馬芬，文道林，黃宇飛，張咪咪，劉琛，張潤(rùn)玲，文鋮熹

(1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)檢驗(yàn)科，廣東深圳518107；2.深圳市光明區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東深圳518107；3.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東深圳518107)

地中海貧血(以下簡(jiǎn)稱“地貧”)是一組基因突變導(dǎo)致珠蛋白肽鏈生成障礙的遺傳性血液病，主要分布在東南亞、中東、北非和地中海地區(qū)[1]。我國(guó)長(zhǎng)江以南為高發(fā)區(qū)，廣西和廣東地區(qū)地貧基因攜帶率分別高達(dá)24.51%和11.07%[2]。該病無(wú)有效的治療方法，通過(guò)人群篩查對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷以防止重癥患兒的出生是當(dāng)前最有效的措施[3]。地貧主要分為α-地貧及β-地貧兩大類，其中α-地貧可引起致死性的 Hb Bart′s胎兒水腫綜合征或嚴(yán)重影響生命質(zhì)量的血紅蛋白H病(HbH病)[4]。地貧篩查已成為一項(xiàng)日常工作，為了提高地貧的檢出率，血紅蛋白電泳作為地貧的重要篩查手段已成為婚檢、孕檢必不可少的一項(xiàng)檢測(cè)。但血紅蛋白電泳對(duì)α-地貧的檢測(cè)效能不高，容易造成漏診或誤診。我們?cè)趯?shí)踐工作中發(fā)現(xiàn)，如結(jié)合血紅蛋白H包涵體檢測(cè)，可提高α-地貧篩查檢出率，特別是在防止罕見(jiàn)型α-地貧的漏檢中可起到重要作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2019年2月至2020年8月婚檢、孕檢人群平均紅細(xì)胞體積(MCV)<82 fL和/或平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)<27 pg，且葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)篩查陰性的標(biāo)本1 444例，經(jīng)血紅蛋白電泳后，按血紅蛋白A2(HbA2)的參考區(qū)間分為3組：HbA2升高組280例(HbA2>3.5%)，HbA2正常組490例(HbA2：2.5%～3.5%)，HbA2降低組674例(HbA2<2.5%)；

1.2儀器與試劑 Sysmex XN系列血液細(xì)胞分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)，Helena V8毛細(xì)管電泳儀及其配套試劑(美國(guó)Helena公司)，ABI2720擴(kuò)增儀、凱普HB2012A雜交儀及其配套地貧基因檢測(cè)試劑(潮州凱普公司)，Olympus生物顯微鏡(奧林巴斯公司)，新亞甲藍(lán)染液(珠海貝索公司)。

1.3方法 采集研究對(duì)象靜脈血，EDTA-K2抗凝，采用Sysmex XN系列血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)，選取MCV和/或MCH低于參考區(qū)間的標(biāo)本，用比值法篩查G6PD，并進(jìn)行血紅蛋白電泳，分析血紅蛋白A(HbA)、HbA2、血紅蛋白F(HbF)。EDTA-K2抗凝血與新亞甲藍(lán)染液按1∶2混合后37 ℃溫育1 h，推片鏡檢，油鏡下查找血紅蛋白H包涵體。采用PCR-導(dǎo)流雜交法檢測(cè)3種缺失型α-地貧(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3種非缺失型α-地貧(CS、QS、WS)及17種常見(jiàn)β-地貧突變。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血紅蛋白H包涵體形態(tài) 標(biāo)本染色后在顯微鏡下查找血紅蛋白H包涵體，鏡下可見(jiàn)血紅蛋白H包涵體呈顆粒狀，彌漫而均勻地分散在紅細(xì)胞內(nèi)。見(jiàn)圖1。

圖1 油鏡下的血紅蛋白H包涵體與網(wǎng)織紅細(xì)胞形態(tài)

2.2地貧基因及血紅蛋白H包涵體檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。1 444例MCV和/或MCH降低且G6PD篩查陰性的標(biāo)本中，血紅蛋白H包涵體檢測(cè)陽(yáng)性342例，其中確認(rèn)為α-地貧基因攜帶336例，約占98.2%(336/342)。

2.3α-地貧臨床類型與血紅蛋白H包涵體檢測(cè)結(jié)果 共檢出α-地貧基因攜帶481例(其中4例為HbA2升高的復(fù)合β-地貧)。336例血紅蛋白H包涵體陽(yáng)性標(biāo)本中，標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧300例，約占89.3%(300/336)。145例未檢出血紅蛋白H包涵體標(biāo)本中，靜止型α-地貧112例，約占77.2%(112/145)。HbA2正常且未檢出血紅蛋白H包涵體的樣本，5例均為靜止型，占該組100%(5/5)，HbA2降低且未檢出血紅蛋白H包涵體的樣本中，107例為靜止型，約占該組77%(107/140)。各組檢出α-地貧基因型別見(jiàn)表1。

表1 各組血紅蛋白H包涵體及α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果

2.4罕見(jiàn)型α-地貧基因 本研究中有2例標(biāo)本，1例HbA2正常，另1例HbA2降低，常規(guī)地貧基因檢測(cè)結(jié)果未檢出突變，表型篩查陽(yáng)性且血紅蛋白H包涵體檢測(cè)陽(yáng)性，經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)分析均確診為泰國(guó)型(--THAI)缺失α-地貧。

2.5血紅蛋白H包涵體篩查效能 以基因檢測(cè)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，分析血紅蛋白H包涵體對(duì)α-地貧篩查的效能，見(jiàn)表2。

表2 血紅蛋白H包涵體檢測(cè)對(duì)不同類型α-地貧篩查的效能(%)

3 討論

中國(guó)南方為地貧高發(fā)地區(qū)，目前廣泛實(shí)施的大規(guī)模人群防控已取得了實(shí)質(zhì)性效果,但如果沒(méi)有成熟的預(yù)防機(jī)制，仍然存在著地貧患兒增加的風(fēng)險(xiǎn)。在臨床實(shí)踐中，其表型篩查包含血細(xì)胞參數(shù)和血紅蛋白分析，以HbA2≥3.5%，對(duì)β-地貧篩查的敏感性和特異性可達(dá)到100.00%、99.33%[5]；但以HbA2≤2.5%,對(duì)α-地貧篩查的敏感性、特異性分別為：深圳地區(qū)89.5%、54.8%[6]，佛山順德地區(qū)60.5%、89.4%[7]，中山市育齡夫婦75.4%、72.0%[8]。部分α-地貧個(gè)體表現(xiàn)為HbA2水平正常，借助毛細(xì)管電泳法篩查α-地貧，敏感性和特異性均不佳。如果僅憑借血細(xì)胞分析和血紅蛋白電泳作為地貧初篩方法，α-地貧漏檢高于β-地貧。據(jù)此，如何將紅細(xì)胞參數(shù)結(jié)合其他血液學(xué)指標(biāo)，提高篩查的敏感性與準(zhǔn)確性，是地貧篩查臨床實(shí)踐中所面臨的具體問(wèn)題。

紅細(xì)胞H包涵體為不穩(wěn)定血紅蛋白、血紅蛋白H等異常血紅蛋白在紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)生沉淀形成的變性珠蛋白小體。在α-地貧中,由于α鏈減少，冗余的β鏈聚合、沉淀而形成血紅蛋白H包涵體，即β四聚體，可通過(guò)特殊染色后在顯微鏡下觀察到。血紅蛋白H包涵體一般溫育1 h就可出現(xiàn)，而其他不穩(wěn)定血紅蛋白形成包涵體需溫育更長(zhǎng)時(shí)間(3 h或更長(zhǎng))，HbH病(中間型α-地貧)血紅蛋白H包涵體可為1～3+，標(biāo)準(zhǔn)型(輕型α-地貧)血紅蛋白H包涵體多為偶見(jiàn)。在臨床工作中，多數(shù)患者的血紅蛋白H包涵體含量很低，約占紅細(xì)胞總數(shù)的1/100 000，易造成假陰性結(jié)果[9]，鑒于此，很多醫(yī)院已不再進(jìn)行血紅蛋白H包涵體的檢測(cè)。但本研究結(jié)果表明，經(jīng)典的血紅蛋白H包涵體檢測(cè)對(duì)α-地貧篩查的意義明顯，結(jié)合血紅蛋白H包涵體檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧篩查的敏感性達(dá)90.1%，特異性可達(dá)99.8%。

HbA2>3.5%通常提示為β-地貧，如有血紅蛋白H包涵體的檢出可提示復(fù)合α-地貧。本研究中，4例HbA2升高的α-/β-復(fù)合地貧中，即有3例檢出H包涵體，充分說(shuō)明了包涵體檢測(cè)對(duì)α-地貧篩查的重要意義。靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧攜帶者的HbA2正?；蚪档筒幻黠@，通常不能作為篩查的特異性參數(shù)[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，HbA2對(duì)靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧的篩查存在較多漏檢，不宜單純依靠HbA2結(jié)果進(jìn)行α-地貧篩查[11]。本研究結(jié)果表明，HbA2正常組，結(jié)合血紅蛋白H包涵體檢測(cè)對(duì)α-地貧診斷的敏感性可達(dá)90.6%，大大提高α-地貧特別是標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧的篩查陽(yáng)性率。

目前，基因檢測(cè)是診斷地貧的金標(biāo)準(zhǔn)[12-13]，但常規(guī)商業(yè)化試劑盒只包含了常見(jiàn)的突變類型，罕見(jiàn)變異或未知突變的漏檢率約為2%[14]。對(duì)有地貧表型卻未檢出地貧基因突變的標(biāo)本，則需根據(jù)標(biāo)本的表型參數(shù)特征而進(jìn)一步的檢測(cè)分析。由此可見(jiàn)，根據(jù)表型與基因型一致的地貧診斷原則，有助于判定基因診斷的準(zhǔn)確性，也有助于指導(dǎo)罕見(jiàn)或少見(jiàn)地貧基因的進(jìn)一步檢測(cè)分析。本研究中，有2例標(biāo)本為地貧表型而未檢出試劑盒所包含范圍的地貧基因，血紅蛋白H包涵體陽(yáng)性，經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)確診為α-地貧泰國(guó)型缺失攜帶者。據(jù)此，如檢出血紅蛋白H包涵體的未知標(biāo)本，基因檢測(cè)即可重點(diǎn)聚焦α-地貧基因，為基因檢測(cè)提供方向。

綜上，在當(dāng)前血常規(guī)紅細(xì)胞參數(shù)檢測(cè)、血紅蛋白組分電泳分析的表型篩查常規(guī)應(yīng)用情況下，結(jié)合血紅蛋白H包涵體的檢測(cè)，可明顯提高表型篩查的敏感性與特異性，為后續(xù)的基因檢測(cè)提供更全面、更有價(jià)值的參考信息。但血紅蛋白H包涵體在大多數(shù)的α-地貧患者外周血中含量非常低，查找血紅蛋白H包涵體需要檢驗(yàn)人員具備耐心和責(zé)任心。