羅建民 彭翠紅 楊智威

(韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

硒是人類和動(dòng)物必需的微量元素，它是紅細(xì)胞中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的一種成分。其主要功能是參與酶的合成，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能免受過(guò)度氧化損傷，具有抗癌、解毒、護(hù)肝和提高人體免疫力的保健功能[1]。20世紀(jì)90年代初，中國(guó)總膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查顯示，居民每日膳食硒平均攝入量為43.3 g/d，低于中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的下限(50 g/d)[2]，我國(guó)有2/3的國(guó)土和地區(qū)處于缺硒狀況，通過(guò)天然食物獲取硒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)硒的需要，同時(shí)，大米在國(guó)內(nèi)的相當(dāng)一部分地區(qū)，還是每天必不可少的食物。因此，分析不同地區(qū)富硒大米的硒含量有著重要的意義。

硒元素的主要分析方法有原子吸收光譜法包括石墨爐原子吸收光譜法和氫化物發(fā)生原子吸收光譜法[3]、電化學(xué)分析法包括溶出伏安法[4]、極譜法以及電位分析法[5]、熒光光譜法包括分子熒光光譜法及氫化物-原子熒光譜法[6]。痕量硒的測(cè)定方法中，可見(jiàn)分光光度法和比色法[7]所用的儀器設(shè)備操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低，試劑不穩(wěn)定；石墨爐-原子吸收光譜法[8]的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，受背景干擾嚴(yán)重，穩(wěn)定性差；電化學(xué)方法[9]是近年來(lái)發(fā)展快速的測(cè)定方法，靈敏度較高，但存在干擾嚴(yán)重的問(wèn)題。目前報(bào)道富硒大米中硒含量的檢測(cè)，主要采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法和原子熒光光譜法，這兩種方法的準(zhǔn)確度、靈敏度高，但這兩種方法儀器設(shè)備比較貴，難以在基層實(shí)驗(yàn)室推廣。分子熒光光譜法也具有上述所說(shuō)的優(yōu)點(diǎn)，但用來(lái)測(cè)定富硒大米中硒含量研究的文獻(xiàn)卻很少，因此本文擬采用分子熒光光譜法測(cè)定富硒大米中的痕量硒，通過(guò)探究體系酸度pH值、水浴反應(yīng)時(shí)間、DAN用量以及表面活性劑等對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，確定分子熒光光譜法中痕量硒的最佳測(cè)定條件，將方法應(yīng)用于三種富硒大米中痕量硒的測(cè)定。為痕量硒的分析及人們?cè)陲嬍尺^(guò)程中攝入適量的硒，合理搭配膳食、保障人體健康提供方法及數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100.0 μg/mL)，使用時(shí)用1%的鹽酸溶液稀釋成0.05 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)使用液，備用；

2，3-二氨基萘(DAN) 溶液(1 g/L)、EDTA-鹽酸羥胺混合液：參照GB/T 5009.93-2017《食品中硒的測(cè)定方法》配制；CPB(溴化十六烷基吡啶，1.0×10-5mol/L)、CPC(氯化十六烷基吡啶，1.0×10-5mol/L)、DTAB(十二烷基三甲基溴化銨，1.0×10-5mol/L)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、鹽酸羥胺、環(huán)己烷、高氯酸、硝酸、鹽酸均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。

1.2 主要儀器及工作條件

F-380型分子熒光光度計(jì)(港東科技公司)。工作條件：電壓340 V，燈電流100 mA，狹縫寬度10 nm，掃描速度1 200 nm/min，增益1，重復(fù)1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將大米樣品去除雜物后，用石英研缽充分磨碎，磨碎后的樣品儲(chǔ)存于塑料瓶中；稱取1.0 g(精確至0.000 1 g)試樣置于錐形瓶中，加5 mL硝酸-高氯酸混合酸(9+1)及幾粒玻璃，蓋上表面皿浸泡過(guò)夜。次日于電熱板上消解至澄清透明，冷卻后定容(同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn))。

1.3.2 硒的測(cè)定

準(zhǔn)確移取4.00 mL 50 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液于錐形瓶中，加入15.00 mL EDTA-鹽酸羥胺混合溶液，用鹽酸溶液(1+9)調(diào)節(jié)pH值，在暗室中加入一定量 DAN溶液，水浴鍋加熱至60～100 ℃，加熱一定時(shí)間，冷卻后加入3.00 mL環(huán)己烷，2.00 mL表面活性劑溶液(1.0×10-5mol/L)，振搖5 min，將溶液全部移入分液漏斗中，靜置分層后，將上層的環(huán)己烷移入比色管中，測(cè)量環(huán)己烷萃取液的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 硒測(cè)定的熒光光譜及測(cè)定波長(zhǎng)選擇

按實(shí)驗(yàn)方法得到萃取測(cè)定液，在300～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得激發(fā)光譜，500～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得發(fā)射光譜，硒(Ⅳ)與DAN在酸性條件下反應(yīng)生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，其最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)為λEx/λEm= 373 nm/521 nm，如圖1所示。因此，選擇521 nm作為熒光測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 硒測(cè)定的激發(fā)與發(fā)射光譜Figure 1 The excitation and emission spectra of Se determination.

2.2 硒的熒光測(cè)定條件選擇

2.2.1 DAN用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

準(zhǔn)確移取4.00 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)加入5個(gè)錐形瓶中，在暗室中分別加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL DAN溶液(1 g/L)，按照實(shí)驗(yàn)方法，其他條件不變，加入3.00 mL環(huán)己烷、2.00 mL CPB溶液(1.0×10-5mol/L)萃取后，測(cè)定環(huán)己烷層萃取液的熒光強(qiáng)度，如圖2所示，在加入DAN 2.00～3.00 mL時(shí)，體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，當(dāng)DAN加入量為3.00 mL時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。故實(shí)驗(yàn)選擇DAN用量為3.00 mL。

圖2 DAN用量對(duì)硒測(cè)定熒光強(qiáng)度的影響Figure 2 Effect of the amount of DAN on fluorescence intensity.

2.2.2 表面活性劑對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

選擇3種陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基溴化吡啶(CPB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)以及十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)探究其對(duì)硒測(cè)定體系熒光的影響。分別準(zhǔn)確移取4.00 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)加入5個(gè)錐形瓶中，按照實(shí)驗(yàn)方法，加熱冷卻后，分別加入3.00 mL環(huán)己烷，2.00 mL 1.0×10-5mol/L的CPB、CPC及DTAB萃取分液后，測(cè)量環(huán)己烷萃取液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同表面活性劑對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

由表1可以看到，在加入不同的陽(yáng)離子表面活性劑后，體系的熒光強(qiáng)度相較于不加表面活性劑都有一定程度的增強(qiáng)，其中加入CPB后，體系熒光強(qiáng)度的增加幅度最大。如圖3所示加入CPB后，體系熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其原因是添加表面活性劑后與熒光物質(zhì)形成了膠束，形成的膠束能增大體系的黏度，從而降低了在熒光反應(yīng)時(shí)的碰撞猝滅[10]。故實(shí)驗(yàn)選擇加入CPB為表面活性劑。

圖3 加CPB前后硒測(cè)定的熒光光譜Figure 3 The fluorescence spectra of Se determination before and after adding CPB.

2.2.3 溶液酸度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

由于熒光物質(zhì)自身為弱堿或弱酸，熒光強(qiáng)度隨分子和離子在不同酸度水平下平衡的變化而變化，因此按照實(shí)驗(yàn)方法，只改變體系的pH值，分別用鹽酸溶液(1+9)調(diào)節(jié)至pH = 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，其他條件不變，加入2.00 mL CPB溶液(1.0×10-5mol/L)，測(cè)量環(huán)己烷萃取液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)pH=2.0時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最大。故實(shí)驗(yàn)選擇溶液的pH值為2.0。

圖4 pH值對(duì)硒測(cè)定體系熒光強(qiáng)度的影響Figure 4 Effect of pH on fluorescence intensity.

2.2.4 水浴反應(yīng)溫度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，只改變水浴反應(yīng)溫度，分別在水浴溫度60、70、80、90、100 ℃下加熱10 min，其他條件不變，測(cè)量環(huán)己烷萃取液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明當(dāng)水浴溫度在70～90 ℃時(shí)，體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，在80 ℃ 下進(jìn)行水浴加熱時(shí)體系的熒光強(qiáng)度最高。故實(shí)驗(yàn)選擇水浴溫度為80 ℃。

圖5 水浴溫度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Figure 5 Effect of water bath temperature on fluorescence intensity.

按照實(shí)驗(yàn)方法，只改變水浴反應(yīng)時(shí)間，即在水浴溫度80 ℃下分別加熱5、10、15、20、25 min，其他條件不變，最后用環(huán)己烷萃取液測(cè)量溶液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)水浴反應(yīng)時(shí)間在5～10 min時(shí)，體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，反應(yīng)時(shí)間為10 min 時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最大。故實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為10 min。

圖6 水浴反應(yīng)時(shí)間對(duì)硒測(cè)定體系熒光強(qiáng)度的影響Figure 6 Effect of water bath time on fluorescence intensity.

2.3 穩(wěn)定性與干擾實(shí)驗(yàn)

2.3.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行硒測(cè)定體系的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，將環(huán)己烷萃取液分別在5、10、15、20、30、40、60 min 時(shí)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖7，表明在1 h內(nèi)體系的穩(wěn)定性良好。

圖7 硒測(cè)定體系的穩(wěn)定性Figure 7 The stability of Se determination.

2.3.2 干擾實(shí)驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定0.2 μg/mLSe(Ⅳ)，相對(duì)誤差≤±5%時(shí)，考察了Hg2+、Cu2+、Pb2+對(duì)硒測(cè)定的干擾，在高于50倍硒量的汞離子、銅離子及鉛離子存在量下不會(huì)對(duì)硒測(cè)定產(chǎn)生干擾。

2.4 硒測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別吸取0、0.20、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)，按照實(shí)驗(yàn)方法，得到硒測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖8所示，硒測(cè)定的線性范圍為0～0.067 μg/mL，其線性回歸方程If=1775c-0.3165，相關(guān)系數(shù)r=0.9991。進(jìn)行11次空白實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)偏差σ為3.81×10-2μg/mL，按照cL=3σ/k計(jì)算該方法檢出限為6.5×10-4μg/mL，表明該方法測(cè)定硒靈敏度較高。

圖8 硒測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 8 The standard curve of Se determination.

2.5 樣品分析

2.5.1 大米中硒含量的測(cè)定

通過(guò)電子商城等途徑采購(gòu)了三種產(chǎn)自不同地區(qū)不同品牌的富硒大米，分別測(cè)定其中的硒含量。如表2所示，來(lái)自湖北的1#富硒米中硒含量最高，為283 μg/kg，湖南的2#為182 μg/kg，來(lái)自黑龍江五常地區(qū)的最低，為126 μg/kg，但都達(dá)到了包裝上營(yíng)養(yǎng)成分表中關(guān)于硒含量的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)要求。

表2 不同種富硒米中硒含量

2.5.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在三種富硒大米消解后的樣品中加入不同量的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定硒含量，平行測(cè)定5次，計(jì)算其加標(biāo)回收率，結(jié)果如表3所示，三種樣品的回收率在87.8%～107%，均符合測(cè)定要求，方法可行。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

優(yōu)化了分子熒光光譜法測(cè)定痕量硒的實(shí)驗(yàn)條件，其最佳測(cè)定條件：水浴溫度 80 ℃下加熱10 min，pH值控制在2.0，DAN用量為3.00 mL、加入CPB陽(yáng)離子表面活性劑；硒測(cè)定的方法檢出限低，提高了測(cè)定硒的靈敏度；將該方法應(yīng)用于三種產(chǎn)自不同地區(qū)的富硒大米中痕量硒的測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%，表明測(cè)定結(jié)果良好。