柳雨均, 范閃閃, 徐婭秀, 楊 易, 王 超, 劉新峰，夏國良,

(1.寧夏大學/西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021；3.中國農(nóng)業(yè)大學生物學院農(nóng)業(yè)生物技術國家重點實驗室，北京 100193)

【研究意義】灘羊是我國具有較高經(jīng)濟價值但繁殖率較低的綿羊品種[1]?，F(xiàn)階段，利用胚胎工程技術結合飼養(yǎng)管理的優(yōu)化等可較顯著地提高家畜的繁殖效率，但目前現(xiàn)代繁殖技術在灘羊的繁殖擴群方面的應用普及率不高，相關原因與對灘羊的生殖生理機制研究不充分有關。由于成熟卵母細胞的質(zhì)量直接影響早期胚胎的發(fā)育潛能，因此掌握卵母細胞的成熟調(diào)控機制，是利用胚胎工程技術快速擴繁灘羊的重要前提[2]。故加強對促性腺素誘導灘羊卵母細胞成熟調(diào)控機制的基礎研究至關重要?！厩叭搜芯窟M展】在哺乳動物卵泡生長發(fā)育期間，存在著大量基因表達失活與激活同步進行的情況，而這些基因表達相關的調(diào)節(jié)又受到多種表觀遺傳修飾因素調(diào)控[3-6]。例如，常見的表觀修飾包括DNA甲基化[7]、組蛋白修飾[8](乙酰化、磷酸化、甲基化及泛素化)及miRNA調(diào)控[9]等。其中，組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HADCs)是一類真核生物細胞中的蛋白酶，可通過對組蛋白的去乙酰化修飾參與細胞分化、DNA修復和染色體裝配等。目前已知的HDACs可以分為4個亞家族：I(HDACs 1、HDACs 2、HDACs 3、HDACs 8)，II(HDACs 4、HDACs 5、HDACs 6、HDACs 7、HDACs 9、HDACs 10)、III(Sirt 1～Sirt 7)和IV(HDAC 11)亞家族[10-12]。其中，I類HDACs存在于多種哺乳動物體內(nèi)，是一種廣泛表達的核酶[13]，并在細胞存活、增殖、分化和癌癥發(fā)展中起著關鍵作用[14-15]。在小鼠中，條件性敲除HDAC1和HDAC2會導致雌性不育[16]。在卵母細胞成熟過程中，HDAC2可以通過調(diào)節(jié)組蛋白H4上第16位賴氨酸殘基(H4K16)的乙?；蕉绊懭旧w分離和動粒功能。近期研究還發(fā)現(xiàn)，HDAC3在小鼠響應促性腺素信號，參與卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟的關鍵性開關分子，卵母細胞成熟進程方面發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[17]。有研究報道，HDAC8對小鼠和豬的卵母細胞成熟也發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[18-19]?！颈狙芯壳腥朦c】有關HDAC家族成員在灘羊卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟方面的可能作用及機制的報道尚不多見。【擬解決的關鍵問題】本研究擬結合免疫組化、免疫熒光和蛋白免疫印跡等方法，分析HDAC3和HDAC8在灘羊生長級別卵泡中的定位及表達模式，以期為深入研究二者對灘羊卵泡及卵母細胞發(fā)育的機制提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于寧夏回族自治區(qū)銀川市永寧縣屠宰場采集成年健康灘羊卵巢。

1.2 主要試劑

免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒(中杉金橋)；TRIzol 試劑(Ambion)；一抗兔抗HDAC3抗體、兔抗HDAC8抗體(Abcam)；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Proteintech)；二抗Alexa Fluor 488標記的驢抗兔IgG(H+L)(上海翊圣生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(凱基生物)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix， HIScript III RT SuperMIX for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme)。

1.3 卵巢處理及各級卵泡分離

將新鮮采集的卵巢置于37 ℃的無菌生理鹽水中，在2 h內(nèi)帶回實驗室。隨后，用含有1% 抗生素的生理鹽水沖洗分揀后隨機分為2份：一份置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋后用于免疫組織化學和免疫熒光分析；另一份用于機械剝離各級卵泡。本實驗參考山羊卵泡分級方法[20]，將所分離卵泡分為：小有腔卵泡(直徑0.5～3.0 mm)、大有腔卵泡(直徑3.0～5.0 mm)及排卵前卵泡(直徑>5.0 mm)[15]，隨后將各級卵泡分別置于液氮中保存，用于蛋白免疫印跡測定。

1.4 免疫組織化學分析

將石蠟包埋的卵巢組織切成6 μm的切片，根據(jù)免疫組化試劑盒(中杉金橋)說明書進行操作。石蠟切片依次經(jīng)脫蠟和脫水，抗原修復，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑。隨后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS，pH為7.2～7.4)洗滌3次，每次3 min。滴加山羊血清封閉液，室溫封閉45 min。之后，分別滴加一抗兔抗HDAC3 抗體(1∶100稀釋)、一抗兔抗HDAC8 抗體(1∶50稀釋)或兔抗IgG(1∶100稀釋)，于4 ℃孵育過夜后用PBS清洗3次，每次3 min。滴加反應增強液，室溫孵育20 min后，PBS清洗3次，每次3 min。滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育20 min后PBS清洗3次，每次3 min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。

1.5 免疫熒光分析

將石蠟包埋的卵巢組織切成6 μm切片，經(jīng)脫蠟和脫水，抗原修復后，PBS清洗3次，每次5 min。滴加10%驢血清封閉45 min。分別滴加一抗兔抗HDAC3 抗體(1∶100稀釋)、一抗兔抗HDAC8抗體(1∶50稀釋)、兔抗IgG(1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜后PBS清洗3次，每次10 min。滴加熒光二抗(1∶100稀釋)和Hoechst(1∶1000稀釋)37 ℃ 孵育1 h。PBS清洗3次，每次10 min。加入抗熒光淬滅劑后封片，顯微鏡避光觀察。

1.6 蛋白免疫印跡檢測

利用蛋白提取試劑盒分別提取灘羊各級卵泡總蛋白，使用微量分光光度儀檢測樣品的總蛋白含量。配制10%分離膠和4%濃縮膠，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳完畢后，使用甲醇浸泡過的PVDF膜于300 mA 轉(zhuǎn)膜90 min。取出后于5% 脫脂牛奶中室溫封閉60 min。分別滴加一抗兔抗HDAC3抗體(1∶5000稀釋)、一抗兔抗HDAC8 抗體(1∶250 00稀釋)或一抗兔抗GAPDH抗體(1∶5000稀釋)，4 ℃ 孵育過夜。TBST清洗6次，每次5 min。滴加二抗(1∶5000稀釋)室溫孵育60 min。TBST清洗6次，每次5 min。滴加ECL化學發(fā)光液后曝光。

2 結果與分析

2.1 HDAC3和HDAC8在灘羊卵泡中定位與表達

利用免疫組化技術觀察HDAC3和HDAC8在灘羊卵泡發(fā)育中的表達定位。在灘羊卵泡中，HDAC3和HDAC8均有表達，其中HDAC3定位于原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡的顆粒細胞，有腔卵泡的顆粒細胞和卵丘細胞細胞質(zhì)(圖1-A)。HDAC8主要定位于原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞，有腔卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和卵丘細胞細胞質(zhì)(圖1-B)。

A.HDAC3在灘羊卵泡中的定位分析；B.HDAC8在灘羊卵泡中的定位分析； CCs為卵丘細胞；MGCs為壁層顆粒細胞；標尺：20 μm；IgG為陰性對照A. Localization of HDAC3 in follicles of Tan sheep; B. Localization of HDAC8 in follicles of Tan sheep; CCs was cumulus cells; MGCs was mural granulosa cells; Scale bar: 20 μm; IgG was negative control圖1 HDAC3和HDAC8在灘羊卵泡發(fā)育過程中的定位和表達Fig.1 The localization and expression of HDAC3 and HDAC8 in growing follicles of Tan sheep

免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)(圖2-A)，HDAC3定位于原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡的顆粒細胞，有腔卵泡的顆粒細胞和卵丘細胞細胞質(zhì)中，表達水平隨卵泡發(fā)育逐步上調(diào)。HDAC8主要定位于原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞，有腔卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和卵丘細胞細胞質(zhì)。需要指出的是，與HDAC3不同，HDAC8在原始卵泡的顆粒細胞中表達量最高，伴隨著卵泡發(fā)育，HDAC8在顆粒細胞中的表達水平逐步下降(圖2-B)。

A.灘羊卵泡中表達的HDAC3的免疫熒光分析；B.灘羊卵泡中表達的HDAC8的免疫熒光分析；藍色熒光為Hoechst特異性標記細胞核，綠色熒光為HDAC3/HDAC8；IgG為陰性對照；標尺：20 μmA. Results of immunofluorescence analysis of HDAC3 expression in follicles of Tan sheep; B. Results of immunofluorescence analysis of HDAC8 expression in follicles of Tan sheep; Nuclei were dyed with Hoechst (blue), green fluorescence was HDAC3/HDAC8; IgG was negative control; Scale bar: 20 μm圖2 免疫熒光檢測HDAC3和HDAC8在灘羊卵泡發(fā)育過程中的定位和表達Fig.2 The localization and expression of HDAC3 and HDAC8 in growing follicles of Tan sheep detected by immunofluorescence

2.2 不同級別卵泡中HDAC3和HDAC8的表達水平

利用蛋白免疫印跡技術對小有腔卵泡、大有腔卵泡及排卵前卵泡中HDAC3和HDAC8的表達進行檢測，結果如圖3所示。HDAC3蛋白在小有腔卵泡中即有較強的表達，其表達水平隨卵泡發(fā)育逐步上調(diào)，如HDAC3在大有腔卵泡中的表達迅速升高，在成熟卵泡中達到最高且表達量約為小有腔卵泡的2倍。HDAC3在灘羊卵泡發(fā)育中的表達變化說明其可能對卵泡的發(fā)育，特別是卵泡中顆粒細胞和卵母細胞的發(fā)育有一定調(diào)控作用。與此同時，筆者發(fā)現(xiàn)HDAC8蛋白在小有腔卵泡中即開始有非常強的表達，其表達水平伴隨卵泡發(fā)育逐步下調(diào)，如HDAC8在排卵前卵泡中的表達迅速下調(diào)并達到最低，表達量約為小有腔卵泡的1/7。以上結果表明，HDAC8可能也參與卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟調(diào)控，但其作用很可能與HDAC3截然不同。

A.卵巢中分離的各級卵泡；B.蛋白免疫印跡檢測各級卵泡中HDAC3和HDAC8蛋白的表達模式，GAPDH為內(nèi)參校正; C. HDAC3在各級卵泡中的蛋白表達水平的灰度掃描結果分析；D.HDAC8在各級卵泡中的蛋白表達水平的灰度掃描結果分析; *代表P<0.05(差異顯著)；**代表P<0.01(差異極顯著)A. Follicles isolated from the ovary; B. Expression patterns of HDAC3 and HDAC8 proteins in different follicles were quantified by western blotting analysis, GAPDH was the internal reference correction; C. Analysis of protein expression level of HDAC3 in different follicles by gray-scale scanning; D. Analysis of protein expression level of HDAC8 in different follicles by gray-scale scanning; *stands for P<0.05(significant differences); **stands for P<0.01 (significant extremely differences)圖3 HDAC3和HDAC8在灘羊卵泡發(fā)育過程中的表達模式Fig.3 Expression pattern of HDAC3 and HDAC8 in the process of follicular development of Tan sheep

3 討 論

前期研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾不僅影響哺乳動物的卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟，而且對胚胎早期的發(fā)育調(diào)節(jié)發(fā)揮著關鍵作用[4]，但是其在灘羊卵泡及卵母細胞發(fā)育中的作用尚未見報道。為闡明HDACs家族成員在灘羊卵泡發(fā)育中的作用及機制，本研究初步分析了HDAC3和HDAC8的表達模式。通過分析其定位與表達，筆者證實了這2種分子在不同發(fā)育階段卵泡中的表達模式具有顯著差異。其中HDAC3在顆粒細胞和卵丘細胞中均表達，且表達量逐步上調(diào)，而HDAC8同樣在顆粒細胞和卵丘細胞中表達，但表達量隨著卵泡發(fā)育逐步下調(diào)。表明，HDAC3和HDAC8可能在灘羊卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

HDAC3是維持染色質(zhì)結構和基因組穩(wěn)定性、確保正常細胞存活的調(diào)節(jié)因子[21]。研究顯示[22]，HDAC3由于同時含有核定位和核輸出序列，可以在小鼠細胞核、細胞質(zhì)以及細胞膜中表達[23]，并通過與抑制因子 SMRT 和 N-CoR 形成蛋白復合物，調(diào)節(jié)多基因轉(zhuǎn)錄。在小鼠卵巢中，HDAC3主要在生發(fā)泡(Germinal vesicle，GV)期卵母細胞細胞核中表達；生發(fā)泡破裂(Germinal vesicle breakdown，GVBD)后，HDAC3主要在紡錘體表達，通過去乙?；⒐艿鞍状龠M動粒—微管相互作用的建立，從而確保卵母細胞成熟期間紡錘體/染色體的正常排列[24]。筆者發(fā)現(xiàn)，一旦小鼠卵泡顆粒細胞內(nèi)的HDAC3受促黃體激素(Luteinizing hormone，LH)峰的影響而下調(diào)時，即會解除顆粒細胞對EGF樣生長因子雙調(diào)蛋白(Amphiregulin，AREG)的表達抑制作用，從而促進其分泌，最終導致卵丘擴展和卵母細胞成熟[17]。該結果說明，顆粒細胞中的HDAC3對卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟發(fā)揮關鍵性作用。豬卵母細胞進入減數(shù)分裂時，HDAC3開始定位于紡錘體，而抑制HDAC3后會破壞微管的穩(wěn)定性，從而導致紡錘體缺陷和染色體配對失敗[25]。本研究免疫組化及免疫熒光染色結果表明，HDAC3主要在灘羊原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡的顆粒細胞中表達，表達量較低。伴隨卵泡發(fā)育至有腔卵泡階段，HDAC3在顆粒細胞和卵丘細胞細胞質(zhì)中均表達上調(diào)。蛋白免疫印跡檢測結果進一步證實其在小有腔卵泡、大有腔卵泡及成熟卵泡中表達量逐步上調(diào)。說明HDAC3可能參與調(diào)控灘羊卵泡及卵泡中顆粒細胞和卵母細胞的發(fā)育，但其作用及機制是否與小鼠中的有所不同值得深入挖掘。

研究發(fā)現(xiàn)，HDAC8在有絲分裂、轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑和RNA剪接方面發(fā)揮著重要作用，同時也是多種疾病的治療靶點[26]。在小鼠卵母細胞成熟過程中，HDAC8定位于紡錘體兩極，在紡錘體組裝和染色體配對時發(fā)揮著維持整倍體的關鍵作用[18]。HDAC8廣泛分布于GV期小鼠卵母細胞的細胞質(zhì)中，GVBD后不久，HDAC8開始在染色體周圍聚集，由γ-微管蛋白介導，參與紡錘體的正確組裝和染色體排列[18]。在豬卵母細胞GV期，HDAC8定位于細胞核，從GVBD到MII期轉(zhuǎn)移至紡錘體兩極。通過RNAi特異性沉默HDAC8后，γ-微管蛋白向紡錘極募集失敗，破壞紡錘體/染色體結構，導致豬卵母細胞成熟過程中的第一極體排出率下降，減數(shù)分裂進程停滯[19]。而在有絲分裂期間，HDAC8廣泛表達并定位于細胞核或細胞質(zhì)[27-28]。HDAC8對牦牛卵母細胞的成熟也具有調(diào)控作用[29]。但HDAC8在哺乳動物卵泡顆粒細胞及卵丘細胞中的作用尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，HDAC8主要在灘羊卵巢原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞，有腔卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和卵丘細胞細胞質(zhì)中表達。伴隨著卵泡發(fā)育，顆粒細胞中HDAC8表達水平逐步下調(diào)。蛋白免疫印跡檢測結果進一步證實HDAC8在小有腔卵泡、大有腔卵泡及成熟卵泡中表達量逐步下調(diào)。故推測，在灘羊各級卵泡中HDAC8表達水平的變化可能與灘羊卵泡發(fā)育及卵泡中顆粒細胞和卵母細胞的發(fā)育有關，其與HDAC3間存在何種關系也是值得深入研究。

4 結 論

伴隨灘羊卵巢中的卵泡由原始卵泡起始發(fā)育后，其生長卵泡發(fā)育至有腔卵泡階段前后，卵泡體細胞中HDAC3和HDAC8均表達，但表達趨勢相反，由此提示二者均參與卵泡發(fā)育過程，但可能發(fā)揮著不同的生理功能。本研究結果為進一步深入研究HDAC3和HDAC8如何參與調(diào)節(jié)灘羊卵泡及卵母細胞發(fā)育機制提供了基本數(shù)據(jù)和參考。