王兆琛 趙勇超 杜 煒 張 宇 張家新* 安 磊

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

顆粒細(xì)胞的快速增殖是處在發(fā)育中的優(yōu)勢卵泡的特征之一。與壁層顆粒細(xì)胞相比，卵丘(顆粒)細(xì)胞富含更多與細(xì)胞增殖和代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。壁層顆粒細(xì)胞對葡萄糖的利用較少，卵泡吸收的葡萄糖則主要由卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes, COCs)代謝。

雙調(diào)蛋白(Amphiregulin, AREG)作為一種表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)類因子，最初在壁層顆粒細(xì)胞中表達(dá)，然后在壁層顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞上結(jié)合表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)并激活下游信號通路。在卵泡發(fā)育過程中，卵丘細(xì)胞獲得功能性的EGFR信號是一個里程碑性的事件，排卵前卵泡液中的AREG含量也與卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力密切相關(guān)。另外，有研究表明卵母細(xì)胞分泌因子(Oocyte-secreted factors, OSFs)，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(Bone morphogenetic protein 15, BMP15)和生長分化因子9(Growth differentiation factor 9, GDF9)，通過SMAD2/3途徑促進(jìn)卵丘細(xì)胞上EGFR的表達(dá)。

卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝對卵母細(xì)胞的成熟以及受精后的胚胎發(fā)育潛能至關(guān)重要，卵丘細(xì)胞通過間隙連接通訊(Gap-junctional communication, GJC)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)卵母細(xì)胞或者為卵母細(xì)胞提供可利用的底物。卵丘細(xì)胞通過糖酵解和磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway, PPP)代謝葡萄糖支持卵母細(xì)胞成熟，并且通過PPP產(chǎn)生的NADPH對于卵母細(xì)胞的抗氧化功能尤為重要。在綿羊的研究中發(fā)現(xiàn)，卵丘細(xì)胞糖酵解、PPP的激活以及卵母細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改善可能有利于卵母細(xì)胞的成熟。此外，AREG可以促進(jìn)牛COCs糖酵解，AREG與OSFs結(jié)合可以提高卵母細(xì)胞內(nèi)的NADPH水平及體外受精后的胚胎發(fā)育能力。

在綿羊體外胚胎生產(chǎn)中，來源于小腔卵泡的卵母細(xì)胞不能被有效的利用，其中一個主要原因是小腔卵泡卵母細(xì)胞的體外成熟(

In

vitro

maturation, IVM)質(zhì)量較差，發(fā)育能力較低。近年來，有許多研究針對卵丘細(xì)胞分析不同直徑腔卵泡之間細(xì)胞增殖、代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異，普遍認(rèn)為小腔卵泡的卵丘細(xì)胞上EGFR信號通路沒有被充分激活，限制了卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。在多種動物上的研究表明，AREG等EGF類因子激活COCs中卵丘細(xì)胞的EGFR信號通路，提高了卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。但在綿羊卵丘細(xì)胞上，還沒有研究證明不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的差異，以及AREG對葡萄糖代謝的影響，且COCs的研究無法排除卵母細(xì)胞對卵丘細(xì)胞的影響。因此，本研究以綿羊卵丘細(xì)胞為研究對象，為來源于中、小腔卵泡的卵丘細(xì)胞提供相同的OSFs條件，探究AREG對中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的影響，為綿羊卵母細(xì)胞成熟機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1

.

1

.

1

動物樣品

自屠宰場收集的綿羊離體卵巢需保存在含有青霉素和鏈霉素的無菌生理鹽水中，于保溫瓶保持溫度在30～35 ℃，4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1

.

1

.

2

試劑與藥品

TCM-199基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和青鏈霉素合劑(Penicillin-strepto，PS)購自于Gibco公司，AREG、GDF9和BMP15購自于R&D Systems公司，促卵泡素(FSH)購自于Bioniche公司，CCK-8購自于北京全式金生物技術(shù)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，葡萄糖測定試劑盒購自于上海榮盛生物技術(shù)公司，NADPH檢測試劑盒和乳酸檢測盒購自于南京建成生物工程研究所，增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒購自于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1

.

2

.

1

COCs的采集

試驗(yàn)所需綿羊卵巢取自呼和浩特屠宰場。將綿羊卵巢用含有1%青鏈霉素合劑的生理鹽水清洗。在卵巢表面分別選取直徑2～6 mm的中腔卵泡和直徑<2 mm的小腔卵泡，使用帶有9#、7#針頭的10 mL注射器分別抽取中、小腔卵泡內(nèi)容物。于體視顯微鏡下挑選抽取獲得的COCs，選擇胞質(zhì)均勻且外周包裹有3層以上卵丘細(xì)胞的COCs，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1

.

2

.

2

卵丘細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將50枚COCs用震蕩器震蕩5 min后，收集分散的卵丘細(xì)胞, 在1 350 r/min下離心5 min，除去上清。然后用培養(yǎng)液離心洗滌2次，除去上清后用培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸, 接種到培養(yǎng)皿中于 37 ℃，5% CO2，95%空氣，飽和濕度下培養(yǎng)。培養(yǎng)液為: TCM-199培養(yǎng)基+10% FBS +1% PS。按照試驗(yàn)設(shè)計在培養(yǎng)液中添加0、5、10、50、100 ng/mL的AREG；添加或不添加0.5個/μL DOs、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。

1

.

2

.

3

卵母細(xì)胞的體外成熟

基礎(chǔ)成熟液是TCM-199+10 μg/mL FSH+3 mg/mL BSA+1%PS，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計在基礎(chǔ)成熟液中分別添或不添加100 ng/mL AREG、GDF9及BMP15。每20枚COCs放入100 μL成熟液滴中，38.6 ℃，5% CO，95%空氣，飽和濕度下培養(yǎng)24 h。

1

.

2

.

4

試驗(yàn)設(shè)計

本研究分別利用分離的卵丘細(xì)胞和COCs開展試驗(yàn)(表1)。在試驗(yàn)2中為了提供卵源性O(shè)SFs添加脫光卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞(Denuded oocytes, DOs)，試驗(yàn)2、3和4中添加的GDF9和BMP15為外源性O(shè)SFs。

1

.

2

.

5

熒光定量PCR檢測基因表達(dá)收集50枚來源于不同直徑卵泡COCs中的卵丘細(xì)胞，使用Trizol抽提法提取細(xì)胞總RNA，按照PrimenScriptRT Master Mix Kit試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

G6PDH

、

PFKM

、

PFKM

和內(nèi)參基因

YWHAZ

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及退火溫度見表2。反映條件為：預(yù)變性：95 ℃ 5 min；變性：95 ℃ 30 s；退火：60 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 30 s；35個循環(huán)；4 ℃終止。以

YWHAZ

基因?yàn)閮?nèi)參， 根據(jù)2法計算各基因mRNA的相對表達(dá)量。

1

.

2

.

6

卵丘細(xì)胞增殖的測定

當(dāng)來源于中腔卵泡或小腔卵泡的原代卵丘細(xì)胞生長到80%，同時將二者消化重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)整為 2×10個/mL，接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL。利用CCK-8試劑盒處理細(xì)胞，在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育2 h后，利用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，按平均吸光度數(shù)值與細(xì)胞增殖成正比。

1

.

2

.

7

細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗檢測

收集培養(yǎng)液，按照說明書加入相應(yīng)試劑，充分混勻，37 ℃水浴中孵育10 min，使用酶標(biāo)儀測定505 nm波長吸光度，讀取標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔的吸光度，分別為A標(biāo)準(zhǔn)、A 樣本。培養(yǎng)液中葡萄糖濃度=A測定/A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度。原培養(yǎng)液中葡萄糖濃度-檢測培養(yǎng)液中葡萄糖濃度=消耗葡萄糖濃度。

1

.

2

.

8

乳酸生成檢測

收集培養(yǎng)液，按照說明書加入樣本、酶工作液、顯色劑，混勻，準(zhǔn)確計時，37 ℃水浴10 min，使用酶標(biāo)儀測定530 nm 波長吸光度，培養(yǎng)液中乳酸濃度=校準(zhǔn)液濃度×(樣本吸光度值-空白吸光度值)/(校準(zhǔn)吸光度值-空白吸光度值)。檢測培養(yǎng)液中乳酸濃度-原培養(yǎng)液中乳酸濃度=乳酸生成濃度。

1

.

2

.

9

培養(yǎng)液或卵母細(xì)胞中NADPH含量檢測

收集培養(yǎng)液或卵母細(xì)胞，按照試劑盒說明書加入堿性提取液，(細(xì)胞需超聲波破碎1 min)，95 ℃水浴5 min。冰浴冷卻后，10 000 g 4 ℃離心10 min，取上清至新管中，加入等體積的酸性提取液?；靹颍?0 000 g 4 ℃離心10 min，取上清于冰上待測。根據(jù)試劑盒說明依序加入試劑，使用酶標(biāo)儀測定570 nm波長吸光值。

1

.

2

.

10

細(xì)胞內(nèi)ATP含量測定

根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用ATP裂解液裂解細(xì)胞,12 000 r/min離心5 min,收集上清用于后續(xù)測定。加100 μL ATP檢測工作液到檢測孔內(nèi)。室溫放置3～5 min。然后在檢測孔內(nèi)加上20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，使用酶標(biāo)儀測定RLU值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每孔細(xì)胞內(nèi)ATP含量。

表1 試驗(yàn)設(shè)計分組信息
Table 1 Group information of experimental design

序號No.試驗(yàn)對象Test subjects各組細(xì)胞數(shù)量Numberof cells ineach group添加物質(zhì)Addedsubstances分組信息Group information檢測指標(biāo)Test index1分離的卵丘細(xì)胞分離自50個COCs無中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞G6PDH、PFKL和PFKM表達(dá)量細(xì)胞增殖2分離的卵丘細(xì)胞分離自50個COCsAREG、DOs、GDF9、BMP15①中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)分別添加0、5、10、50、100 ng/mL AREG。②中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)添加或不添加10 ng/mL AREG、0.5個/μL DOs、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。細(xì)胞增殖3分離的卵丘細(xì)胞分離自50個COCsAREG、GDF9、BMP15中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)添加或不添加10 ng/mL AREG、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗培養(yǎng)液中的乳酸生成培養(yǎng)液中的NADPH卵丘細(xì)胞內(nèi)的ATP4COCs(以COCs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行卵母細(xì)胞IVM)60個COCsAREG、GDF9、BMP15小腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液添加或不添加100 ng/mL AREG、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15,中腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液不添加上述物質(zhì)。培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗培養(yǎng)液中的乳酸生成卵母細(xì)胞內(nèi)的NADPH卵丘細(xì)胞內(nèi)的ATP卵母細(xì)胞內(nèi)的ATP

表2 RT-PCR引物序列
Table 2 The sequence of primers used for RT-PCR

基因Gene引物序列(5′-3′)Primer sequence (5′-3′)退火溫度/℃Annealing temperatureG6PDHF: TGACCTATGGCAACCGATACAAR: CCGCAAAAGACATCCAGGAT60PFKMF: ATCCCTGCCACGGTCTCCAAR: TGCCGCTGACTGCTTGATGC60PFKLF: TTCGTGCTGGAGGTGATGGGR: CTCCCAGCCGTCCTCAGGTG60YWHAZF: TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCTR:TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT60

1

.

2

.

11

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用GLM方差分析事后Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

P

<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量及細(xì)胞增殖能力的比較

檢測中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞中PPP相關(guān)基因

G6PDH

和糖酵解相關(guān)基因

PFKL

和

PFKM

的表達(dá)量。如圖1所示，

G6PDH

、

PFKL

和

PFKM

在小腔卵泡卵丘細(xì)胞的mRNA表達(dá)量均顯著低于中腔卵泡卵丘細(xì)胞(0.905±0.036和1.105±0.038、0.751±0.047和1.334±0.052、0.806±0.025 和1.241±0.046，

P

<0.05)；來源于中腔卵泡和小腔卵泡的第二代卵丘細(xì)胞生長曲線均近似“S”型，中腔卵泡卵丘細(xì)胞在前5 d(120 h)的增殖能力顯著高于小腔卵泡卵丘細(xì)胞(

P

<0.05)，且在第2天(48 h)差距最大。這些結(jié)果說明相比于中腔卵泡卵丘細(xì)胞，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝能力及細(xì)胞增殖能力較弱。

(a)G6PDH、PFKL和PFKM在中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞中的表達(dá)豐度；(b)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的生長曲線；*表示顯著差異，P<0.05。(a) Expression abundance of G6PDH、PFKL and PFKM in cumulus cells from medium and small antral follicles. (b) Growth curve of cumulus cells from medium and small antral follicles. *indicate significant difference (P<0.05).圖1 中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量及細(xì)胞增值能力的比較Fig.1 Expression abundance of G6PDH、PFKL and PFKM in cumulus cells from different diameter antral follicles of sheep

2.2 AREG及OSFs對中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖的影響

在第二代卵丘細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，添加0、5、10、50、100 ng/mL AREG，孵育24 h后檢測細(xì)胞增殖。如圖2(a)所示，與不添加AREG組相比，10、50 和100 ng/mL AREG顯著提高中腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖能力(0.633±0.009、0.689±0.015、0.691±0.011 和0.692±0.016，

P

<0.05)，50和100 ng/mL AREG顯著提高小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖能力(0.400±0.003、0.436±0.006和0.445±0.007，

P

<0.05)，但仍顯著低于所有濃度組的中腔卵泡卵丘細(xì)胞(

P

<0.05)。推測AREG對中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖影響的差異，是因?yàn)樾∏宦雅萋亚鸺?xì)胞上EGFR表達(dá)較低。在第二代卵丘細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，添加10 ng/mL AREG，添加或不添加DOs(提供卵源性O(shè)SFs)和GDF9+BMP15，孵育24 h后檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果如圖2(b)所示，添加DOs而不添加AREG，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖顯著低于中腔卵泡卵丘細(xì)胞(0.667±0.018和0.731±0.011，

P

<0.05)；添加DOs和AREG后，中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖顯著提高(0.786±0.007和0.778±0.022，

P

<0.05)，且中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖無顯著差異(

P

>0.05)；添加AREG和GDF9+BMP15培養(yǎng)的中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞，增殖能力均顯著高于添加AREG和DOs，且兩者間差異不顯著(

P

>0.05)。這說明在滿足OSFs及AREG的條件下，中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖能力可以達(dá)到相同的水平，且GDF9和BMP15代表OSFs發(fā)揮協(xié)同的作用。

(a)不同濃度AREG對中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖的影響；(b)在OSFs作用下，10 ng/mL AREG對中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞增殖的影響；G9：GDF9；B15：BMP15；不同的字母表示顯著差異，P<0.05。(a) The effect of different concentrations of AREG on the proliferation of medium and small antral follicle cumulus cells. (b) The effect of 10 ng/mL AREG on the proliferation of medium and small antral follicle cumulus cells under the effect of OSFs. G9: GDF9, B15: BMP15. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖2 AREG及OSFs對不同直徑卵泡的卵丘細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of AREG and OSFs on the proliferation of cumulus cells from different diameter antral follicles

2.3 在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG對中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的影響

在第二代卵丘細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在添加GDF9+BMP15的基礎(chǔ)上添加或不添加10 ng/mL AREG，培養(yǎng)24 h。檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗以及乳酸、NADPH的生成，檢測卵丘細(xì)胞中ATP的含量。結(jié)果如圖3所示，在不添加AREG的條件下，中腔卵泡卵丘細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗、NADPH生成、乳酸生成及卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著高于小腔卵泡卵丘細(xì)胞(1.000±0.092和0.790±0.065、1.000±0.107和0.250±0.058、1.000±0.047和0.797±0.068、1.000±0.023和0.790±0.042，

P

<0.05)，添加AREG顯著增加中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖消耗、NADPH生成、乳酸生成及卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP含量(1.425±0.051 和1.296±0.049、1.661±0.071和1.393±0.107、1.443±0.048和1.307±0.063、1.209±0.031 和1.099±0.04，P<0.05)，且中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞之間差異顯著(

P

<0.05)。這說明在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG可以增強(qiáng)中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝能力，但添加AREG、GDF9和BMP15后的小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝相對小腔卵泡較低，也進(jìn)一步證明兩者葡萄糖代謝能力的差異。

2.4 IVM培養(yǎng)液中添加AREG、GDF9和BMP15可以增強(qiáng)小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝

(a)培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗；(b)培養(yǎng)液中乳酸的生成；(c)培養(yǎng)液中NADPH的生成；(d)卵丘細(xì)胞中ATP的含量；G9：GDF9；B15：BMP15；在各圖中不添加AREG的中腔卵泡組值標(biāo)記為1，其他各組平均值為該值的相對值，不同的字母表示顯著差異，P<0.05。(a) Relative glucose uptake in culture solution; (b) Relative lactate production in culture solution; (c) Relative NADPH production in culture solution; (d) Relative ATP concentration in cumulus cells. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group without AREG was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖3 在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG對中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的影響Fig.3 Effects of AREG on the glucose metabolism of cumulus cells from different diameter antral follicles under the synergistic effect of GDF9 and BMP15

為了在IVM過程中使小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝提升到中腔卵泡水平，在小腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液中添加AREG、GDF9和BMP15，檢測IVM后培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗、乳酸生成以及卵母細(xì)胞中的NADPH含量。如圖4所示，與對照組相比，添加AREG、GDF9和BMP15顯著提高了小腔卵泡COCs的葡萄糖消耗、乳酸生成和卵母細(xì)胞中的NADPH含量(1.177±0.007和0.169±0.05、1.171±0.091和0.167±0.055、0.984±0.037 和0.846±0.017，

P

<0.05)。另外，添加AREG、GDF9和BMP15的小腔卵泡COCs葡萄糖消耗、乳酸生成顯著高于中腔卵泡COCs(1.177±0.007和1.000±0.07、1.171±0.091和1.000±0.039、0.984±0.037和1.000±0.020，

P

<0.05)，卵母細(xì)胞NADPH含量與中腔卵泡卵母細(xì)胞差異不顯著(

P

>0.05)。檢測IVM后卵丘細(xì)胞以及卵母細(xì)胞中的ATP含量，如圖5所示，與對照組相比，添加AREG、GDF9和BMP15顯著增強(qiáng)小腔卵泡卵丘細(xì)胞及卵母細(xì)胞內(nèi)的ATP含量(1.102±0.011 和0.629±0.127、0.991±0.026和0.721±0.022，

P

<0.05；與中腔卵泡組相比，卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著高于(1.102±0.011和1.000±0.018，

P

<0.05)中腔卵泡卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量與中腔卵泡卵母細(xì)胞差異不顯著(0.991±0.026和1.000±0.011，

P

>0.05)。這說明AREG+GDF9+BMP15可以在IVM中提高小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝水平。

3 討 論

近年來，許多的研究發(fā)現(xiàn)AREG作為一種EGF類因子，可以激活卵丘細(xì)胞上的EGFR信號通路，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，卵母細(xì)胞分泌的OSFs也起到協(xié)同作用。Sugimura等在豬發(fā)育能力較低的小腔卵泡卵母細(xì)胞上的研究上也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果。不同直徑腔卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育能力存在差異，不僅是卵母細(xì)胞自身的問題，也受其周圍卵丘細(xì)胞的調(diào)控，而不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)存在著差異。例如，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的EGFR表達(dá)較低。分離培養(yǎng)不同直徑腔卵泡的卵丘細(xì)胞，可以排除卵母細(xì)胞的影響。因此本實(shí)驗(yàn)以分離的不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞為研究對象，探究他們之間的增殖代謝差異，可以幫助我們理解卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制。

卵丘細(xì)胞的增殖能力，是細(xì)胞的重要生理功能之一，是其代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的體現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，小腔卵泡卵丘細(xì)胞的糖酵解途徑及PPP相關(guān)基因表達(dá)量較低，表明其對葡萄糖代謝的能力較低。這可能與小腔卵泡卵丘細(xì)胞上EFGR信號通路較弱有關(guān)，也與Wigglesworth等在小鼠不同直徑卵泡上的研究結(jié)果一致。卵丘細(xì)胞主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP供給其各項生命活動，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如丙酮酸和乳酸。卵丘細(xì)胞還要通過PPP代謝葡萄糖產(chǎn)生NADPH，以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。所以小腔卵泡卵丘上較低的葡萄糖代謝可能會影響其增殖能力。丙酮酸和NADPH的供給對于卵母細(xì)胞ATP的合成及成熟至關(guān)重要，ATP含量較高的卵母細(xì)胞具有更高的受精率和囊胚發(fā)育率。另外，在檢測IVM過程中卵丘細(xì)胞PPP的強(qiáng)弱時，本研究測定了卵母細(xì)胞內(nèi)的NADPH含量而不是培養(yǎng)液中的NAPDH生成，是因?yàn)樵贑OCs中卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的NADPH需要通過GJC傳遞給卵母細(xì)胞。

(a)培養(yǎng)液中葡萄的消耗；(b)培養(yǎng)液中乳酸的生成；(c)卵母細(xì)胞中NADPH的含量。G9：GDF9；B15：BMP15。在各圖中腔卵泡組的值標(biāo)記為1，其他各組平均值為該值的相對值。不同字母上標(biāo)表示顯著差異，P<0.05。(a) Relative glucose uptake in culture solution; (b) Relative lactate production in culture solution; (c) Relative NADPH concentration in oocytes. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖4 AREG、GDF9和BMP15對小腔卵泡COCs葡萄糖代謝的影響Fig.4 Effects of AREG, GDF9 and BMP15 on glucose metabolism of COCs from small antral follicles

(a)卵丘細(xì)胞內(nèi)ATP 含量；(b)卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量；G9：GDF9；B15：BMP15；在各圖中腔卵泡組的值標(biāo)記為1，其他各組平均值為該值的相對值；不同字母上標(biāo)表示顯著差異，P<0.05。(a) ATP concentration in cumulus cells; (b) ATP concentration in oocytes. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).圖5 AREG、GDF9和BMP15對小腔卵泡卵丘及卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響Fig.5 Effects of AREG, GDF9 and BMP15 on cumulus cells and oocytes ATP concentration from small antral follicular COCs

對來源于不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞添加了不同濃度的AREG，發(fā)現(xiàn)小腔卵泡卵丘細(xì)胞對AREG的敏感度較低，需要較大的濃度才能提高其增殖能力，但還與中等腔卵泡卵丘細(xì)胞有較大的差距?？赡芟鄬τ谥星宦雅萋亚鸺?xì)胞，小腔卵泡卵丘細(xì)胞沒有得到OSFs的足夠刺激。由于不同直徑腔卵泡中的卵母細(xì)胞發(fā)育程度不同，OSFs水平也存在較大差異，例如小腔卵泡卵母細(xì)胞的GDF9和BMP15表達(dá)較低。本研究在不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞培養(yǎng)液中同時添加了來自與中腔卵泡的卵母細(xì)胞，保證相同的OSFs供應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG可以增強(qiáng)不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖及葡萄糖代謝能力，且在一定程度上可以縮小中、小腔卵泡卵丘細(xì)胞的差距。小腔卵泡卵丘細(xì)胞的葡萄糖代謝能力與中腔卵泡卵丘細(xì)胞還有一定的差距，可能是因?yàn)橄嗤瑒┝康腁REG和OSFs對小腔卵泡卵丘上的EGFR信號刺激還不夠。

本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，在小腔卵泡卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液中添加AREG+GDF9+BMP15，可以顯著提高卵母細(xì)胞的能量代謝水平及IVF后的胚胎發(fā)育能力。在本研究中，發(fā)現(xiàn)添加AREG+GDF9+BMP15顯著增強(qiáng)小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝能力，并且高于中腔卵泡的水平，這可能是因?yàn)橥庠刺砑拥腁REG+GDF9+BMP15充分增強(qiáng)了小腔卵泡卵丘細(xì)胞上的EGFR信號通路，由此也增強(qiáng)了小腔卵泡卵丘細(xì)胞向卵母細(xì)胞傳遞代謝物并產(chǎn)生ATP的能力。

4 結(jié) 論

本研究表明，在GDF9和BMP15的協(xié)同作用下，AREG可以增強(qiáng)不同直徑腔卵泡卵丘細(xì)胞的增殖及葡萄糖代謝能力，在IVM培養(yǎng)液中添加AREG+GDF9+BMP15可以提高小腔卵泡COCs的葡萄糖代謝水平。本研究改善了綿羊小腔卵泡卵母細(xì)胞的IVM質(zhì)量，從而提高了綿羊卵母細(xì)胞的利用效率。本研究為家畜動物卵泡發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)，說明了AREG對卵丘細(xì)胞葡萄糖代謝的作用，而卵丘細(xì)胞的EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對其葡萄糖代謝的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。