張翠霞，張翔宇，楊 超，唐 麗，雷 岷，季 楊，李 超，任永軍，鄺良德，郭志強，鄭 潔，李叢艷，謝曉紅

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066;3.中化現(xiàn)代農(nóng)業(yè)四川有限公司，成都 610066)

【研究意義】雌激素受體基因(Estrogen receptor，ESR)是影響畜禽繁殖性狀的重要功能候選基因，通過與靶基因上特異性效應(yīng)元件的結(jié)合，改變畜禽雌激素基因的轉(zhuǎn)錄，進而對雌性第二特征、繁殖周期、生殖力、妊娠維持產(chǎn)生影響[1]。本研究旨在探究ESR基因在家兔群體不同性腺組織中的表達(dá)規(guī)律及其在分子調(diào)控機制中發(fā)揮的作用，為利用分子標(biāo)記技術(shù)改良家兔繁殖性狀提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】雌激素受體基因在動物性腺組織中廣泛表達(dá)并在繁殖調(diào)控機制中發(fā)揮著極其重要的作用[2-4]。ESR基因作為影響畜禽繁殖性狀的重要功能候選基因被廣泛研究，其通過與靶基因上特異性效應(yīng)元件結(jié)合，改變雌激素基因轉(zhuǎn)錄，進而對雌性第二特征、繁殖周期、生殖力、胚胎發(fā)育、妊娠維持等繁殖性能產(chǎn)生影響[5]。ESR基因表達(dá)受其特異性啟動子控制[6]，根據(jù)細(xì)胞的特異性不同從某個啟動子開始，人的ESR基因轉(zhuǎn)錄從其cDNA中的+99、+234 和+258 3個不同起始密碼子開始，獲得3種編碼區(qū)完全一致的mRNA。人、雞、鼠等多個物種的ESR基因已被成功克隆。人的ESR基因全長140 kb，完整編碼區(qū)長1788 bp，編碼595個氨基酸殘基。ESR基因具有較強的保守性，人與雞的同源性高達(dá) 88%，人與鼠的同源性達(dá)到 80%，鼠與雞的同源性是 77%[7-9]。通過分子生物學(xué)方法對不同組織中ESR的mRNA進行定位分析發(fā)現(xiàn)，ESR1主要分布在雌性動物性腺組織、肝組織、骨骼組織和中樞神經(jīng)組織等[10]。【本研究切入點】目前的研究均未闡明ESR1 如何影響家兔繁殖性能，在其不同生理周期和組織的表達(dá)規(guī)律也未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究家兔不同群體組織中ESR1基因的時空表達(dá)差異，為闡明影響家兔繁殖性狀的重要調(diào)控因子提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期利用ESR基因作為繁殖性狀候選遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于家兔分子育種，為家兔專門化品系和配套系的選育提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以齊卡巨型白兔、加利福尼亞兔和齊興肉兔3個家兔品種為試驗材料，每個品種各選60只繁殖母兔組成試驗群體，在相同飼養(yǎng)管理條件下飼喂。每個品種分別選取3只空懷母兔和已懷孕14 d的妊娠母兔進行屠宰，取其卵巢、輸卵管和子宮等組織，用DEPC水清洗并立即放于液氮罐中速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和檢測 采用Trizol法(Trizol Reagent, Invitrogen)提取供試家兔卵巢、子宮及輸卵管組織的總RNA。Nano Drop 2000 分光光度計檢測RNA 濃度和純度，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，-80 ℃低溫冰箱保存。

1.2.2 引物設(shè)計 從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索基因全序列，使用Primer Premier軟件設(shè)計篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，并以ULTRAPAGE純化(表1)。

表1 本次檢測所用引物及堿基序列

1.2.3 cDNA合成 利用試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer2 4.0 μL， 總 RNA 10.0 μL，RNase Free dH2O 4 μL,依次加入各試劑，進行PCR反應(yīng)，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行稀釋，用 GAPDH 進行 PCR 結(jié)果檢測，將檢測合格的 cDNA 置于 -20 ℃冰箱保存，用于檢測ESR基因的表達(dá)情況。

1.2.4 實時熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系：PCR2×Real PCR Easy TM Mix-SYBR 10 μL,10 μmol/L 的上、下游引物各 0.8 μL，Template(DNA)2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 30 s；95 ℃ 變性 5 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，45 個循環(huán)，每個樣品3次重復(fù)。以GAPDH基因為內(nèi)參基因進行校正，采集熒光。

1.2.5 統(tǒng)計分析 使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析PCR過程中各檢測樣本的CT(Threshold cycle)值。通過2-△△CT計算ESR基因相對mRNA表達(dá)水平。采用一般線性模型，對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA 分析，使用 LSD 法進行多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，所有計算由用 SPSS 16.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔ESR1基因的RT-PCR檢測結(jié)果

將肉兔卵巢、子宮和輸卵管組織中ESR基因進行擴增，最終得到擴增曲線和溶解曲線(圖 1)，ESR基因和參考基因 GAPDH擴增曲線皆呈“S”形態(tài)，平滑基線，動力學(xué)曲線整體平行性趨勢較好，符合后續(xù)試驗要求。CT 值適當(dāng)，表明定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。ESR和GAPDH基因的溶解曲線呈單峰狀，特異性擴增產(chǎn)物可呈現(xiàn)熒光，無雜質(zhì)二聚體峰等出現(xiàn)，結(jié)果準(zhǔn)確且具有代表性，數(shù)據(jù)可應(yīng)用于進一步表達(dá)差異分析。

圖1 GAPDH的擴增曲線和溶解曲線Fig.1 Amplification curve and melting curve of GAPDH gene

圖2 ESR1的擴增曲線和溶解曲線Fig.2 Amplification curve and melting curve of ESR1 gene

2.2 ESR1基因在各品種肉兔及各組織間的表達(dá)情況

為研究ESR1基因在不同品種家兔組織中的表達(dá)差異，通過RT-PCR方法對ESR基因在齊卡巨型白兔、加尼福尼亞兔和齊興肉兔的卵巢、輸卵管和子宮等組織中的表達(dá)量進行檢測，采用GAPDH基因?qū)Ρ磉_(dá)水平進行均一化處理，采用 2-△△CT法對不同組織的表達(dá)量進行計算，獲得ESR基因在多個組織中 mRNA 表達(dá)情況。從圖3可知，就同一組織不同品種分析發(fā)現(xiàn)，ESR基因在卵巢中表達(dá)量依次為齊興白兔>齊卡巨型白兔>加利福尼亞兔；ESR基因在子宮中的表達(dá)量依次為齊卡巨型白兔>齊興白兔>加利福尼亞兔；ESR基因在輸卵管中的表達(dá)量趨勢同卵巢一致。就同一家兔品種不同組織分析發(fā)現(xiàn)，齊興白兔群體中ESR基因的表達(dá)量依次為卵巢>子宮>輸卵管；ESR基因在加利福尼亞兔群體中的表達(dá)量依次為輸卵管>卵巢>子宮；ESR基因在齊卡巨型白兔群體中的表達(dá)量依次為子宮>卵巢>輸卵管。說明，ESR1基因在3個品種家兔的卵巢、輸卵管和子宮等組織中具有不同程度的表達(dá)。

圖3 妊娠期ESR基因在不同家兔品種和不同組織中的表達(dá)量Fig.3 Tissue expression of ESR gene in different breeds during pregnancy

2.3 ESR1基因在齊卡巨型白兔不同繁殖時期不同組織的表達(dá)情況

為研究ESR1基因與繁殖性狀的相關(guān)性，通過RT-PCR方法對ESR基因在空懷和妊娠14 d的齊卡巨型白兔母兔不同性腺組織中的表達(dá)進行檢測，采用GAPDH基因?qū)Ρ磉_(dá)水平進行均一化處理，采用 2-△△CT法對不同組織的表達(dá)量進行計算，獲得ESR基因在多個組織中 mRNA 表達(dá)情況(圖4)。在不同繁殖時期，齊卡巨型白兔的卵巢、輸卵管和子宮等組織中均有ESR基因表達(dá)，且表達(dá)趨勢趨于一致，表達(dá)量依次為子宮>輸卵管>卵巢。進一步對卵巢、輸卵管和子宮等組織的ESR基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，ESR1基因在空懷母兔子宮的表達(dá)量顯著高于妊娠母兔(P<0.05),空懷母兔輸卵管的表達(dá)量顯著高于妊娠母兔(P<0.05)。

圖4 齊卡巨型白兔ESR基因在不同繁殖時期組織的表達(dá)量Fig.4 The expression of ESR gene in different reproductive stages of ZIKA rabbits

3 討 論

3.1 ESR1基因在不同家兔品種和性腺組織間的表達(dá)

雌激素廣泛存在于動物體內(nèi)，其主要通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。大量研究顯示，雌激素受體在動物的不同組織中均有不同程度的表達(dá)。田志龍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ESR在具有不同繁殖力的小尾寒羊群體的小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等12個組織中均有表達(dá)。ESR1和ESR2基因在人正常乳腺組織及纖維腺瘤中均有表達(dá)，ESR1基因還在導(dǎo)管上皮細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)[12]。李江森[13]對不同日齡香豬睪丸發(fā)育進行研究，ESR1基因的表達(dá)量隨日齡增長而發(fā)生變化，首次發(fā)現(xiàn)香豬睪丸生精小管細(xì)胞胞質(zhì)中存在ESR2基因的表達(dá)，輸出小管的表達(dá)量顯著低于附睪管的表達(dá)量(P<0.05)。彭婷婷等[14]利用RT-PCR檢測證實小鼠眼視網(wǎng)膜組織中ESR的存在，且不同性別及月齡存在差異表達(dá)。ESR基因與小尾寒羊、湖羊繁殖性狀具有相關(guān)性[15-16]，ESR1基因主要在小尾寒羊輸卵管、子宮、卵巢表達(dá)[17-19]，本研究在懷孕期齊卡巨型白兔、加尼福尼亞兔和齊興肉兔的卵巢、輸卵管和子宮等組織中均檢測到ESR1基因的表達(dá)，表明ESR1基因在家兔繁殖過程中可能起著重要作用，但具體機制有待繼續(xù)研究。

3.2 ESR1 基因表達(dá)對家兔繁殖的影響

ESR1基因?qū)θ祟惣皠游锷诚到y(tǒng)的發(fā)育具有重要作用，影響卵泡發(fā)育、受精和胚胎著床等重要生理過程[20-21]。Hong等[22]研究發(fā)現(xiàn)，人類未分化的胚胎干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，ESR1與ESR2基因表達(dá)量均有明顯差異，ESR1在人類胚胎期生長的第2、4、6天中未見明顯變化趨勢，ESR2在第2天上調(diào)后迅速下降，說明ESR1和ESR2在胚胎干細(xì)胞分化過程中的作用不同。采用免疫組化染色方法發(fā)現(xiàn)，ESR1基因在母豬早期妊娠期不同時期的卵巢中均有表達(dá)且表達(dá)存在差異，母豬胚胎第61天時，表達(dá)量比較多的是卵巢表面上皮、卵母細(xì)胞，皮質(zhì)部分的原始卵泡等[23]。Vaskivuo等[24]報道，在20周的胎兒卵巢卵子的胞漿檢測到ESR1和ESR2基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素和ESR1結(jié)合后可以調(diào)節(jié)產(chǎn)道相關(guān)基因的表達(dá)和生理作用[25]。Baranda-Avila等[26]利用RT-PCR技術(shù)對妊娠早期家兔輸卵管不同時期壺腹和峽部ESR1基因的表達(dá)進行了分析，ESR1基因在早孕母兔的產(chǎn)道存在差異表達(dá)，妊娠母兔ESR1基因的表達(dá)量高于非妊娠母兔，妊娠母兔壺腹的ESR1基因表達(dá)量在懷孕第3天達(dá)到最高，第4天開始下降。而妊娠母兔峽部ESR1基因的表達(dá)量在前3 d持續(xù)增加，第3天達(dá)到最大值。本研究對同一品種家兔不同組織ESR基因的表達(dá)量進行分析發(fā)現(xiàn)，齊興肉兔群體ESR基因的表達(dá)量依次為卵巢>子宮 >輸卵管；加利福尼亞兔ESR基因的表達(dá)量依次為輸卵管>卵巢>子宮；齊卡巨型兔群體ESR基因的表達(dá)量依次為子宮>卵巢>輸卵管，ESR基因的表達(dá)量不同暗示ESR1在不同品種家兔懷孕過程中所起的作用可能存在差異。本研究顯示，ESR1基因在空懷和妊娠14 d的齊卡巨型白兔母兔的子宮、卵巢、輸卵管組織中均有表達(dá)，且表達(dá)趨勢基本一致，從高到低依次為子宮、輸卵管、卵巢，進一步分析發(fā)現(xiàn)，ESR1基因在空懷母兔子宮中的表達(dá)量顯著高于妊娠母兔(P<0.05),空懷母兔輸卵管中ESR1基因的表達(dá)量顯著高于妊娠母兔(P<0.05)，這可能和ESR1基因參與家兔早期妊娠調(diào)控有關(guān)，而妊娠后期隨著胎兒的發(fā)育，母兔不同性腺組織ESR1基因表達(dá)量有所下降，其調(diào)控機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

在懷孕期齊卡巨型白兔、加尼福尼亞兔和齊興肉兔的卵巢、輸卵管和子宮等組織中均檢測到ESR1基因的表達(dá)，表明ESR1基因在家兔繁殖過程中可能起著重要作用。ESR1基因在齊卡巨型母兔的性腺組織中不同生理階段的表達(dá)量存在差異，可能與該品種的繁殖力有關(guān)，本研究可為闡明影響家兔繁殖性狀的重要調(diào)控因子提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。