趙學(xué)芬，何席呈，杜 江，譚 波，吳珊珊

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】苗藥課幣有(kod bit vud)為天南星科植物一把傘天南星Arisaemaerubescens(Wall.)Schott.的塊莖，走中、里兩關(guān)，入腦、身兩架，其味苦、辣；性熱，屬冷經(jīng)，有大毒，具有敗毒、清風(fēng)毒、止痙、止咳化痰、消腫散結(jié)的功能，在苗藥分類里屬于攻毒藥，常用于治療癰疽腫毒、瘡瘍潰爛、半身不遂，各種癌癥，跌打損傷、毒蛇咬傷等病癥[1-2]。但其產(chǎn)生作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，導(dǎo)致質(zhì)量控制體系簡單，限制其臨床應(yīng)用和產(chǎn)品開發(fā)。開展課幣有有效成分提取工藝研究，可對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】課幣有具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、祛痰等作用，且具有抗腫瘤、抗菌、殺線蟲活性等生物活性[3-10]?；瘜W(xué)成分研究表明其含有黃酮[11]、生物堿[12]、苯丙素[13]、甾體[14]、萜類[15]、苷類[16]、酯類[17]等化合物?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】黃酮類成分為課幣有主要成分[18-19]，2020年版《中國藥典》以總黃酮作為課幣有質(zhì)量控制指標(biāo)，且具有抗腫瘤活性[20]。目前針對(duì)課幣有黃酮類成分提取工藝研究不多?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)黃酮類成分提取工藝進(jìn)行研究，探明課幣有黃酮類成分組成，以期為課幣有質(zhì)量控制及藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

苗藥課幣有購自貴陽太升藥材市場(chǎng)。試驗(yàn)試劑芹菜素(對(duì)照)購自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。無水乙醇、三乙胺等為分析純，水為蒸餾水。儀器設(shè)備包括UV-1800 UV-VIS分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn)；MS105UD分析天平，瑞士MEFTTLER TOLEDO儀器有限公司生產(chǎn)；L530R離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取芹菜素對(duì)照品適量，以0.1%三乙胺的60%乙醇溶液配置成每1 mL含12.06 μg芹菜素溶液，即得。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取芹菜素對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL于10mL量瓶中，用60%乙醇溶液稀釋至5 mL，加1%三乙胺溶液至刻度，搖勻。以相應(yīng)的60%乙醇溶液、1%三乙胺溶液為空白，按照紫外-可見分光光度法(2020年版《中國藥典》四部通則0401)，在400 nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 不同因素對(duì)課幣有總黃酮得率的影響 精確稱取課幣有粉末(過四號(hào)篩)2 g置于100 mL具塞錐形瓶中，按照浸泡提取→過濾→測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中黃酮(以芹菜素計(jì))的提取量，計(jì)算提取率。分別考察提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、固液比等單因素對(duì)提取量的影響。

1) 提取溶劑。精確稱取6份各2 g課幣有粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入15 mL蒸餾水、10%乙醇(V/V)、20%乙醇(V/V)、30%乙醇(V/V)、40%乙醇(V/V)和50%乙醇(V/V)，于室溫下(15℃)浸提30 min，過濾，3次重復(fù)，合并濾液，考察不同溶劑條件下課幣有的黃酮提取量。

2) 提取溫度。精確取5份各2 g課幣有粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入34 mL蒸餾水，分別于10℃、30℃、50℃、70℃、90℃下浸提30 min，過濾，3次重復(fù)，考察不同提取溫度條件下課幣有的黃酮提取量。

3) 提取時(shí)間。精確稱取5份各2 g課幣有粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入40 mL蒸餾水，50℃下分別浸提10 min、30 min、50 min、70 min、90 min，過濾，3次重復(fù)，考察不同提取時(shí)間條件下課幣有的黃酮提取量。

4) 固液比。精確稱取5份各2 g課幣有粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，以蒸餾水為溶劑，分別按固液比(g∶mL)為1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24進(jìn)行配置，于50℃下浸提55 min，過濾，3次重復(fù)，考察不同固液比條件下課幣有的黃酮提取量。

1.2.4 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、固液比(C)3個(gè)因素作為課幣有黃酮類成分提取工藝考察因素，運(yùn)用Design-Exppert V8.0.6 Box-Behnken進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素和水平見表1。計(jì)算黃酮提取量及提取率。

表1 因素水平表

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 精確稱取3份各2 g課幣有粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，按照Box-Behnken試驗(yàn)得出的最優(yōu)工藝操作，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Design-Exppert V8.0.6和Spss進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 課幣有黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)在400 nm波長處測(cè)定的吸光度，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(x)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)得到作回歸曲線(圖1)。其擬合線性回歸方程為y=0.059 7x+ 0.004 7(R2= 0.999 5)，線性范圍為2.246 0～11.320 μg/mL，說明黃酮濃度與吸光度存在良好的線性關(guān)系。

圖1 課幣有黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同提取條件課幣有的黃酮提取量

從圖2可知，提取溶劑、提取時(shí)間、提取溫度、固液比不同處理?xiàng)l件下課幣有的總黃酮提取量存在差異。

圖2 不同提取因素及水平課幣有的黃酮提取量

2.2.1 提取溶劑 隨著提取溶劑中乙醇濃度增加，課幣有中黃酮的提取量呈下降趨勢(shì)，黃酮提取量為0.903 2～1.154 7 mg/g。選用蒸餾水為提取溶劑時(shí)，其黃酮提取量最高，表明課幣有黃酮主要為水溶性黃酮，故選擇蒸餾水作為響應(yīng)面試驗(yàn)條件最佳提取溶劑。

2.2.2 提取溫度 不同提取溫度下課幣有的黃酮提取量為0.740 3～1.293 9 mg/g，在

提取溫度10～70℃范圍課幣有黃酮提取量隨提取溫度上升而增加，至70℃時(shí)最高，以后則下降。但70℃較50℃而言，提取量增幅小于5%。

2.2.3 提取時(shí)間 課幣有黃酮提取量隨提

取時(shí)間增加呈先增后減趨勢(shì)，在提取時(shí)間10～90 min條件下黃酮提取量為1.095 3～1.353 0 mg/g，提取時(shí)長為70 min時(shí)黃酮提取量最高，之后趨于平緩且開始降低。

2.2.4 固液比 隨著溶劑體積增加，黃酮提取量緩慢增大，在固液比(g∶mL)為1∶16～1∶48條件下黃酮提取量為1.083 7～1.342 8 mg/g，其中，固液比為1∶24時(shí)黃酮提取量基本趨于平緩，之后略有小幅增加。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 不同提取因素組合課幣有黃酮的提取量 從表2可知，在17個(gè)不同提取因素組合處理?xiàng)l件下課幣有的黃酮提取量為0.48～1.31 mg/g。其中處理1即固液比1∶17、提取溫度50℃、提取時(shí)間55 min時(shí)課幣有黃酮提取量最高，為1.31 mg/g。處理13即固液比1∶10、提取溫度80℃、提取時(shí)間55 min時(shí)課幣有黃酮提取量最低，為0.48 mg/g。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)的提取因素組合及其黃酮提取量

2.3.2 黃酮提取量與提取因素的模型構(gòu)建 對(duì)黃酮提取量進(jìn)行二次多元回歸擬合得到黃酮提取量(Y)對(duì)提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)和固液比(C)3個(gè)影響因素的多元線性回歸二項(xiàng)式方程為：Y=0.088 35-8.027×10-3A+0.022 745B+0.057 90C-2.381×10-6AB+5.991×10-4AC+3.809×10-4BC+8.927×10-5A2-3.817×10-4B2-2.214×10-3C2-5.539×10-6A2C。從表3看出，模型F=126.33，P<0.000 1；失擬性P=0.271 4(>0.05)，表明模型無失擬因素存在。R-Squared與Adj R-Squared 接近且趨近于1，分別為0.995 3和0.987 4，模型可靠。

表3 課幣有黃酮提取工藝回歸分析結(jié)果

2.3.3 課幣有黃酮最佳提取工藝 以課幣有黃酮提取量最大值為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)課幣有黃酮提取量與任意2個(gè)因素的三維效應(yīng)面曲線和等高線(圖3)直觀分析，得到課幣有黃酮最佳提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間90 min，提取溫度46.37℃，固液比為1∶20(溶劑量41.32 mL)，在該條件下，課幣有黃酮預(yù)測(cè)提取量為1.34 mg/g。

圖3 提取時(shí)間、提取溫度、固液比對(duì)黃酮提取量的響應(yīng)面和等高線

2.3.4 最佳提取工藝驗(yàn)證 結(jié)合實(shí)際操作，將驗(yàn)證條件修正為固液比1∶20(溶劑量40 mL)、45℃條件下提取90 min，對(duì)優(yōu)化后的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明，3次試驗(yàn)的黃酮提取量分別為1.32 mg/g、1.34 mg/g和1.32 mg/g，平均為1.33 mg/g，與預(yù)測(cè)值(1.34 mg/g)接近，偏差為0.75%，說明該工藝可靠。

3 討論

苗藥課幣有黃酮類成分對(duì)Walker256骨癌痛模型大鼠具有鎮(zhèn)痛作用，可抑制α-黑素細(xì)胞刺激素刺激的B16F1細(xì)胞黑色素生成增加，還可抑制體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞的增殖[7,20]。苗藥課幣有黃酮類成分主要包含以芹菜素為母核的黃酮苷類、異夏佛托苷、夏佛托苷等，但其成分組成、藥理作用機(jī)制并不明確，而提取工藝會(huì)影響黃酮類成分組成和提取量，導(dǎo)致質(zhì)量不穩(wěn)定。

響應(yīng)面分析法(response surface method，RSM)又稱為回歸設(shè)計(jì)，是由數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)緊密結(jié)合并且能夠精準(zhǔn)的表達(dá)響應(yīng)值與各因素之間關(guān)系的優(yōu)化分析方法。由于RSM創(chuàng)建的是復(fù)雜的多維空間曲面，較接近實(shí)際情況，與正交試驗(yàn)法相比較，RSM的模型連續(xù)，設(shè)計(jì)簡單，精準(zhǔn)度更高，并且試驗(yàn)次數(shù)少，能適用于多因素、多水平的研究，因此響應(yīng)曲面回歸模型近年來被廣泛用于中藥的提取、制備等工藝優(yōu)化研究。試驗(yàn)采用星點(diǎn)響應(yīng)面法對(duì)課幣有黃酮類成分提取工藝進(jìn)行研究，可為課幣有質(zhì)量控制和藥理作用研究提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定影響苗藥課幣有黃酮提取效果的提取溫度、提取時(shí)間、固液比3個(gè)因素的水平參數(shù)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮提取工藝，最終得到苗藥課幣有黃酮熱浸法最佳提取工藝：以蒸餾水為提取溶劑，提取溫度為45℃，固液比(g∶mL)1∶20，提取時(shí)間90 min，所得水溶性黃酮類化合物的提取量最高，達(dá)1.33 mg/g，驗(yàn)證結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值(1.34 mg/g)接近。在最優(yōu)工藝基礎(chǔ)上對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行考察表明，第2次可基本完成課幣有黃酮的提取，故苗藥課幣有黃酮最適提取次數(shù)為2次。