荊贊革， 裴徐梨， 李成慧， 唐 征， 馮鵬宇

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650214；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 溫州 325006)

【研究意義】植物在生長過程中會受到各種非生物脅迫因素的影響[1-2]。在長期的自然選擇中，植物進化出了一套生長調(diào)節(jié)機制抵御這些不利因素的影響[3-6]。作為主要的非生物脅迫因素之一，漬水脅迫在多雨地區(qū)或季節(jié)會對植物生長和抗病產(chǎn)生不利影響，甚至?xí)r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。因此，研究植物漬水脅迫相關(guān)基因及其在植物抗?jié)n水脅迫過程中的分子調(diào)控機制，對于植物抗?jié)n水脅迫品種的選育改良有重要意義。青花菜屬十字花科蕓薹屬[7]，不耐澇，淹水?dāng)?shù)天后其根系就會死掉[8]。浙江沿海一帶是青花菜的主要產(chǎn)區(qū)之一，每年栽培期間易受臺風(fēng)、暴雨等侵襲，給青花菜生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失[9]。Whirly轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、維持端粒長度、維護細胞器基因組穩(wěn)定性等方面都發(fā)揮著重要功能[10-12]。因此，克隆青花菜Whirly轉(zhuǎn)錄因子，對進一步研究其漬水脅迫響應(yīng)及其生物學(xué)功能具有重要意義。【前人研究進展】第1個Whirly家族成員是從馬鈴薯中分離出來的，其以單鏈形式與誘導(dǎo)應(yīng)答元件ERE結(jié)合，通過調(diào)控Pr-10a基因來調(diào)節(jié)抗病信號傳導(dǎo)途徑[13]。后續(xù)又在三明野生蕉[14]、杧果[15]、土豆[16]、木薯[17]、辣椒[18]、黃瓜[19]等多種園藝作物中鑒定到該基因家族成員。在植物逆境響應(yīng)中，Whirly蛋白質(zhì)可與誘導(dǎo)應(yīng)答元件結(jié)合調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達[19]。Whirly1可調(diào)節(jié)發(fā)育衰老過程中水楊酸的穩(wěn)態(tài)[20-21]。Atwhy1擬南芥突變體對SA誘導(dǎo)的敏感性增加，表明其是該信號途徑中的重要調(diào)控因子。沉默水稻OsWhirly基因可增強超敏反應(yīng)[22]，表明其可能是該反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子[23]。Whirly基因同樣在維持植物細胞器穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。玉米中ZmWHY1基因產(chǎn)生的ZmWHY1蛋白能與CRS1蛋白形成結(jié)合蛋白，促進葉綠體atp內(nèi)含子的剪切。Whirly基因還被認(rèn)為與胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)有關(guān)。例如在Emb16玉米胚乳缺陷突變體中發(fā)現(xiàn)其胚胎發(fā)育停滯，胚乳會繼續(xù)發(fā)育成大胚乳，其原因是Whirly基因突變[21]?！颈狙芯壳腥朦c】雖然在一些有代表性植物如水稻、擬南芥、玉米等深入探討了Whirly基因的部分功能，但大多數(shù)植物中Whirly基因的具體功能尚不清楚，特別是在青花菜等甘藍類蔬菜中。目前關(guān)于青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的作用機理還不清晰透徹。本試驗克隆得到青花菜Whirly基因，分別命名為BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測獲得Whirly基因的理化性質(zhì)參數(shù)、二級結(jié)構(gòu)等，分析青花菜Whirly基因的進化關(guān)系及在漬水脅迫中不同時期的基因相對表達量?！緮M決解的關(guān)鍵問題】本研究通過克隆青花菜Whirly基因，并對其序列特征、系統(tǒng)進化以及漬水脅迫下的表達特征等進行分析，為進一步深入研究其漬水脅迫響應(yīng)及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以青花菜自交系“KU20-7”為試驗材料，常規(guī)育苗。5葉期時進行漬水脅迫處理，處理時間為0、2和6 d，每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 青花菜Whirly基因的克隆

提取葉片總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照本實驗室青花菜轉(zhuǎn)錄組unigene庫中Whirly基因的序列，設(shè)計引物(表1)。RT-PCR反應(yīng)體系和程序參照裴徐梨等[24]的方法進行。對PCR擴增的特異條帶進行克隆測序。

表1 青花菜Whirly基因克隆的引物序列

1.3 青花菜Whirly基因序列特性分析

利用ExPASy proteomice Sever預(yù)測青花菜Whirly蛋白的氨基酸分子量和等電點。利用SOSUI工具預(yù)測青花菜Whirly蛋白氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.4 Whirly蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用軟件MEGA 6.0對青花菜、甘藍、擬南芥、江南卷柏、挪威云杉、無油樟等物種的Whirly氨基酸序列進行多重比對，而后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征分析

以青花菜actin為內(nèi)參基因，檢測青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征。青花菜Whirly基因的熒光定量引物序列見表2。qRT-PCR反應(yīng)體系和程序參照裴徐梨等[24]的方法進行。

表2 青花菜Whirly基因qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 青花菜Whirly基因的克隆

RT-PCR擴增到3個特異條帶(圖1)，測序結(jié)果表明3個特異性條帶均為Whirly基因家族成員，將其命名為BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3。3個基因的長度分別為795、723和783 bp，分別推導(dǎo)編碼264、240和260個氨基酸(圖2)。

M：DL 2000 marker；1～3：目的片段M：DL 2000 marker；1-3：Target fragment圖1 青花菜Whirly 基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Whirly gene in broccoli

下劃線：引物序列Underlines: Primer sequences圖2 青花菜Whirly 基因序列比對Fig.2 Sequence alignment of Whirly gene in broccoli

2.2 青花菜Whirly基因家族成員序列特性分析

BoWHY1理論等電點(pI)為9.18，相對分子質(zhì)量為28.81 kD，包含1個長度為23 aa的跨膜螺旋(RAEFTVLVSAFNFVLPYLIGWHA)。BoWHY2的理論等電點(pI)為9.48；相對分子質(zhì)量為26.22 kD，為可溶性蛋白。BoWHY3的理論等電點(pI)為9.58；相對分子質(zhì)量為28.63 kD，包含1個跨膜螺旋(TKAEFAVLISAFNFILPHLIGWQ)，長度為23 aa。

2.3 Whirly蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，藻類、苔蘚、裸子等低等植物位于進化樹的底端，被子植物則聚為1個大組。被子植物又可分為2個亞組，第1個亞組包含16個Whirly家族成員，其中烏油樟、葡萄、楊樹和木瓜相對獨立，高等植物(擬南芥、蘿卜、白菜、甘藍和青花菜)則聚在一起。十字花科的Whirly基因成員又可細分為2個大分支，青花菜BoWHY1和BoWHY3則位于不同的小分支中。被子植物第2個亞組包含9個Whirly成員，聚類情況和第一亞組基本相同。青花菜BoWHY2位于本亞組中，表明其與BoWHY1和BoWHY3的親緣關(guān)系相對較遠(圖3)。

圖3 青花菜Whirly 基因家族的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Whirly gene family in broccoli

2.4 青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征分析

熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，BoWHY1的表達量隨脅迫時間的延長其表達量逐漸下降。BoWHY2在漬水脅迫2 d時表達上升，表達量為對照的3.21倍，在漬水脅迫6 d時下降，表達量約為對照的1/5。BoWHY3在處理2 d時的表達量為1.42，6 d時的表達量為0.26，呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(圖4)。

圖4 青花菜Whirly 基因在漬水脅迫下的表達特征Fig.4 Expression profile of Whirly gene under waterlogging stress in broccoli

3 討 論

本研究從青花菜中克隆獲得3個Whirly基因家族成員，分別命名為BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3?？紤]部分近緣物種的基因數(shù)量，本研究認(rèn)為已經(jīng)基本上獲得了所有的青花菜Whirly基因。其中BoWHY1與BoWHY3推導(dǎo)的氨基酸序列其氨基酸的個數(shù)相似，均包含1個長度相等、結(jié)構(gòu)相似的二級結(jié)構(gòu)跨膜螺旋。而BoWHY2推導(dǎo)的氨基酸序列在組成其氨基酸的個數(shù)、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)等電點等方面與另外兩者之間存在差異。表明從序列特性的角度來看，BoWHY1與BoWHY3的相似度比BoWHY2更高。利用生物信息學(xué)的方法，分別從甘藍、白菜、擬南芥、蘿卜等物種中鑒定出4、3、3和3個Whirly基因[25-26]。

系統(tǒng)進化的分析結(jié)果顯示，青花菜BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3同被子植物的Whirly成員位于同一大的分支上，其中BoWHY1和BoWHY3位于同一亞組中，而BoWHY2位于另一亞組中，因此筆者推測BoWHY1和BoWHY3屬于旁系同源基因。另外藻類、苔蘚、裸子等低等植物的Whirly在進化樹上自成一個分支并位于進化樹的底端，推測植物Whirly基因可能由一個祖先基因進化而來。這個祖先基因在藻類[27]、苔蘚、蕨類植物中基本上未進行擴張，大多植物僅保留1個拷貝，甚至在個別物種中該基因消失。而到被子植物時該基因則開始擴張，變?yōu)?個拷貝，伴隨著物種的進化以及多倍化過程的進行，不同的物種Whirly基因的數(shù)量則變得不同[16-18]。相對于其他一些成員較多的基因家族，Whirly基因的進化模式是比較簡單的[28-30]。

高等植物的多倍化使其產(chǎn)生很多的旁系同源基因[31-34]，在進化的過程中，這些旁系同源基因會發(fā)生功能上的改變[35]。本試驗通過qRT-PCR檢測了青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征，其表達特征差異明顯，其中BoWHY2的相對表達量在漬水處理2 d達到最大值，是前期的3.21倍。作為旁系同源基因的BoWHY1和BoWHY3，二者在漬水脅迫下的表達特征差異明顯。BoWHY1的表達量隨脅迫時間的延長其表達量逐漸下降，而BoWHY3則呈先上升后下降趨勢，表明其對漬水脅迫的響應(yīng)機制可能存在較大不同。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因就在于長期進化的過程中旁系同源基因BoWHY1和BoWHY3可能發(fā)生了亞功能化。

4 結(jié) 論

本研究克隆了3個青花菜Whirly基因。序列特征分析表明，BoWHY1與BoWHY3的親緣關(guān)系相似度比BoWHY2更高。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)藻類、苔蘚和裸子植物Whirly成員位于進化樹的底端，高等植物Whirly成員則聚在一起，且BoWHY1和BoWHY3具有更近的親緣關(guān)系。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3在漬水脅迫下展現(xiàn)出不同的表達模式。