劉 崢，易秋艷，劉 陽(yáng)（通信作者）

（1四川省藥品技術(shù)檢查中心<四川省疫苗檢查中心>藥品生產(chǎn)檢查組 四川 成都 610031）

（2四川省藥品檢驗(yàn)研究院<四川省醫(yī)療器械檢測(cè)中心>微生物室 四川 成都 610000）

利巴韋林滴眼液適用于單純皰疹病毒性角膜炎，利巴韋林為抗非逆轉(zhuǎn)錄病毒藥，不具有充分的抗菌作用，在生產(chǎn)過程中添加適量的抑菌劑可防止污染微生物而變質(zhì)。配方選擇抑菌劑時(shí)應(yīng)綜合考察其穩(wěn)定性、安全性、配伍可行性、抑菌效果等多方面的因素[1-3]。苯扎溴銨是滴眼劑生產(chǎn)中常用的抑菌劑。2020年版《中國(guó)藥典》[4]規(guī)定“抑菌劑的抑菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而變化，因此，應(yīng)驗(yàn)證成品制劑的抑菌效力在效期內(nèi)不因貯藏條件而降低?！北疚膶?duì)市售兩批含苯扎溴銨0.2%（V/V）的利巴韋林滴眼劑分別人工污染5種標(biāo)準(zhǔn)菌株，計(jì)算培養(yǎng)不同時(shí)間后存活菌數(shù)的常用對(duì)數(shù)值相對(duì)于初始值減少的量來(lái)測(cè)試滴眼劑對(duì)相應(yīng)菌株的抑菌效力。

1.資料與設(shè)備

1.1 一般資料

利巴韋林滴眼液，批號(hào)：200417，規(guī)格：8 mL:8 mg，生產(chǎn)單位：安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司。

利巴韋林滴眼液，批號(hào)：20190124，規(guī)格：8 mL:8 mg，生產(chǎn)單位：長(zhǎng)春長(zhǎng)慶藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

兩批滴眼液中抑菌劑苯扎溴銨的含量均為0.2%（V/V）。

1.2 試劑試藥

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，以下簡(jiǎn)稱TSA（批號(hào)190704）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，以下簡(jiǎn)稱SDA（批號(hào)200310）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)200310）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)180228）、pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)181026）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》[4]要求。

1.3 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌staphylococcus aureus[CMCC（B）26 003]第3代；表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis [CMCC（B）26 069]第3代；銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC（B）10 104]第3代；白色念珠菌Candida albicans[CMCC（F）98 001]第3代；黑曲霉Aspergillus niger[CMCC（F）98 003]第3代。來(lái)源均為中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買的0代凍干菌，自行傳代培養(yǎng)至所需代數(shù)。

1.4 設(shè)備

Thermo Class A Ⅱ生物安全柜、BINDER BD 720生物培養(yǎng)箱、BINDER KB 400生物培養(yǎng)箱、三鑫YXQ-WF32D壓力蒸汽滅菌鍋、IKA渦旋混合儀基本型MS3。

2.方法

2.1 存活菌數(shù)測(cè)定方法的確定

為準(zhǔn)確測(cè)定供試品中加入試驗(yàn)菌的存活菌數(shù)，應(yīng)進(jìn)行存活菌數(shù)測(cè)定方法適用性試驗(yàn)。取200417批及20190124批滴眼液按《中國(guó)藥典》[4]通則1105試驗(yàn)，回收率不得低于50%。

2.1.1 試驗(yàn)過程 實(shí)驗(yàn)共設(shè)四個(gè)組 試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組、供試品對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

試驗(yàn)組：細(xì)菌計(jì)數(shù)取原液、1:10、1:20、1:50供試液10 mL分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌三種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)（細(xì)菌計(jì)數(shù)用金黃色葡萄球菌進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)）。

真菌計(jì)數(shù)取供試品原液、1:10供試液10 mL分別加入白色念珠菌、黑曲霉兩種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。

菌液對(duì)照組：取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌三種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL分別加入白色念珠菌、黑曲霉兩種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。五種試驗(yàn)菌均平行制備2個(gè)平皿。

供試品對(duì)照組：細(xì)菌計(jì)數(shù)取原液、1:10、1:20、1:50供試液10 mL加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，充分混勻后，分別取1 mL置兩個(gè)直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。真菌計(jì)數(shù)取供試品原液10 mL、1:10供試液加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，充分混勻后，分別取1 mL置兩個(gè)直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。

陰性對(duì)照組：細(xì)菌計(jì)數(shù)取1 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置并按規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。真菌計(jì)數(shù)取1mlpH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置并按規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

2.1.2 試驗(yàn)結(jié)果 兩批樣品按《中國(guó)藥典》[4]方法試驗(yàn)，結(jié)果見表1、2。取原液、1:10、1:20供試液分別加金黃色葡萄球菌試驗(yàn)，回收率均小于50%，上述稀釋級(jí)供試液均不適用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；取原液加白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)，回收率均小于50%，原液不適用于真菌計(jì)數(shù)。另取1:50供試液加金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌試驗(yàn)，回收率均大于50%；另取1:10供試液加白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)，回收率均大于50%。

表1 200417批菌落計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果

計(jì)算公式：試驗(yàn)組菌回收率=［（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）÷菌液對(duì)照組菌落數(shù)］×100%。

表2 20190124批菌落計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果，存活菌數(shù)測(cè)定方法可確定為：按傾注法，取1:50供試液進(jìn)行細(xì)菌數(shù)的測(cè)定；取1:10供試液進(jìn)行真菌數(shù)的測(cè)定。兩批滴眼劑按此方法試驗(yàn)，5種標(biāo)準(zhǔn)菌的回收率均大于50%，方法成立。

2.2 抑菌效力測(cè)定方法

2.2.1 菌懸液的制備及濃度 取經(jīng)33 ℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨瓊脂平板，分別用一次性接種環(huán)刮取適量菌體至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成每1 mL含菌數(shù)約為108～109cfu的菌懸液。用傾注法測(cè)得菌懸液的濃度分別為4.2×109、2.2×109、8.4×108cfu/mL。取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂平板，用一次性接種環(huán)刮取適量菌體至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成每1 mL含菌數(shù)約為107cfu的菌懸液。用傾注法測(cè)得菌懸液的濃度為9.4×107cfu/mL。經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后用無(wú)菌吸管將孢子懸液吸出至無(wú)菌試管內(nèi)，加入適量的含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)約為107cfu的孢子懸液。用傾注法測(cè)得濃度為8.0×106cfu/mL。

2.2.2 供試品接種 按《中國(guó)藥典》[4]中<1121抑菌效力檢查法>規(guī)定，采取原位接種的方式，將試驗(yàn)菌直接接種于供試品容器中進(jìn)行試驗(yàn)，菌液的體積不超過供試品體積的1%。每批樣品取10支（8 mL/支）分別接種2.2.1的5種菌液（1×107～1×108cfu/mL）各80 μl，每種試驗(yàn)菌各接種2支，渦旋混勻，25 ℃避光放置。

3.結(jié)果

3.1 存活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果

分別在6 h、24 h、7 d、14 d、28 d取接種后25 ℃放置的滴眼劑按2.1確定的計(jì)數(shù)方法測(cè)定樣品中的存活菌數(shù)，以菌數(shù)變化情況評(píng)價(jià)其抑菌效力。計(jì)算每一種試驗(yàn)菌在供試品中的存活菌數(shù)，并換算成lg值，與供試品中0 h接種菌數(shù)的lg值或前一測(cè)定時(shí)間點(diǎn)存活菌數(shù)的lg值比較，計(jì)算經(jīng)過不同放置時(shí)間后的對(duì)數(shù)下降值，結(jié)果見表3、4。兩批樣品細(xì)菌組在接種6 h后活菌數(shù)減少的lg值均大于2，24 h后減少的lg值均大于3，至28 d均未恢復(fù)生長(zhǎng)；真菌組供試品在接種7 d后活菌數(shù)減少的lg值均大于2，至28 d均無(wú)增加趨勢(shì)。

表3 200417批接種后不同時(shí)間存活菌數(shù)cfu/mL及相對(duì)0 h減少值（lg）

表4 20190124批接種后不同時(shí)間存活菌數(shù)及減少值cfu/mL（lg）

4.討論

4.1 實(shí)驗(yàn)菌株的選擇

按《中國(guó)藥典》[4]要求，測(cè)試滴眼劑的抑菌效力應(yīng)選擇的標(biāo)準(zhǔn)菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌及黑曲霉四種?？紤]到在臨床上的檢出率，增加了表皮葡萄球菌[5]，故本試驗(yàn)共五種標(biāo)準(zhǔn)菌株。

4.2 結(jié)果判斷

兩批含苯扎溴銨0.2%（V/V）的利巴韋林滴眼液（批號(hào)：200417，20190124）參照《中國(guó)藥典》[4]，分別人工污染5種標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，測(cè)試在特定時(shí)間內(nèi)供試品對(duì)相應(yīng)菌株的抑制效力，結(jié)果試驗(yàn)的兩批利巴韋林滴眼液抑菌效力均能達(dá)到《中國(guó)藥典》[4]滴眼劑A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，符合在有效期內(nèi)長(zhǎng)期儲(chǔ)存的要求，見表5。

表5 滴眼液抑菌效力判斷