份有限公司）；赤蘚糖醇（保齡寶生物股份有限公司）；低聚果糖（量子高科生物股份有限公司）；低聚木糖（易常青生物科技有限公司）；低聚半乳糖（量子高科生物股份有限公司）；檸檬酸（山東英軒實(shí)業(yè)）；蘋果酸（萬(wàn)利來(lái)香化有限公司）；酒石酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；脫脂乳粉（呼倫貝爾塞尚雀巢有限公司）；MRS培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；氯化鈉（湖北西隴化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA822-CW型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AquaLab TDL水分活度儀（美國(guó)DECAGON公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；BBS-V800型超凈工作臺(tái)（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；UV-1800紫外分光光度計(jì)（SHIMADZU CORPORATION）；單沖壓片機(jī)（國(guó)藥龍立科技有限公司）；MA160-1CN型水分測(cè)定儀（賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；ZQZY-85BN型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；智能硬度儀（天津市貝斯特科技公司）；LDZF-50L-III型立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SAFE-1500LC型生物安全柜（力新儀器上海有限公司）；XW-80A型微型旋渦混合儀（上海滬西儀器廠有限公司）；Eppendorf移液槍（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；HN-08型拍打式無(wú)菌均質(zhì)器（上海漢諾儀器有限公司）；梅特勒FiveEasy Plus pH計(jì)（梅特勒托利多儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備工藝流程

益生菌咀嚼片制備工藝流程如圖1所示。

圖1 益生菌咀嚼片工藝流程圖

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定方法

（1）水分含量測(cè)定。水分含量按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》（GB 5009.3—2016）第一法（直接干燥法）測(cè)定。

（2）益生菌活菌數(shù)測(cè)定[10]?；罹鷶?shù)按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35—2016）測(cè)定。益生菌活菌存活率=壓片后益生菌活菌數(shù)/壓片前益生菌活菌數(shù)×100%。

（3）水活度測(cè)定[11]。水活度采用AquaLab TDL水分活度儀測(cè)定，平行測(cè)定3份，取平均值。

（4）吸濕率測(cè)定[12]。參照《中國(guó)藥典》（2020年版）四部“9103藥物引濕性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”試驗(yàn)，平行測(cè)定3份，取平均值。吸濕率=物料增加質(zhì)量/物料質(zhì)量×100%。

1.3.3 主要輔料篩選

益生菌咀嚼片主要由發(fā)酵乳桿菌菌粉、填充輔料（糖醇類、益生元、酸味劑等）、黏合劑和潤(rùn)滑劑組成。

（1）糖醇類輔料種類及用量篩選。糖醇類輔料在配方中占比較高，經(jīng)預(yù)試和文獻(xiàn)查閱，糖醇類輔料不會(huì)抑制益生菌活菌數(shù)的生長(zhǎng)，但糖醇類輔料水分、水活度及吸濕率對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和活菌存活率影響較大。經(jīng)預(yù)試，選擇麥芽糖醇、赤蘚糖醇、山梨糖醇、木糖醇和異麥芽酮糖醇5種糖醇類輔料進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)。取5種輔料適量，測(cè)定其干燥前、干燥后水分、水活度，同時(shí)按1.3.2吸濕率測(cè)定方法測(cè)定吸濕率，平行測(cè)定3次。

（2）益生元種類及用量篩選。相對(duì)于益生菌，益生元?jiǎng)t是近年來(lái)出現(xiàn)的食品概念[13]。益生元可以定義為不可消化的食物成分，可以選擇性地刺激結(jié)腸中一種或多種細(xì)菌的生長(zhǎng)和（或）活性，從而對(duì)宿主產(chǎn)生有益的影響。低聚糖與益生菌復(fù)合使用，能夠更好地發(fā)揮效果。有文獻(xiàn)報(bào)道，益生菌生長(zhǎng)過(guò)程中，其光密度值的變化在一定程度上可作為益生菌的生長(zhǎng)狀況的代表量，而益生菌生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)酸，pH值的變化也可一定程度上反映益生菌的生長(zhǎng)狀況，pH值下降得越快，益生菌產(chǎn)酸越多，益生菌生長(zhǎng)越好。選擇益生元低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和菊粉，按試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定其OD600值和pH值，篩選較優(yōu)益生元。配制含葡萄糖的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用等質(zhì)量濃度的益生元代替，將發(fā)酵乳桿菌菌粉按1%的接種量接入活化培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，測(cè)其OD600和pH值，每4 h檢測(cè)一次。

（3）酸味劑用量篩選。經(jīng)預(yù)試，檸檬酸酸味溫和，未有不良后味，因此選擇檸檬酸為配方中的酸味劑。

在保證配方口感前提下，分別往配方中添加0%、0.5%、1.0%和1.5%，測(cè)其活菌數(shù)，考察配方中不同比例檸檬酸對(duì)益生菌咀嚼片活菌數(shù)的影響。1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）評(píng)分指標(biāo)測(cè)定方法。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的選擇以益生菌的活菌存活率和片劑的成型性為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

（2）正交試驗(yàn)因素水平表的設(shè)計(jì)。對(duì)輔料麥芽糖醇、低聚半乳糖和檸檬酸，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以益生菌活菌存活率、成型性為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，確定配方最佳比例。因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 益生菌咀嚼片口感測(cè)評(píng)

益生菌咀嚼片口感測(cè)評(píng)采用口嘗法與市售火爆同類型產(chǎn)品B進(jìn)行對(duì)比測(cè)評(píng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 填充輔料篩選研究

2.1.1 糖醇類輔料篩選結(jié)果

如表3所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，干燥后糖醇水分大小對(duì)比結(jié)果為異麥芽酮糖醇＞木糖醇＞山梨糖醇＞赤蘚糖醇＞麥芽糖醇；干燥后糖醇水活度大小對(duì)比結(jié)果為木糖醇＞赤蘚糖醇＞山梨糖醇＞異麥芽糖醇＞麥芽糖醇；吸濕率對(duì)比結(jié)果為異麥芽酮糖醇＞木糖醇＞山梨糖醇＞麥芽糖醇＞木糖醇。綜合分析，選擇麥芽糖醇為糖醇類輔料填充劑，設(shè)計(jì)其配方占比梯度為55%、60%、65%。

表3 5種糖醇類輔料水分、水活度、吸濕率測(cè)定結(jié)果表（n=3）

2.1.2 益生元篩選結(jié)果

由圖2、表4結(jié)果可知，益生元充當(dāng)培養(yǎng)基碳源后，益生元對(duì)發(fā)酵乳桿菌菌粉的體外增值作用由大到小為低聚半乳糖＞低聚果糖＞低聚異麥芽糖＞菊粉＞低聚木糖。值得注意的是，低聚木糖充當(dāng)碳源的組別，益生菌幾乎未生長(zhǎng)，可能是低聚木糖對(duì)發(fā)酵乳桿菌的增值效果較差。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇低聚半乳糖為配方中益生元，設(shè)計(jì)其配方占比梯度為10%、15%、20%。

表4 益生元充當(dāng)碳源時(shí)的OD600變化表

圖2 益生元充當(dāng)碳源時(shí)的pH值變化圖

2.1.3 酸味劑用量篩選結(jié)果

由圖3可知，隨著檸檬酸比例的增加，活菌數(shù)不斷減少，由此可見檸檬酸的用量對(duì)益生菌活菌數(shù)的影響很大。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇檸檬酸配方比例為0.5%、1.0%、1.5%。

圖3 不同比例檸檬酸對(duì)益生菌咀嚼片活菌數(shù)的影響圖

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。根據(jù)方差分析可知，檸檬酸添加量（B）對(duì)益生菌產(chǎn)品影響顯著，各個(gè)因素對(duì)片劑活菌數(shù)的影響順序如下：檸檬酸＞低聚果糖＞麥芽糖醇，結(jié)合直觀分析得出最優(yōu)配方為A3B1C3，即麥芽糖醇65%，檸檬酸0.5%，低聚半乳糖20%。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果表

表6 方差分析表

2.2 口感對(duì)比評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)采用成對(duì)偏愛檢驗(yàn)法，與市售火爆同類型產(chǎn)品B進(jìn)行口感對(duì)比測(cè)評(píng)，即評(píng)價(jià)員比較2個(gè)樣品，品嘗后指出更喜歡哪個(gè)樣品。本次檢驗(yàn)中，有自制樣品A（編號(hào)623）和市售火爆同類型產(chǎn)品B（編號(hào)846），共有30名評(píng)價(jià)員參與評(píng)價(jià)。本次成對(duì)偏愛檢驗(yàn)采取必選檢驗(yàn)單，不允許無(wú)偏愛。評(píng)價(jià)的結(jié)果是20名偏愛A，10名評(píng)價(jià)員偏愛B。根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果，查閱《食品感官評(píng)價(jià)》一書中的偏愛檢驗(yàn)附表可看出，在顯著性水平為5%時(shí)，樣品差異顯著的最小判斷數(shù)為21[14]。實(shí)際的數(shù)值為20＜21，因此評(píng)價(jià)小組對(duì)A樣品的偏愛沒(méi)有超過(guò)對(duì)樣品B的偏愛，即2個(gè)樣品的偏愛程度沒(méi)有顯著性差異。

3 結(jié)論

本文菌種選擇了發(fā)酵乳桿菌菌粉，通過(guò)活菌存活率、片子成型性及口感篩選出麥芽糖醇、低聚半乳糖、檸檬酸等作為益生菌咀嚼片的主要輔料，通過(guò)正交試驗(yàn)得出益生菌咀嚼片主要輔料最佳配方為低聚半乳糖20%，麥芽糖醇65%，檸檬酸0.5%，優(yōu)化后的益生菌咀嚼片活菌存活率高、成型性好、口感好。輔料中添加了益生元低聚半乳糖，有選擇性地提高了益生菌使用時(shí)間，讓產(chǎn)品具有生物特效；其中檸檬酸的添加量直接影響了益生菌制劑的活菌數(shù)，之后的篩選過(guò)程可有選擇性地降低檸檬酸的添加量或者使用檸檬酸鈉等酸度調(diào)節(jié)劑來(lái)中和。

益生菌制劑也稱益生素、促生素、生菌素、益菌素及微生態(tài)制劑等[15]。現(xiàn)在益生素作為一類重要的“功能食品”生產(chǎn)行業(yè)，是食品工業(yè)發(fā)展最快的行業(yè)之一，在全球食品行業(yè)中占據(jù)著越來(lái)越重要的地位，因此研究和開發(fā)益生菌制劑對(duì)振興我國(guó)的食品工業(yè)具有重要的意義[16]。而輔料是制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，是制劑生產(chǎn)的必備材料，因此輔料性質(zhì)的研究至關(guān)重要，本文研究了部分輔料對(duì)益生菌制劑活菌數(shù)的影響，為后期益生菌制劑的開發(fā)提供技術(shù)支持。