錢 紅 朱文波 陶月 寧明哲 戴 蕾▲

1.南京鼓樓醫(yī)院集團宿遷醫(yī)院檢驗科，江蘇宿遷 223800；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 210008

抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）是抗所有核酸和核蛋白抗體的總稱，包括細胞核、細胞漿、細胞骨架、細胞分裂周期中產(chǎn)生的某些成分等[1-2]。 抗核抗體的類型及滴度高低對疾病的診斷與鑒別診斷、病情評估、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷等都起著重要的作用[3-6]。目前， 國內(nèi)外對ANA 檢測推薦使用的方法為間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）[7-8]。 而對于IIF 結(jié)果的判讀，雖然已經(jīng)在向自動化探索，但國內(nèi)大多數(shù)實驗室依然采用經(jīng)典的人工閱片。如同一標本細胞核內(nèi)同時存在多種熒光模型，對于每個熒光模型的判斷及其滴度的判斷就很容易受到互相的干擾，甚至出現(xiàn)較強的熒光模型遮蓋另一種較弱的熒光模型的情況發(fā)生，從而導(dǎo)致最終結(jié)果判讀的不準確。 本文通過對細胞核復(fù)合核型進行稀釋后重新判讀結(jié)果，旨在提高結(jié)果的準確性，從而為臨床提供更確切的診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測對象

采集2019年6月至8月南京鼓樓醫(yī)院門診及住院患者共計8460 份ANA 標本，從中選取初篩為細胞核復(fù)合核型的56 例標本，10 例細胞核單核型標本。56 例細胞核復(fù)合核型患者中，男8 例，女48 例；年齡15～77 歲，平均（47.2±17.4）歲；10 例細胞核單核型患者中，男1 例，女9 例；年齡24～83 歲，平均（45.8±17.6）歲。 患者于抽血后2 h 內(nèi)送至檢驗科，當天分離血清后檢測。

1.2 儀器與試劑

EUROLineMaster Plus-A 全自動免疫印跡儀、Sprinter XL 全自動間接免疫熒光操作/酶聯(lián)免疫一體機均由歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司生產(chǎn)，抗核抗體免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）檢測試劑盒（間接免疫熒光法；批號：CD190429AA）、抗核抗體譜（IgG）檢測試劑盒（免疫印跡法；批號：CF190604AC）均購自杭州歐蒙醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3 檢測方法

將收集的研究標本，收集當天即分別按照1∶100、1∶1000、1∶10 000 稀釋，操作步驟嚴格按照廠家提供的說明書進行，檢測后，在EUROStar III Plus 熒光顯微鏡下（40×物鏡）觀察檢測結(jié)果。 激發(fā)濾片：488 nm；分光濾鏡：510 nm；阻擋濾鏡：520 nm。 所有熒光顯微鏡判讀結(jié)果均由1 名副主任技師和1 名主管技師共同閱片完成。抗核抗體譜（IgG）試劑盒檢測完成后，將檢測膜條放置在結(jié)果判定模板中，風干后判讀結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 10 例細胞核單核型標本稀釋后熒光模式分析

稀釋前后的熒光核型及滴度完全一致， 見圖1（封三）。

2.2 56 例細胞核復(fù)合核型標本抗核抗體譜結(jié)果及稀釋后熒光模型分析

56 例細胞核復(fù)合核型標本抗核抗體譜結(jié)果及稀釋后熒光模型分析見表1～2、圖2～3（封三）。

圖2 稀釋前后的熒光核型及滴度均有改變舉例（400×）

圖3 稀釋前后的熒光核型無變化，滴度有改變舉例（400×）

表1 核型變化及抗核抗體譜結(jié)果

表2 滴度變化

3 討論

抗核抗體的檢測方法有很多種，包括IIF 法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence im munoassay，CLIA）等，且不同的檢測方法具有各自的優(yōu)缺點[9-11]。 ELISA 的優(yōu)點是容易操作、標準化、定量檢測及敏感性高等；缺點是需要對每項自身抗體進行逐一檢測。 CLIA 的優(yōu)點是敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等；缺點是檢測成本高、需對每個自身抗體進行逐一檢測，速度慢。 而Hep-2 細胞屬于人來源培養(yǎng)細胞，含大約100～150 種自身抗體，細胞核大、細胞結(jié)構(gòu)清晰、易于結(jié)果觀察及核型分析，被美國風濕病學(xué)會譽為ANA 檢測的“金標準”[12]。雖然IIF 結(jié)果的判讀已有自動化趨勢[13-15]，但目前國內(nèi)對于IIF 的結(jié)果判讀臨床應(yīng)用最廣泛的依然是人工方法。由于每個實驗室的熒光顯微鏡、操作人員的專業(yè)背景以及經(jīng)驗積累的差異，又缺乏標準化的操作程序，會造成主觀判斷的標準不同，從而影響結(jié)果的準確性和重復(fù)性[16-17]。

本研究的10 例細胞核單核型標本， 稀釋前后核型及滴度均無變化，說明對單核型樣本的判斷是準確的。 而56 例細胞核復(fù)合核型標本， 就核型和滴度分析，雖然大部分與稀釋前相同，但仍出現(xiàn)部分核型增多或減少、滴度升高或降低的情況。

核型增多的8 例中，1 例稀釋前判讀為細胞核細顆粒斑點型， 稀釋后判讀為細胞核細顆粒斑點型、細胞核均質(zhì)型，其原因可能是細顆粒斑點型熒光強度大于均質(zhì)型，稀釋前分裂期細胞濃縮染色體區(qū)域熒光較外周弱，但稀釋后濃縮染色體區(qū)域熒光增強，故判斷均質(zhì)型陽性， 與抗核抗體譜中dsDNA、NUC、Hi 陽性相關(guān)。 2 例稀釋前判讀為細胞核均質(zhì)型，稀釋后判讀為細胞核細顆粒斑點型、細胞核均質(zhì)型，其原因可能是均質(zhì)型熒光強度大于細顆粒斑點型，稀釋前受分裂期細胞濃縮染色體熒光干擾導(dǎo)致誤判，稀釋后可見細胞間期核內(nèi)除均勻熒光外也可見顆粒熒光，故判斷細胞核細顆粒斑點型陽性， 與抗核抗體譜中SSA、SSB陽性相關(guān)。 1 例稀釋前判讀為細胞核粗顆粒斑點型，稀釋后判讀為細胞核粗顆粒斑點型、著絲點型，其原因可能是分裂間期細胞核中粗顆粒熒光影響，而分裂期細胞濃縮染色體區(qū)域也有顆粒干擾，無法辨認著絲點存在，但稀釋后在分裂期細胞濃縮染色體中可見帶狀的濃縮點狀熒光，故判斷著絲點型陽性，與抗核抗體譜中CENP-B 陽性相關(guān)。 3 例稀釋前判讀為細胞核細顆粒斑點型， 稀釋后判讀為細胞核細顆粒斑點型、核仁型，其原因可能為細顆粒型熒光較強，只有部分核仁呈現(xiàn)陽性， 符合細顆粒斑點型熒光模型特征，但標本為1∶1000 稀釋時，核仁均呈現(xiàn)熒光染色，故判斷核仁型陽性。 1 例稀釋前判讀為細胞核細顆粒斑點型、核膜型，稀釋后判讀為細胞核細顆粒斑點型、核膜型、核點型，其原因可能為稀釋前誤將核點認作核中細顆粒樣熒光，該標本1∶10 000 稀釋時，細胞核細顆粒斑點型已看不見，核點依然可見，故判斷核點型陽性。

核型減少的3 例中，1 例稀釋前判讀為細胞核細顆粒斑點型、核膜型、胞漿網(wǎng)狀/線粒體型，稀釋后判讀為細胞核細顆粒斑點型、胞漿網(wǎng)狀/線粒體型，其原因可能是胞漿中顆粒附著在細胞核周圍形成熒光導(dǎo)致誤判，稀釋后逐一觀察，與其熒光模型特征不符，最終判斷核膜型陰性，稀釋后判讀模型與抗核抗體譜結(jié)果RO-52、AMA-M2 陽性相關(guān)。 2 例稀釋前判讀為細胞核細顆粒斑點型、細胞核均質(zhì)型，稀釋后判讀為只有細胞核細顆粒斑點型， 其原因可能是分裂期細胞濃縮染色體外周區(qū)熒光太強， 誤判為濃縮染色體區(qū)域有熒光， 稀釋后分裂期細胞濃縮染色體外周區(qū)熒光減弱，可見濃縮染色體無熒光，故判斷均質(zhì)型陰性，稀釋后判讀模型與抗核抗體譜結(jié)果SSA、SSB 等陽性相關(guān)。

滴度升高的23 例中，當細胞核中同時存在多種熒光模型時，稀釋前可能出現(xiàn)熒光較強的核型遮蓋熒光較弱的核型的情況出現(xiàn)， 而隨著稀釋度的增加，這種遮蓋效應(yīng)會減弱，被遮蓋的核型也顯示出來。 也有報道IIF 檢測高滴度的ANA 樣本在低稀釋度時容易產(chǎn)生前帶效應(yīng)，造成1∶100 稀釋時熒光亮度反而弱于1∶1000 稀釋時熒光亮度[18]。

滴度降低的8 例中，當細胞核細顆粒斑點型（或粗顆粒斑點型）和細胞核均質(zhì)型同時存在于細胞核時，間期細胞核均表現(xiàn)為陽性，可導(dǎo)致熒光疊加造成滴度判讀偏高。當細胞核細顆粒斑點型（或均質(zhì)型）和核仁型同時存在時， 兩種核型表現(xiàn)為不同強度熒光，據(jù)此判斷滴度時，可能將熒光強度較強的模型滴度判讀偏高。

綜上所述，在讀片時，若只做一個稀釋度（1∶100），其余結(jié)果的判讀就需要依靠工作人員的經(jīng)驗。實際臨床工作中，受限于檢測周轉(zhuǎn)時間、成本控制等，目前大多數(shù)醫(yī)院在檢測ANA 時，只做一個稀釋度，這樣易造成漏讀、錯判。只做一個稀釋度時，對單核型的判斷影響不大；但對部分細胞核復(fù)合核型中核型及滴度的判斷會造成影響。所以，當出現(xiàn)細胞核復(fù)合核型時，可以通過稀釋的方法來協(xié)助判斷。