寇曉梅，柯永莉，李燕

乳腺癌是起源于乳腺的惡性腫瘤，一般高發(fā)于40～55 歲的女性，是女性常見的惡性腫瘤［1］。乳腺癌的早期癥狀不太明顯，一旦被確診，該病一般已經(jīng)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況，嚴(yán)重地影響了患者的預(yù)后和生存情況［2］。乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，是多種因素共同作用的結(jié)果，且環(huán)境和遺傳因素發(fā)揮著主要作用，所以對(duì)于乳腺癌的早期診斷和治療非常重要。目前針對(duì)乳腺癌的治療主要有外科治療、化學(xué)治療、免疫治療和靶向治療等［3］，化學(xué)治療在乳腺癌治療方面仍然占據(jù)主要地位，但隨著療程的增加，化療的效果不再理想，乳腺癌化療成功的主要障礙就是化療耐藥。黃花蒿是一年生菊科草本植物，性寒、辛、味苦，主要用于瀉熱、消暑和汗等，在救治嚴(yán)重的腦型瘧疾方面具有迅速、高效、低毒和使用方便的優(yōu)點(diǎn)，是公認(rèn)的治療瘧疾藥物［4］。相關(guān)研究表明，青蒿素具有抗腫瘤、抗瘧疾、抗真菌和免疫調(diào)節(jié)等多種的中藥藥理作用，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［5］。但關(guān)于黃花蒿和乳腺癌耐藥方面的相關(guān)報(bào)道較少，所以本研究探討黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 增殖、侵襲和遷移作用的影響。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 購(gòu)買于武漢普諾賽生命科技有限公司，黃花蒿原草產(chǎn)于西安，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)買于北京康碧泉生物科技有限公司，胰蛋白酶購(gòu)買于天津市富宇精細(xì)化工有限公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Gibco 公司，瓊脂糖和RIPA 裂解液購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)研究公司。

1.2 藥物制備 將1.5 kg 糯米浸泡后，放入缸中，然后蒸熟，拌入0.15 kg 的生物菌，在上面撒上薄薄的一層酒藥，加蓋保溫，30 h 后釀液，降低缸內(nèi)溫度，促進(jìn)發(fā)酵，按照一定的比例倒入冷水、然后切塊和翻轉(zhuǎn)。48 h 后放入米3 kg，黃花篙末3 kg 和加曲拌勻0.05 kg，繼續(xù)發(fā)酵，再次加入微生物菌，96 h 后灌入小埕，扎好埕口，低養(yǎng)下發(fā)酵60 d，然后離心處理，過濾除菌，得到濃度為200 g/L 的酵解液備實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 制成細(xì)胞懸液，以1.5×109/L 接種于培養(yǎng)瓶中，在常溫下培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞的增長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度高達(dá)80%～90%時(shí)，棄原培養(yǎng)基，進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，凍存－80℃，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。將MCF-7/A 處理后細(xì)胞分為對(duì)照組、黃花蒿酵解液低劑量組（黃花蒿低劑量組）、黃花蒿酵解液中劑量組（黃花蒿中劑量組）和黃花蒿酵解液高劑量組（黃花蒿高劑量組），對(duì)照組不做任何處理，黃花蒿低劑量組中的MCF-7/A 細(xì)胞滴入10 g/L 的黃花蒿酵解液，黃花蒿中劑量組中的MCF-7/A 細(xì)胞滴入20 g/L 的黃花蒿酵解液，黃花蒿高劑量組中的MCF-7/A 細(xì)胞滴入30 g/L 的黃花蒿酵解液，黃花蒿酵解液作用于細(xì)胞72 h。

1.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)各組的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 增殖情況，MCF-7/A 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，分別在24、48、72 和96 h 將CCK-8 溶液添加到每個(gè)孔中，37℃下孵育1 h，記錄490 nm 的吸光度（OD）。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落 處理后的各組乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 調(diào)整為1.0×103個(gè)/孔置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，10 d 后采用結(jié)晶紫染色各組細(xì)胞，對(duì)大于50 個(gè)的細(xì)胞集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并采用倒置顯微鏡拍攝集落形成的情況。

1.6 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移 將各組處理后的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 以5×104個(gè)懸浮在無血清DMEM 培養(yǎng)基，在放入基底膜基質(zhì)涂層的transwell 小室，胰酶消化，加入200 μL 含10% FBS的培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將穿透細(xì)胞膜的細(xì)胞采用100%甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS 洗去浮色，曬干，隨機(jī)取3 個(gè)視野拍照，顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)量。取基質(zhì)膠（matrigel）冰盒放冰上融化，將各組處理后的MCF-7/A 細(xì)胞置于matrigel 的小室內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)MCF-7/A 細(xì)胞侵襲能力，具體見遷移步驟。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 軟件處理，計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A增殖能力的影響 與對(duì)照組相比，黃花蒿低劑量組、黃花蒿中劑量組和黃花蒿高劑量組中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 在48、72 和96 h 的增殖能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與黃花蒿低劑量組相比，黃花蒿高劑量組中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 在48、72 和96 h 的增殖能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A增殖能力的影響(± s)

表1 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A增殖能力的影響(± s)

注：與對(duì)照組比較aP＜0.05，與黃花蒿低劑量組比較bP＜0.05

細(xì)胞的增殖能力組別例數(shù)8 8 8 8給藥量（g/L）0 10 20 30 24 h 0.27±0.03 0.24±0.02 0.23±0.01 0.21±0.02 5.573 0.029對(duì)照組黃花蒿低劑量組黃花蒿中劑量組黃花蒿高劑量組F 值P 值96 h 0.91±0.17 0.83±0.14a 0.73±0.07a 0.52±0.08ab 8.213＜0.01 48 h 0.71±0.09 0.62±0.07a 0.53±0.04a 0.34±0.05ab 6.174＜0.01 72 h 0.85±0.14 0.79±0.11a 0.61±0.06a 0.47±0.07ab 7.16＜0.01

2.2 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A集落形成的影響 與對(duì)照組相比，黃花蒿低劑量組、黃花蒿中劑量組和黃花蒿高劑量組的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 細(xì)胞集落形成能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與黃花蒿低劑量組相比，黃花蒿高劑量組的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A細(xì)胞集落形成能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 集落形成的影響（± s）

表2 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 集落形成的影響（± s）

注：與對(duì)照組比較aP＜0.05，與黃花蒿低劑量組比較bP＜0.05

組別對(duì)照組黃花蒿低劑量組黃花蒿中劑量組黃花蒿高劑量組集落形成（CFU-E）649.53±20.12 511.41±17.83a 397.82±15.27a 273.51±10.49ab例數(shù)8 8 8 8給藥量（g/L）0 10 20 30

2.3 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A侵襲和遷移能力的影響 與對(duì)照組相比，黃花蒿低劑量組、黃花蒿中劑量組和黃花蒿高劑量組的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 侵襲和遷移能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與黃花蒿低劑量組相比，黃花蒿高劑量組的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 侵襲和遷移能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 侵襲和遷移能力的影響(± s)

表3 黃花蒿酵解液對(duì)乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 侵襲和遷移能力的影響(± s)

注：與對(duì)照組比較aP＜0.05，與對(duì)照組比較bP＜0.05

組別對(duì)照組黃花蒿低劑量組黃花蒿中劑量組黃花蒿高劑量組遷移數(shù)量（個(gè)/視野）119.57±10.26 98.69±8.63a 82.83±6.54a 46.94±3.75ab例數(shù)8 8 8 8給藥量（g/L）0 10 20 30侵襲數(shù)量（個(gè)/視野）142.37±15.39 129.82±12.63a 118.74±10.06a 61.93±5.92ab

3 討論

乳腺癌屬于乳腺部位的惡性腫瘤，主要分為2大類，乳腺導(dǎo)管癌和乳腺的小葉癌，女性的圍絕經(jīng)期、45～55 歲和65～70 歲的女性發(fā)病率較高［6］。隨著發(fā)病率的逐漸增高，乳腺癌已經(jīng)成為女性常見的、多發(fā)的惡性腫瘤，居于女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。盡管較高的發(fā)病率，但致死率相對(duì)來說較低，目前乳腺癌的治療已經(jīng)形成一套比較綜合的規(guī)范的治療體系。乳腺癌發(fā)生在乳腺腺上皮組織，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能與內(nèi)外源性激素、乳腺良性疾病、肥胖、遺傳、放射暴露等因素相關(guān)［7］。盡管乳腺癌可以通過手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向等手段治療，但仍然存在35%左右的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致死亡。

乳腺癌屬于一種異質(zhì)性高的惡性腫瘤，多線治療后分子分型會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致乳腺癌患者出現(xiàn)獲得性耐藥［8］。目前，乳腺癌的治療仍然是以化療為主，但治療的過程中仍有一部分乳腺癌患者面臨著多藥耐藥和無藥可用的窘境。靶向治療已經(jīng)成為乳腺癌治療的主要突破口，雖然靶向治療針對(duì)性強(qiáng)，效果好，但仍有部分患者出現(xiàn)較強(qiáng)的不良作用［9］，給臨床乳腺癌的治療帶來了一定的阻礙。所以尋找不良作用小的耐藥逆轉(zhuǎn)劑是目前迫切需要解決的問題。黃花蒿是一種草本菊科植物，黃花蒿的提取物能夠提高免疫力、抗病毒、殺菌和抗氧化等功效［10］。相關(guān)研究表明，青蒿素通過抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路活化誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用［11］，也有研究表明，青篙素衍生物可抑制宮頸癌細(xì)胞的體外增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的早期凋亡［12］。

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，低、中和高劑量的黃花蒿酵解液中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A在48、72 和96 h 的增殖能力明顯降低，與低劑量的黃花蒿酵解液相比，高劑量的黃花蒿酵解液中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 在48、72 和96 h 的增殖能力顯著降低。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中和高劑量的黃花蒿酵解液中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 細(xì)胞集落形成能力明顯降低。與低劑量的黃花蒿酵解液相比，高劑量的黃花蒿酵解液中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 細(xì)胞集落形成能力顯著降低。Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比低、中和高劑量的黃花蒿酵解液中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 侵襲和遷移能力明顯降低；與低劑量的黃花蒿酵解液相比，高劑量的黃花蒿酵解液中的乳腺癌耐藥物胞株MCF-7/A 侵襲和遷移能力增殖能力顯著降低。

綜上所述，隨著黃花蒿酵解液濃度的升高，MCF-7/A 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力逐漸降低。