宋美玲 黃勝和 陳祖杰 鄒嘉軒 劉歡勝 全文軍

摘 要：? 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的前提條件之一是具有合適的內(nèi)參基因。為篩選斑地錦（Euphorbia maculata）合適的RT-qPCR內(nèi)參基因，該文利用同源克隆法克隆斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段，RT-qPCR檢測7個候選內(nèi)參基因在斑地錦不同生長期根、莖、葉和果實中的表達情況，并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物學(xué)軟件對各候選基因表達穩(wěn)定性進行評價。結(jié)果表明：（1）克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段為729、808、753、422、233、656、313 bp，分別編碼242、269、250、140、77、218、103個氨基酸，與其他植物相應(yīng)氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。（2）綜合3個分析軟件分析內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性得出，表達穩(wěn)定性排名為UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此，可以選取UBQ作為斑地錦RT-qPCR分析的內(nèi)參基因，用于不同生長期基因組織特異性表達研究。

關(guān)鍵詞： 斑地錦， 基因克隆， 內(nèi)參基因， RT-qPCR

中圖分類號：? Q943; R286.12

文獻標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0340-09

Screening of reference genes for RT-qPCR

in Euphorbia maculata

SONG Meiling1， HUANG Shenghe1*， CHEN Zujie2，

ZOU Jiaxuan3， LIU Huansheng3， QUAN Wenjun3

（ 1. Department of Basic Medicine， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， Jiangxi， China; 2. Jiangxi Medical College，

Nanchang University， Nanchang 330031， China; 3. Fuzhou Medical College， Nanchang University， Fuzhou 344000， Jiangxi， China ）

Abstract：? The suitable reference genes is a prerequisite for real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. In order to find a suitable reference gene for gene expression analysis using RT-qPCR in Euphorbia maculata， GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A， and CYP gene fragments from roots， stems， leaves and fruits at different growth stages were cloned with the method of homologous cloning. Subsequently， the expression patterns of the seven candidate reference genes were obtained by RT-qPCR in E. maculata， and the expression stability was assessed by geNorm， NormFinder， and BestKeeper. The results were as follows： （1） The fragment sequences of GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A and CYP contained 729 bp （encoding 242 amino acids）， 808 bp （encoding 269 amino acids）， 753 bp （encoding 250 amino acids）， 422 bp （encoding 140 amino acids）， 233 bp （encoding 77 amino acids）， 656 bp （encoding 218 amino acids）， and 313 bp （encoding 103 amino acids）， respectively. And the seven amino acid sequences shared over 85% identity with other GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A， CYP by BlAST in GenBank. （2） The order of expression stability was UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act by geNorm， NormFinder， and BestKeeper. Therefore， UBQ can be selected as a reference gene for RT-qPCR in E. maculata using for gene expression analysis in different plant tissues at different growth stages.

Key words： Euphorbia maculata， gene cloning， reference genes， RT-qPCR

地錦草藥材為大戟科大戟屬一年生草本植物地錦（Euphorbia humifusa）或斑地錦（E. maculata）的干燥全草，又名鬼見愁、血筋草、奶汁草等，分布于中國江蘇、江西、浙江、湖北、河南、河北、新疆和內(nèi)蒙古等地（中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，1997），是中醫(yī)、維醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥材，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃等功效，主治痢疾、泄瀉、咯血、尿血、便血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等（國家藥典委員會，2015），目前已開發(fā)有腸炎寧片、三七止血片、瀉痢寧片等中成藥。斑地錦主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、止血、免疫調(diào)節(jié)等作用（柳潤輝等，2001;安惠霞等，2008）。目前，斑地錦研究多聚焦在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制、藥理學(xué)作用、化學(xué)成分的提取及鑒定等方面（胡建新等，2018;Tian et al.， 2019），分子生物學(xué)相關(guān)研究報道較少。

實時熒光定量PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上引入熒光基團，通過相應(yīng)的熒光信號積聚實時監(jiān)測整個反應(yīng)的進程，為未知序列進行定量分析的方法，其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確（張玉芳等，2014;Wang et al.， 2019），已經(jīng)成為分子生物學(xué)中研究基因表達的重要工具之一，而使用合適的內(nèi)參基因是獲得可信定量結(jié)果的前提（Shakeel et al.， 2018）。在實際應(yīng)用中，RNA提取、cDNA合成及PCR擴增效率等因素會直接影響實驗結(jié)果，因此常用表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因進行校正和標(biāo)準(zhǔn)化（Bustin， 2002），以減少樣品之間和樣品內(nèi)部的誤差。最近研究結(jié)果表明，內(nèi)參基因不存在絕對通用性，若不經(jīng)篩選而以一種基因作為任何條件下的內(nèi)參，得到的結(jié)果精確度大幅度降低，甚至錯誤（Zhu et al.， 2019）。另外，單一傳統(tǒng)的內(nèi)參基因有時會對結(jié)果精確性產(chǎn)生影響，新內(nèi)參基因?qū)⒅饾u取代某些表達穩(wěn)定性差的傳統(tǒng)管家基因（Nguyen et al.， 2018），或應(yīng)用內(nèi)參基因組合有效地減少基因表達誤差（袁偉等，2012），以獲得更準(zhǔn)確的分析結(jié)果。同時，基于基因芯片技術(shù)和基因表達數(shù)據(jù)庫的篩選（Liang et al.， 2018），也將有助于獲得更可靠的內(nèi)參基因。因此，在分析目標(biāo)基因表達之前，有必要對候選內(nèi)參基因進行篩選與評估，而評價內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的軟件較多，其中g(shù)eNorm、NormFinder和BestKeeper應(yīng)用較為廣泛（Kiarash et al.， 2018;Zhong et al.， 2019）。目前，常用的內(nèi)參基因有act（actin）、GAPDH（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase）、EF-1α（elongation factor-1 alpha）、UBQ（ubiquitin）、TUB-α（tubulin alpha）、eIF-4A（eukaryotic translation initiation factor 4A）、CYP（cyclophilin）、18S rRNA（18S ribosomal RNA）等（Haller et al.， 2004;Kozera & Rapacz， 2013）。為篩選斑地錦合適的RT-qPCR內(nèi)參基因，本研究同源克隆斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等7個候選內(nèi)參基因片段，RT-qPCR檢測在斑地錦不同生長期（苗期、花期、果期）根、莖、葉和果實中的表達情況，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件對各候選基因表達穩(wěn)定性進行評價，為斑地錦不同生長期基因組織特異性表達研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斑地錦種子由江西天施康生態(tài)中藥種植有限公司惠贈，種植于南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院實驗田，經(jīng)江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系中藥教研室鑒定為斑地錦。分別采集種植70 d后的苗期（未開花）、花期（開3朵以上的花且未結(jié)果）的根、莖、葉，以及果期（結(jié)3個以上的果）的根、莖、葉、果，每個樣品皆為3株以上的混合樣品，采集后立即置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

植物總RNA提取試劑盒（Spin Column Plant Total RNA Purification Kit）、膠回收試劑盒（SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit）、引物合成、測序等，生工生物工程（上海）股份有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser）、熒光定量PCR試劑（PrimeScriptTM RT Master Mix）等，購于寶生物工程（大連）有限公司;Pfu酶（TransStart FastPfu DNA Polymerase）、Taq酶、T-載體（pEASY-Blunt Simple Cloning Kit），購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

普通PCR儀（T100TM Thermal Cycler）、熒光定量PCR儀（CFX96 Real-Time）等，美國Bio-Rad公司;超微量分光光度計（NanoDrop One），美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA的提取和cDNA的合成 斑地錦不同生長期根、莖、葉、果實總RNA的提取和cDNA的合成皆參照試劑盒說明書操作?？俁NA提取后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，并用超微量分光光度計測定RNA濃度，以保證后續(xù)實驗的進行。

1.3.2 引物設(shè)計 在GenBank中查詢相關(guān)序列，尤其是同科植物蓖麻（Ricinus communis）、麻瘋樹（Jatropha curcas）和橡膠樹（Hevea brasiliensis）等的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP的基因序列，比對找出高度保守區(qū)段，分別設(shè)計克隆斑地錦相關(guān)基因的簡并引物。后續(xù)根據(jù)測序結(jié)果，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計RT-qPCR引物。本實驗所用引物見表1。

1.3.3 候選內(nèi)參基因片段的克隆與分析 PCR反應(yīng)體系（25 μL）：5×GC Buffer 5 μL，dNTPs（各2.5 mmol·L-1）2.5 μL，簡并引物F（10 μmol·L-1）、R（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，Pfu酶（5 U·μL-1）0.3 μL，滅菌ddH2O 14.2 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，相應(yīng)退火溫度30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的片段的回收純化按照試劑盒操作說明進行。將回收的DNA片段連接T-載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定陽性克隆，送測序。所得序列在GenBank中進行BLAST比對。

1.3.4 RT-qPCR引物檢測與熔解曲線分析 為檢驗引物特異性，排除引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物對結(jié)果的影響，用相應(yīng)引物qF、qR進行普通PCR，然后進行RT-qPCR，再加熱RT-qPCR產(chǎn)物從65 ℃到95 ℃，每隔0.5 ℃停留5 s檢測1次熒光強度以獲取熔解曲線。RT-qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，引物qF（10 μmol·L-1）、qR（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌ddH2O 7.2 μL;擴增條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，相應(yīng)退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.3.5 候選內(nèi)參基因的篩選 分別將樣品總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，進行RT-qPCR擴增，geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對3個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性進行評估。將Ct值轉(zhuǎn)化為相對表達量（吳建陽等，2017），按照公式Q=2（Ct min- Ct sample）進行轉(zhuǎn)化，用于geNorm和NormFinder軟件分析，于BestKeeper軟件中直接輸入Ct值進行分析，最后進行綜合排名，得出最適合斑地錦不同生長期基因組織特異性表達研究的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因片段的克隆與分析

以總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板，相應(yīng)簡并引物F、R為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小符合預(yù)期（圖1）。對其測序后顯示，克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段分別為729、808、753、422、233、656、313 bp，分別編碼242、269、250、140、77、218、103個氨基酸。將氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對后，GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP分別與萵苣GAPDH（XP023733724）、蓖麻EF-1α（XP002518073）、荔枝act（ADV17460）、山梨獼猴桃UBQ（GFZ13847.1）、大麥TUB-α（CAB76917.1）、玉米eIF-4A（U17979.1）、油桐CYP（ARV78452.1）的同源性為95%、99%、100%、99%、99%、87%、86%。將相應(yīng)核苷酸序列登錄到GenBank，獲得登錄號EmGAPDH（MT044466）、EmEF-1α（MT044465）、Emactin（MT044464）、EmUBQ（MW815120）、EmeIF-4A（MW815119）、EmTUB-α（MW815118）、EmCYP（MW815117）。

2.2 RT-qPCR引物檢測與熔解曲線分析

用相應(yīng)引物qF、qR進行普通PCR擴增，產(chǎn)物長度與預(yù)期一致（圖2）。將熒光定量RT-PCR 產(chǎn)物進行熔解曲線分析，各基因引物的熔解曲線均顯示為單峰（圖3）。以上結(jié)果表明，本實驗所設(shè)計定量引物無引物二聚體及非特異性擴增，可用于后續(xù)的RT-qPCR分析。

2.3 候選內(nèi)參基因的Ct值分析

對斑地錦不同生長期各組織（根、莖、葉和果）的cDNA樣品進行RT-qPCR擴增，運用Ct值評估各內(nèi)參基因的表達量，Ct值與其表達量成反比，即Ct值越小，表達量越高。內(nèi)參基因的表達值排序為EF-1α>TUB-α>eIF-4A>UBQ>CYP>GAPDH>act，Ct值分別為17.04～19.55、18.52～21.81、18.58～22.04、20.19～22.90、20.63～24.99、21.85～24.95、24.44～29.26（圖4）。3次重復(fù)之間各內(nèi)參基因的表達量變動較小，且表達量都有所變化。

2.4 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm軟件分析 geNorm軟件通過計算穩(wěn)定系數(shù)M來分析基因表達穩(wěn)定性，M值越小，穩(wěn)定性越好。除act外，6個候選內(nèi)參基因在不同組織中表達的M值都小于1.5，穩(wěn)定性排名為UBQ>TUB-α>EF-1α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表2）。

2.4.2 NormFinder軟件分析 與geNorm類似，NormFinder軟件也是通過各候選內(nèi)參基因的M值評估其表達穩(wěn)定性。經(jīng)NormFinder軟件分析，7個內(nèi)參基因在各組織中的表達穩(wěn)定程度存在差異，按M 值大小排序為UBQ>TUB-α>EF-1α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表3）。UBQ的M值最低，總體穩(wěn)定性最好。

2.4.3 BestKeeper軟件分析 BestKeeper直接根據(jù)各基因的Ct值，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）來評估各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。一般來說，穩(wěn)定的內(nèi)參基因具有較小的SD值和CV值。BestKeeper分析的基因表達穩(wěn)定性排名為EF-1α>UBQ>eIF-4A>GAPDH>TUB-α>CYP>act（表4）。其中，EF-1α、UBQ、eIF-4A的SD值和CV值比較相近，表達都相對穩(wěn)定。

2.4.4 綜合分析 由于各內(nèi)參基因在3個軟件中的排序略有差異，故運用幾何平均值算法進行各候選內(nèi)參基因的綜合排名，內(nèi)參基因幾何平均值越低，則其穩(wěn)定性越好。各內(nèi)參基因在斑地錦不同生長期的不同組織中表達穩(wěn)定性綜合排名為UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表5）。

3 討論與結(jié)論

地錦草是中醫(yī)、維醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥材，主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等，其中槲皮素含量作為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前，斑地錦的分子生物學(xué)相關(guān)報道較少。本研究首次克隆了斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等常用的傳統(tǒng)內(nèi)參基因片段，并作為候選內(nèi)參基因進行RT-qPCR，分別用geNorm、NormFinder和BestKeeper評價在各生長期（苗期、花期、果期）根、莖、葉和果實中的表達穩(wěn)定性。本實驗中，各候選內(nèi)參基因在不同生長期各組織中的表達豐度除act外都較高，Ct值皆在25以下，符合要求。由于3個評估軟件采用不同統(tǒng)計學(xué)算法，分析結(jié)果通常存在差異，需要綜合分析得到最適合的內(nèi)參基因（Kiarash et al.， 2018;Zhong et al.， 2019），其中g(shù)eNorm和NormFinder的分析結(jié)果較為一致，UBQ、TUB-α、EF-1α、eIF-4A、GAPDH的M值都小于1，比較穩(wěn)定，最佳內(nèi)參基因為UBQ，而BestKeeper評價結(jié)果與前二者略有差異，EF-1α、UBQ、eIF-4A、GAPDH的SD值小于1，該軟件篩選的最優(yōu)內(nèi)參基因為EF-1α，而UBQ和eIF-4A表達也比較穩(wěn)定，與EF-1α并無明顯差異。UBQ是泛素蛋白，與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)，參與細胞代謝過程，UBQ是常用的內(nèi)參基因，在許多植物中得到應(yīng)用，例如分析芍藥花瓣不同發(fā)育時期和不同組織的基因表達時可選用UBQ作為內(nèi)參基因（李健，2017）。EF-1α是轉(zhuǎn)錄延伸因子α亞基基因， 在真核生物中參與轉(zhuǎn)錄控制、凋亡以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列重要的生命活動過程，也是較為常用的內(nèi)參基因，在朱頂紅不同組織中表達較穩(wěn)定（劉曉婷等，2018）。GAPDH、act、TUB-α、eIF-4A、CYP等不是斑地錦各生長期不同組織RT-qPCR的合適內(nèi)參基因，但在其他一些植物中可能穩(wěn)定表達，這也證明在不同植物或不同實驗條件下進行RT-qPCR有必要對內(nèi)參基因進行篩選與評估（Kozera & Rapacz， 2013）。因此，若研究斑地錦不同生長期基因組織特異性表達時，可以選取UBQ作為內(nèi)參基因，如果選擇內(nèi)參基因組合，則UBQ和EF-1α較為合適。此結(jié)果為后續(xù)斑地錦分子生物學(xué)相關(guān)研究提供了便利條件。當(dāng)然，隨著斑地錦基因發(fā)掘和表達研究的深入，不排除會出現(xiàn)更穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

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（責(zé)任編輯 李 莉）

收稿日期：? 2021-04-19

基金項目：? 江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（GJJ191230） [Supported by Scientific and Technological Research Program of Jiangxi Education Department （GJJ191230）]。

第一作者： 宋美玲（1989-），碩士，講師，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究，（E-mail）sml0703@163.com。

*通信作者：? 黃勝和，博士，副教授，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究，（E-mail）hsh712@163.com。

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