趙 鳳， 楊宏榮， 王賢文， 才讓卓瑪， 曾詩(shī)雨，楊 星， 張美彥， 趙振新， 張效平

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴州 貴陽(yáng)550025；3.錦屏縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局，貴州 錦屏 556700； 4.赫章縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 畢節(jié) 553207)

0 引言

【研究意義】腌魚(yú)是貴州黔東南苗族侗族自治州的傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品，也是地理標(biāo)志產(chǎn)品，其味道鮮美，口感軟嫩，可直接食用，也可蒸、炸后食用，是當(dāng)?shù)鼐用裾写腿说拿牢都央萚1]。東南亞和非洲等地也有發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品的制作與食用[2-3]。傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)在自然條件下經(jīng)微生物的發(fā)酵作用而成，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生生物胺類(lèi)物質(zhì)，過(guò)量則會(huì)導(dǎo)致頭暈惡心及中毒[4-5]。發(fā)酵肉制品中，生物胺的積累主要是環(huán)境中的微生物通過(guò)氨基酸脫羧反應(yīng)或胺化作用下進(jìn)一步分解形成[6-7]，而游離氨基酸的產(chǎn)生主要是通過(guò)微生物將蛋白質(zhì)分解成短肽，然后肽在酶的作用下形成[8-9]。因此，弄清發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品中生物胺和游離氨基酸的相關(guān)性，對(duì)腌魚(yú)制作過(guò)程中的發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵工藝及產(chǎn)品的質(zhì)量調(diào)控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，關(guān)于發(fā)酵魚(yú)制品的研究主要集中在風(fēng)味形成機(jī)制、影響因素等方面。JIANG等[10]研究表明，不同品種魚(yú)類(lèi)制備的傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)露產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)含量不同。ZENG等[11]研究了添加鹽對(duì)發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品風(fēng)味的影響。KANNO等[12]研究了添加微生物對(duì)發(fā)酵魚(yú)露風(fēng)味品質(zhì)的影響。【研究切入點(diǎn)】未見(jiàn)關(guān)于侗族腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中生物胺與游離氨基酸的相關(guān)性的研究報(bào)道。以傳統(tǒng)發(fā)酵腌魚(yú)為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法研究腌魚(yú)整個(gè)發(fā)酵階段的生物胺和游離氨基酸的相關(guān)性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探明腌魚(yú)整個(gè)發(fā)酵階段的生物胺與游離氨基酸的相關(guān)性及生物胺的形成機(jī)理，以期為腌魚(yú)生產(chǎn)的發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵工藝及產(chǎn)品的質(zhì)量調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試魚(yú) 稻田綜合種養(yǎng)高背鯉魚(yú)，由貴州裕和農(nóng)產(chǎn)品有限公司養(yǎng)殖基地提供。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)熱電儀器公司生產(chǎn)；高效液相色譜，美國(guó)Waters公司生產(chǎn)；精密電子天平，梅特勒-托利多公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及工藝流程 取鮮活的稻田養(yǎng)殖高背鯉魚(yú)從背部剖開(kāi)，去內(nèi)臟，用水沖洗干凈，鹽腌2～3 d，瀝干水分至60%左右，各種香辛料(辣椒、花椒、姜等)與發(fā)酵的糯米攪拌均勻，裹到魚(yú)腹內(nèi)，在容器的底部鋪上部分糯米，按1層魚(yú)1層糯米粉，壓緊，頂部鋪上1層糯米后夯實(shí)，加蓋，封嚴(yán)，自然條件下發(fā)酵35～42 d，pH至4.1～4.4即發(fā)酵成熟。工藝流程為新鮮鯉魚(yú)→宰殺→腌制→發(fā)酵→成品。

1.2.2 樣品采集 選擇新鮮、腌制、發(fā)酵10 d、發(fā)酵20 d、發(fā)酵30 d、發(fā)酵40 d和發(fā)酵50 d 7個(gè)時(shí)期的腌魚(yú)樣品，為縮小個(gè)體間的差異，采集背部肌肉作為研究樣品；3次重復(fù)。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 利用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)腌魚(yú)傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中生物胺和游離氨基酸的含量。

1) 生物胺。取 5 g絞碎的魚(yú)肉于50 mL離心管中，參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行前處理。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：35℃；進(jìn)樣量5 μL，波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.4 mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 生物胺的梯度洗脫程序

2) 游離氨基酸。分別取新鮮樣品及冷凍樣品2 g加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的三氯乙酸，勻漿，靜置2 h，10 000 r/min離心15 min，取離心后的液體，5 mL用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 2.0，然后定容至10 mL，搖勻，過(guò)0.22 μm膜后上機(jī)測(cè)定，3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中的生物胺含量

從表2看出，新鮮魚(yú)肉中不同生物胺含量及總胺含量均較低，各生物胺含量為1.34～12.80 mg/kg，總胺含量為46.69 mg/kg；腌制后魚(yú)肉中不同生物胺含量及生物胺總量升高，各生物胺含量為2.68～30.22 mg/kg，生物胺總量為95.72 mg/kg。發(fā)酵10～50 d，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺和總胺含量分別為20.35～55.12 mg/kg、10.66～15.32 mg/kg、45.39～59.63 mg/kg、35.18～65.13 mg/kg、8.99～12.31 mg/kg、51.21～99.15 mg/kg、4.32～6.02 mg/kg、5.18～5.89 mg/kg和181.38～318.57 mg/kg；各生物胺及總胺含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)，均在發(fā)酵30 d時(shí)達(dá)最高。表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)微生物的活動(dòng)增強(qiáng)，尤其是具有氨基酸脫羧酶的微生物，發(fā)酵30 d至發(fā)酵結(jié)束階段生物胺的含量下降可能是產(chǎn)生物胺氧化酶的微生物開(kāi)始活躍所致。

表2 侗族腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中的生物胺含量

2.2 腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的含量

從表3可知，侗族腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中15種游離氨基酸的含量變化。天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量：從腌制至發(fā)酵40 d呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵40 d時(shí)升至最高，分別為165.09 mg/100g、122.50 mg/100g、86.46 mg/100g、295.65 mg/100g和129.53 mg/100g，之后下降。蘇氨酸和谷氨酸含量：從腌制至發(fā)酵30 d呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵30 d時(shí)升至最高，分別為163.93 mg/100g和106.85 mg/100g，之后降低。絲氨酸含量：從腌制至發(fā)酵10 d升至最高，為17.67 mg/100g，發(fā)酵40～50 d未檢出。丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量：從腌制至發(fā)酵成熟時(shí)一直呈上升趨勢(shì)，即至發(fā)酵50 d時(shí)升至最高，分別為361.29 mg/100g、171.89 mg/100g、216.51 mg/100g和118.34 mg/100g。賴(lài)氨酸、組氨酸和脯氨酸含量：從腌制至發(fā)酵20 d呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵20 d時(shí)升至最高，分別為186.17 mg/100g、91.76 mg/100g和24.17 mg/100g，之后降低。

表3 侗族腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中的游離氨基酸含量

2.3 腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中生物胺與游離氨基酸的相關(guān)性

從表4看出，游離氨基酸含量與生物胺含量的相關(guān)性存在差異。其中，天冬氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈極顯著正相關(guān)，與苯乙胺、腐胺、組胺和亞精胺呈顯著正相關(guān)，與精胺呈正相關(guān)。蘇氨酸除與腐胺和精胺呈顯著正相關(guān)外，與其余生物胺和總胺均呈極顯著正相關(guān)。絲氨酸與全部生物胺和總胺均呈負(fù)相關(guān)。谷氨酸與苯乙胺、腐胺、亞精胺和精胺呈顯著正相關(guān)，與色胺、尸胺、組胺、酪胺和總胺呈正相關(guān)。甘氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)，與其余生物胺呈正相關(guān)。丙氨酸除與色胺呈顯著正相關(guān)外，與其余生物胺和總胺均呈正相關(guān)。胱氨酸、纈氨酸、賴(lài)氨酸和脯氨酸與全部生物胺和總胺均呈正相關(guān)。蛋氨酸與色胺呈極顯著正相關(guān)，與腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和總胺呈顯著正相關(guān)，與苯乙胺和精胺呈正相關(guān)。異亮氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)，與其余生物胺呈正相關(guān)。亮氨酸與色胺呈極顯著正相關(guān)，與尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)，與其余生物胺呈正相關(guān)。苯丙氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)，與其余生物胺呈正相關(guān)。組氨酸除與色胺和精胺呈顯著正相關(guān)外，與其余生物胺和總胺均呈極顯著正相關(guān)。

表4 腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中生物胺與游離氨基酸的相關(guān)性

3 討論

發(fā)酵食品中生物胺的形成主要通過(guò)微生物的氨基酸脫羧及醛酮還原的作用產(chǎn)生[14]。研究結(jié)果表明，新鮮魚(yú)肉中不同生物胺含量及總胺含量均較低，各生物胺含量為1.34～12.80 mg/kg，總胺含量為46.69 mg/kg；腌制后魚(yú)肉中不同生物胺含量及生物胺總量升高，各生物胺含量為2.68～30.22 mg/kg，生物胺總量為95.72 mg/kg。各生物胺及總胺含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)，均在發(fā)酵30 d時(shí)達(dá)最高。表明，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)微生物的活動(dòng)增強(qiáng)，尤其是具有氨基酸脫羧酶的微生物，發(fā)酵30 d至發(fā)酵結(jié)束這一階段生物胺的含量下降可能是產(chǎn)生物胺氧化酶的微生物開(kāi)始活躍所致。侗族腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中酪胺、尸胺、腐胺和色胺是腌魚(yú)的主要生物胺，與已報(bào)道的鰱香腸發(fā)酵過(guò)程中的主要生物胺為腐胺、尸胺和酪胺[15]，發(fā)酵鱖魚(yú)中的主要生物胺為色胺、腐胺、尸胺和酪胺[16]研究結(jié)果相似。組胺、酪胺、β-苯乙胺和色胺影響?hù)~(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)[17]。尸胺、腐胺與亞硝酸鹽發(fā)生作用會(huì)產(chǎn)生具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺，也會(huì)使組胺的毒性增大[18]。

研究結(jié)果表明，在侗族腌魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中，天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量從腌制至發(fā)酵40 d呈上升趨勢(shì)，均在發(fā)酵40 d時(shí)升至最高；蘇氨酸和谷氨酸含量從腌制至發(fā)酵30 d呈上升趨勢(shì)，均在發(fā)酵30 d時(shí)升至最高；絲氨酸含量從腌制至發(fā)酵10 d升至最高，發(fā)酵40～50 d未檢出；丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量從腌制至發(fā)酵成熟時(shí)一直呈上升趨勢(shì)，即至發(fā)酵50 d時(shí)升至最高；賴(lài)氨酸、組氨酸和脯氨酸含量從腌制至發(fā)酵20 d呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵20 d時(shí)升至最高。酪氨酸和精氨酸在腌制階段未檢測(cè)到的主要原因：一是可能檢測(cè)方法的檢測(cè)限高，導(dǎo)致低含量的酪氨酸和精氨酸未檢測(cè)到；二是可能酪氨酸和精氨酸發(fā)酵開(kāi)始時(shí)在微生物的作用下生產(chǎn)胺類(lèi)物質(zhì)，發(fā)酵10 d時(shí)未檢測(cè)到酪氨酸和精氨酸。生物胺的前體物質(zhì)是游離氨基酸，有研究得出，精氨酸脫羧形成鳥(niǎo)氨酸，再脫羧成腐胺，或直接脫羧產(chǎn)生精胺和亞精胺；賴(lài)氨酸脫羧形成尸胺；組氨酸脫羧形成組胺；苯丙氨酸脫羧形成2-苯乙胺；酪氨酸脫羧形成酪胺等[19-20]。

研究結(jié)果表明，游離氨基酸含量與生物胺含量的相關(guān)性存在差異。其中，天冬氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈極顯著正相關(guān)，與苯乙胺、腐胺、組胺和亞精胺呈顯著正相關(guān)；蘇氨酸與除腐胺和精胺外的其余生物胺和總胺均呈極顯著正相關(guān)；絲氨酸與全部生物胺和總胺均呈負(fù)相關(guān)；谷氨酸與苯乙胺、腐胺、亞精胺和精胺呈顯著正相關(guān)；甘氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)；丙氨酸與色胺呈顯著正相關(guān)；蛋氨酸與色胺呈極顯著正相關(guān)，與腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和總胺呈顯著正相關(guān)；異亮氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)；亮氨酸與色胺呈極顯著正相關(guān)，與尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)；苯丙氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關(guān)；組氨酸除與色胺和精胺外的其余其物胺和總胺均呈極顯著正相關(guān)。表明，胺的形成除氨基酸的脫羧作用外，還有其他的生成方式，如醛酮的轉(zhuǎn)氨基作用[21]。與李東蕊等[22]的豆瓣醬中精氨酸與腐胺呈負(fù)相關(guān)性研究結(jié)果不一致。所以，適當(dāng)?shù)目刂朴坞x氨基酸的含量也可以控制生物胺的產(chǎn)生。

生物胺的檢測(cè)方法常用的有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法和電分析法[8,23-24]。當(dāng)前研究的熱點(diǎn)方法是生物傳感器法[25]和免疫分析方法[26]，雖然其檢測(cè)限準(zhǔn)確，但是非特異性差，操作方法復(fù)雜，具有一定的局限性，且只針對(duì)一種或者幾種結(jié)構(gòu)相似的胺類(lèi)進(jìn)行測(cè)定。因此，經(jīng)綜合考慮，采用常規(guī)的液相色譜法檢測(cè)腌魚(yú)中生物胺，其前處理簡(jiǎn)單而且可以同時(shí)測(cè)定8種生物胺。

4 結(jié)論

總生物胺含量與游離氨基酸總含量呈極顯著相關(guān)性，其中，天冬氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺的相關(guān)性極顯著，蘇氨酸除與腐胺和和精胺外的其余生物胺和總胺的相關(guān)性極顯著，蛋氨酸和亮氨酸與色胺的相關(guān)性極顯著，組氨酸與除色胺和精胺外的其余生物胺和總胺的相關(guān)性極顯著。