吳燁 ，劉曉迪 ，許燕妮 ，羅葆明 *

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除是其早期比較理想的治療手段；大多數(shù)肝癌起病隱襲，早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)多失去手術(shù)時(shí)機(jī)，介入和消融療效有限，往往需要聯(lián)合放療、化療等方式進(jìn)行綜合治療［1］。然而中晚期肝癌的化療效果有限，尤其是對(duì)于索拉非尼耐藥進(jìn)展后的肝細(xì)胞癌［2］。

二線藥物瑞戈非尼（Regorafenib）是一種多靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑，可抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和抑制腫瘤細(xì)胞增殖。瑞戈非尼的問世，較索拉菲尼增加了 2.8 個(gè)月生存期［3］，顯著提高了生存率。但瑞戈非尼的不良反應(yīng)較重，56%的患者發(fā)生3 級(jí)不良反應(yīng)，11%的患者發(fā)生4 級(jí)不良反應(yīng)，以高血壓、手足綜合征、肝毒性、血液學(xué)毒性為主，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［3］。研究表明［4］，不良反應(yīng)與治療劑量有相關(guān)性。因此，如何減少瑞戈非尼劑量、增加瑞戈非尼療效是肝癌研究者關(guān)注的問題。

近年來，多個(gè)研究報(bào)道腫瘤代謝可調(diào)控抗腫瘤藥物的療效［5-7］。從飲食中去除氨基酸、絲氨酸和甘氨酸可以重塑腫瘤代謝、調(diào)節(jié)癌癥結(jié)果［8，9］。其中，甲硫氨酸（Methionine）是一種必需氨基酸，是人類血漿中發(fā)現(xiàn)的最易變的代謝物［10］，在哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)合成、DNA 甲基化和多胺合成中具有關(guān)鍵作用。有研究顯示，癌癥患者減少膳食甲硫氨酸可減緩腫瘤進(jìn)展。生長培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分對(duì)癌細(xì)胞代謝的影響顯著［11］。因此，本研究在體外水平，通過缺乏甲硫氨酸的培養(yǎng)基模擬甲硫氨酸限制來探討其是否增加瑞戈非尼的藥物敏感性，為臨床減少瑞戈非尼劑量，改善患者生活質(zhì)量、提高有效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系 Hepa?G2 和 Huh7 購自 ATCC。Hepa?G2 和 Huh7 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組用 DMEM（Gibco）培養(yǎng)基或缺乏甲硫氨酸的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均用含10%FBS（Gibco）和1%青霉素及鏈霉素（Hyclone）的完全培養(yǎng)基置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖和IC50 測定

取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞消化后按5×103細(xì)胞種于96 孔板中，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日根據(jù)分組分別換成正常完全培養(yǎng)基組、正常完全培養(yǎng)基+藥物組，甲硫氨酸缺乏的完全培養(yǎng)基組，甲硫氨酸缺乏的完全培養(yǎng)基+藥物組，根據(jù)文獻(xiàn)提示［12］，設(shè)置藥物組的濃度梯度為0，1 nM，10 nM，100 nM、1 μM、10 μM、100 μM、1 mM；培養(yǎng)72 h。通過CCK8 檢測瑞戈非尼對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。使用100 μL 20%CCK8 37 ℃避光孵育2 h，利用吸收光酶標(biāo)儀（CMAX PLUS）在波長為450 nm處讀取吸光值。使用GraphPad Prism 8.0 計(jì)算IC50進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將不同分組處理72 h 后的細(xì)胞以2000 細(xì)胞數(shù)種于六孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~14 天。取出用PBS 清洗一遍后用4%多聚甲醛室溫固定20 min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色20 min，PBS清洗、37 ℃烘箱風(fēng)干后拍攝并對(duì)細(xì)胞克隆團(tuán)計(jì)數(shù)。

1.4 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞消化后按1.5×105細(xì)胞種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后換上雙無培養(yǎng)基饑餓處理24 h，分組處理細(xì)胞48 h 后收集細(xì)胞，離心棄去培養(yǎng)基，PBS重懸1000 r/min 離心清洗一次，再用0.2 mL PBS 將細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，預(yù)制冷70%冰乙醇2 mL 混勻固定4 ℃過夜。次日離心棄去上清，再PBS重懸后離心清洗一遍。細(xì)胞沉淀加入 50 μL RNA 酶、450 μL PI 染色液，必要時(shí)200 目尼龍網(wǎng)過濾黏連細(xì)胞后4 h 內(nèi)進(jìn)行流式（BD FACSVerseTM）細(xì)胞檢測。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞消化后按1.5×105細(xì)胞種于6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后處理細(xì)胞72 h 后收集每組細(xì)胞和上清死細(xì)胞，離心后2 mL PBS 重懸清洗一遍。用試劑盒專用Binding Buffer 400 μL 重懸細(xì)胞，分取一管細(xì)胞不加染料為空白對(duì)照管，其余每管加5 μL FITC Annexin V 混勻，避光孵育 15 min 后再加 10 μL/管 PI 試劑，立即進(jìn)行流式（BD FACSVerseTM）細(xì)胞檢測。

1.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測

收集細(xì)胞，PBS 清洗一遍后重懸于0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 mL JC?1 染色工作液，混勻后37 ℃孵育20 min。600 g 4 ℃離心3~4 min，按照說明書（碧云天C2006）用配制的JC?1 染色緩沖液洗滌2 次，再用適量JC?1 染色緩沖液重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞分析，接收波長為綠光529 nm 和紅光590 nm。

1.7 細(xì)胞脂質(zhì)體過氧化檢測

按照說明書（Ab243377）向細(xì)胞中加入脂質(zhì)過氧化傳感器使之稀釋為1X，用H2O2（1M，4000×）處理細(xì)胞使終濃度為~250 μM（1×）作為陽性對(duì)照，于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，棄去上清，DPBS清洗3遍收集細(xì)胞并用適量體積重懸，2 h內(nèi)通過FITC/PE通道進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，并使用軟件SPSS 21.0.0和GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 甲硫氨酸缺乏降低瑞戈非尼在肝癌細(xì)胞系的IC50 值

采用CCK8檢測瑞戈非尼在兩種細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下72 h 的IC50 值。HepG2 細(xì)胞系在正常培養(yǎng)基中，瑞戈非尼的IC50是5.78 μM，但在甲硫氨酸缺乏培養(yǎng)基中，IC50 顯著降低為1.32 μM（P=0.01）（圖1A）。在Huh7 細(xì)胞系中，甲硫氨酸缺乏培養(yǎng)基較正常培養(yǎng)基IC50 顯著降低（9.10 μM，3.22 μM，P=0.005）。因此，甲硫氨酸缺乏能夠顯著增加瑞戈非尼在這兩種肝癌細(xì)胞中的敏感性。

圖1 甲硫氨酸缺乏協(xié)同瑞戈非尼抑制人肝癌細(xì)胞系增殖能力

2.2 甲硫氨酸缺乏聯(lián)合瑞戈非尼顯著降低肝癌細(xì)胞系的增殖能力

探索甲硫氨酸缺乏或/和瑞戈非尼對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖能力的影響，結(jié)果顯示，在HepG2和Huh7 細(xì)胞系中，甲硫氨酸缺乏培養(yǎng)基不影響HepG2 和Huh7 細(xì)胞系的增殖（P>0.05）（圖1B）。瑞戈非尼分別在0.1 μM 和1 μM 濃度下，無法顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，但在甲硫氨酸缺乏培養(yǎng)基中，瑞戈非尼能夠顯著抑制HepG2 細(xì)胞系和Huh7 細(xì)胞系的增殖（>50%）。同時(shí)，平板克隆實(shí)驗(yàn)也顯示了相同的結(jié)果（圖1C）。結(jié)果提示，甲硫氨酸缺乏本身對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖無顯著影響，但聯(lián)合瑞戈非尼能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

2.3 甲硫氨酸缺乏對(duì)瑞戈非尼介導(dǎo)肝癌細(xì)胞系的凋亡水平和細(xì)胞周期的影響

分析甲硫氨酸是否影響肝癌細(xì)胞系的凋亡水平。在HepG2 細(xì)胞系中，瑞戈非尼和甲硫氨酸缺乏均可增加細(xì)胞晚期凋亡水平，在甲硫氨酸缺乏培養(yǎng)基中加入瑞戈非尼可進(jìn)一步增加細(xì)胞凋亡水平（圖2）。而在Huh7 細(xì)胞系中，單獨(dú)使用瑞戈非尼或甲硫氨酸缺乏無法顯著增加細(xì)胞系凋亡水平，但甲硫氨酸缺乏聯(lián)合瑞戈非尼可顯著增加細(xì)胞凋亡水平。

圖2 甲硫氨酸缺乏協(xié)同瑞戈非尼誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系凋亡

分析甲硫氨酸缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響，結(jié)果提示（圖3），甲硫氨酸缺乏和瑞戈非尼不影響HepG2 細(xì)胞系的細(xì)胞周期，但在Huh7 細(xì)胞系中，兩者在抑制細(xì)胞周期上起到一定的協(xié)同作用。

圖3 甲硫氨酸缺乏和或瑞戈非尼對(duì)人肝癌細(xì)胞系影響的周期實(shí)驗(yàn)

2.4 甲硫氨酸缺乏增加瑞戈非尼對(duì)線粒體功能的影響

為了進(jìn)一步探索甲硫氨酸缺乏聯(lián)合瑞戈非尼抑制肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，本研究初步探索了甲硫氨酸缺乏聯(lián)合瑞戈非尼對(duì)HepG2 線粒體膜電位影響。結(jié)果提示，瑞戈非尼和甲硫氨酸缺乏均能夠降低線粒體膜電位；同時(shí)，甲硫氨酸缺乏聯(lián)合瑞戈非尼表現(xiàn)出協(xié)同作用，顯著下調(diào)線粒體膜電位（圖4A）。進(jìn)一步檢測細(xì)胞脂質(zhì)過氧化情況，結(jié)果顯示瑞戈非尼和甲硫氨酸均可增加細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平（圖4B），但瑞戈非尼聯(lián)合甲硫氨酸缺乏對(duì)脂質(zhì)過氧化并無協(xié)同作用。

圖4 甲硫氨酸缺乏和或瑞戈非尼對(duì)人肝癌細(xì)胞線粒體功能的影響

3 討 論

甲硫氨酸是蛋白質(zhì)合成的基本氨基酸之一，參與細(xì)胞生長代謝的多個(gè)過程，如組蛋白修飾、葉酸循環(huán)、多胺代謝等；同時(shí)，甲硫氨酸參與細(xì)胞內(nèi)多種生化反應(yīng)，包括參與合成半胱氨酸和谷胱甘肽影響氧化、還原平衡、為甲基化反應(yīng)提供甲基來源等［13］。多項(xiàng)研究也表明，甲硫氨酸在腫瘤細(xì)胞中也發(fā)揮重要的作用［14］，如：甲硫氨酸限制攝入與細(xì)胞毒性化療藥物存在協(xié)同抗腫瘤作用［15］；甲硫氨酸參與腫瘤耐藥調(diào)控［16］，其代謝途徑抑制劑可逆轉(zhuǎn)胰腺癌吉西他濱耐藥等［17］。本研究發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸缺乏能夠顯著增加瑞戈非尼的抗腫瘤效果，從體外水平證明了甲硫氨酸缺乏能夠顯著增加肝癌細(xì)胞系對(duì)瑞戈非尼的敏感性。

另外本研究也發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸缺乏和瑞戈非尼均可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)但并無協(xié)同作用，提示兩者聯(lián)合作用存在除此之外的其他誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的途徑。近年研究者們［18］提出，肝癌細(xì)胞分為肝癌上皮來源細(xì)胞系和間充質(zhì)肝癌細(xì)胞，而肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）決定了肝癌對(duì)甲硫氨酸限制的敏感性；使用缺乏甲硫氨酸的培養(yǎng)基會(huì)選擇性殺死與正常細(xì)胞共培養(yǎng)的甲硫氨酸依賴型癌細(xì)胞［19］，HepG2、Huh7 細(xì)胞系作為高表達(dá)HNF4α 的上皮肝癌細(xì)胞系對(duì)甲硫氨酸限制引起的細(xì)胞死亡較HNF4α 陰性細(xì)胞具有較弱的抵抗力，并且甲硫氨酸/胱氨酸限制使上皮而非間充質(zhì)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感；同時(shí)，甲硫氨酸限制也迅速降低谷胱甘肽（GSH）水平，而瑞戈非尼也能通過降低胞內(nèi)GSH 水平協(xié)同GPX4 抑制劑促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡［20］；本研究結(jié)果也表明，甲硫氨酸限制和瑞戈非尼均能夠使胞線粒體膜電位下降，提示可能通過影響氧化還原失衡、能量代謝不足而引起細(xì)胞死亡［21］，但仍需要更多證據(jù)證兩者對(duì)證明線粒體氧化還原和能量代謝功能的影響。另外，兩者聯(lián)合對(duì)兩種細(xì)胞系的細(xì)胞周期生長方面的影響存在差異，提示其對(duì)不同細(xì)胞作用可能存在差異。

綜上所述，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了甲硫氨酸限制協(xié)同瑞戈非尼在殺傷肝癌HepaG2 和Huh7 細(xì)胞系和抑制細(xì)胞增殖方面，為減低瑞戈非尼臨床劑量、提高藥效提供理論依據(jù)。