不同鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2021-05-12 14:09:06宋述銳張衛(wèi)紅
草業(yè)科學(xué) 2021年4期
宋述銳，于 華，黃 椰，張衛(wèi)紅
（1. 中國科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點實驗室 中國科學(xué)院武漢植物園，湖北 武漢 430074；2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）
紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上最重要的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草之一，其生長迅速，適應(yīng)性強，產(chǎn)量高，抗逆性強，素有“牧草之王”之美稱，具有較高的經(jīng)濟價值、應(yīng)用價值和生態(tài)價值[1-2]。紫花苜蓿栽培歷史悠久，其主要在我國華北、西北、東北等地區(qū)廣泛種植。近年來，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)調(diào)整的深入和南方畜牧業(yè)的快速發(fā)展，紫花苜蓿在南方地區(qū)的種植范圍逐漸擴大，但是南方地區(qū)降水量較多，多雨的氣候條件容易造成土壤的漬水[3-4]。值得注意的是，紫花苜蓿對漬水脅迫極其敏感，漬水脅迫往往使紫花苜蓿根系腐爛，病菌滋生，從而造成生產(chǎn)力嚴(yán)重下降[5]。因此，如何有效提高紫花苜蓿的耐漬水能力是南方地區(qū)紫花苜蓿種植過程中亟需解決的重要問題。
漬水脅迫下，紫花苜蓿葉片氣孔關(guān)閉，氣孔導(dǎo)度降低，CO2擴散受阻，蒸騰速率降低；長期漬水脅迫下，葉片葉綠素含量降低，光合系統(tǒng)遭到破壞，PSⅡ受到抑制，電子傳遞受阻，進而導(dǎo)致光合速率降低，紫花苜蓿的生長發(fā)育因此受到不同程度的抑制[6-8]。此外，漬水脅迫會降低紫花苜蓿的鉀元素含量[9]。而鉀元素在提高植物的抗逆過程中具有重要的作用。鉀元素可以提高植物葉綠素a (Chl a)和葉綠素b (Chl b)的含量，促進植物葉綠素的合成和穩(wěn)定；調(diào)節(jié)氣孔的開放和關(guān)閉，控制CO2和水的進出，維持正常膨壓和水分平衡；提高植物PSⅡ的活性，促進電子傳遞及光合磷酸化，調(diào)節(jié)Rubisco 的活性，增強CO2的固定能力，并提高凈光合速率，從而促進植物的抗逆性[10-12]。鑒于此，本研究以紫花苜蓿作為試驗材料，分析了施用不同鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿的生長、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒馓匦院蜖I養(yǎng)品質(zhì)的影響，并比較了硝酸鉀(KNO3) 和氯化鉀(KCl) 對漬水脅迫下紫花苜蓿耐漬水能力的影響，以期為合理利用鉀肥提高紫花苜蓿的耐漬水能力和紫花苜蓿耐澇性研究提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 植物材料與培養(yǎng)
試驗采用盆栽法，即在直徑25 cm、高30 cm 的花盆內(nèi)裝入相同質(zhì)量的土壤。挑選飽滿的紫花苜蓿種子，用0.1% HgCl2消毒5 min 后，蒸餾水沖洗3～4 次后，進行播種，播深1 cm，然后將其置于溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：恒溫28 ℃、14 h /10 h(晝/夜)，光照強度850 μmol·(m2·s)-1，相對濕度60%～70%。待出苗后，每盆保留長勢一致的幼苗20 株，將其繼續(xù)置于該溫室中進行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至1 月齡時對其進行漬水處理。
1.2 試驗設(shè)計與處理
將花盆置入55 cm × 40 cm × 40 cm (長×寬×高)的塑料盆中，以水面淹過土壤表面2 cm 作為漬水脅迫標(biāo)準(zhǔn)。試驗設(shè)置4 個處理，對照處理組(不進行漬水脅迫和施用鉀肥，記作CK)、漬水處理組(單一漬水脅迫，記作W)、漬水 + 5 mmol·L-1KCl 處理組(添加與單一漬水處理組相同體積的5 mmol·L-1KCl 水溶液，記作W + KCl)和漬水 + 5 mmol·L-1KNO3處理組(添加與單一漬水處理組相同體積的5 mmol·L-1KNO3水溶液，記作W + KNO3)，每個處理均為5 次重復(fù)：漬水處理時每3 d 分別補充1 次蒸發(fā)掉的水溶液，使水面一直處于淹過土壤表面2 cm 的狀態(tài)，處理15 d 后進行取樣，并分別測定各項指標(biāo)。
1.3 測定項目與方法
1.3.1 生長特性與生物量的測定
水漬處理15 d 后，每盆隨機選取10 株紫花苜蓿，將幼苗從花盆中取出，將根用自來水沖洗干凈后，再用蒸餾水沖洗3～4 次，用濾紙吸干表面的水分，使用直尺(精度0.1 cm)測量其株高和根長的絕對長度。將根、莖、葉分離后置于105 ℃殺青30 min后，65 ℃烘干至恒重，分別測其質(zhì)量。
1.3.2 葉綠素含量的測定
稱取紫花苜蓿新鮮葉片0.1 g，剪碎，放入10 mL離心管中，加入5 mL 95%酒精，在黑暗條件下振蕩浸提直至組織變白，靜置3～5 min，用分光光度計測665 和659 nm 下的吸光度，計算葉綠素a (Chl a)、葉綠素b (Chl b)和總?cè)~綠素含量(Chl tot)。
Chl a (mg·g-1) = (13.95×OD665- 6.88×OD649) ×0.005 ÷ m；
Chl b (mg·g-1) = (24.96×OD649- 7.32 × OD665) ×0.005 ÷ m；
Chl tot (mg·g-1) = (18.08 × OD649+ 6.63 × OD665) ×0.005 ÷ m。
式中：OD649和OD665分別為浸提液在649 和665 nm下的吸光度，m 為紫花苜蓿葉片質(zhì)量。
1.3.3 葉綠素a 熒光瞬態(tài)曲線的測定
采 用PAM 2500 (Heinz Walz，Germany) 測 定 紫花苜蓿葉片葉綠素a 熒光參數(shù)。測定時首先將紫花苜蓿暗適應(yīng)25 min，然后使用葉綠素?zé)晒鈨x測定葉綠素?zé)晒釵JIP 瞬態(tài)曲線，每個處理測9 次重復(fù)。為了保證所有光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的閉合以獲得真正的最大熒光激發(fā)強度，暗適應(yīng)25 min 后，OJIP 瞬變由3 000 μmol·(m2·s)-1的紅光(λ = 650 nm)激發(fā)，測量強光脈沖引起的葉綠素?zé)晒?，?0 μs 和320 ms之間進行數(shù)字化，使用JIP 測試方法和計算公式計算分析OJIP 瞬時曲線。
1.3.4 慢速熒光參數(shù)的測定
采 用PAM 2500 (Heinz Walz，Germany) 測 定 紫花苜蓿葉片慢速熒光。經(jīng)過30 min 的黑暗適應(yīng)后，在遠(yuǎn)紅外光[FR，730 nm，10 μmol·(m2·s)-1]激發(fā)下測定暗適應(yīng)狀態(tài)下的最小熒光值(Fo)。然后，施加0.8 s飽和脈沖[3 000 μmol·(m2·s)-1]測定暗適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光(Fm)。隨后，給予白光[160 μmol·(m2·s)-1]以誘導(dǎo)光化學(xué)反應(yīng)并使其達(dá)到穩(wěn)定。誘導(dǎo)期間，每施以一次飽和脈沖[3 000 μmol·(m2·s)-1]，以記錄光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光產(chǎn)量(F'm)，用于淬滅分析。在誘導(dǎo)結(jié)束時，關(guān)閉光照，立即在遠(yuǎn)紅光激發(fā)下記錄光適應(yīng)狀態(tài)(F'o)的最小熒光。
1.4 統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)均通過Excel 2010 進行匯總，采用SPSS 19.0 對其進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 檢驗對不同處理組紫花苜蓿的株高、生物量、葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)進行方差分析和多重比較，結(jié)果以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Origin 軟件作圖，不同小寫字母表示顯著性差異(P ＜ 0.05)。
2 結(jié)果與分析
2.1 鉀肥對漬水脅迫下對紫花苜蓿生長特性的影響
施用鉀肥能夠有效提高紫花苜蓿的耐漬水能力。如圖1A 所示，漬水脅迫下，紫花苜蓿莖稈變紅、變細(xì)。根系發(fā)黑腐爛，葉片脫落。然而，漬水脅迫下施用KCl 和KNO3均能夠有效減緩了紫花苜蓿葉片的脫落和根系的發(fā)黑程度，其中KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿的緩解作用優(yōu)于KCl。此外，漬水脅迫顯著抑制了紫花苜蓿的根長，較對照降低了29.24%(P ＜ 0.05)；而漬水脅迫下施用KCl 和KNO3能夠有效緩解漬水脅迫對紫花苜蓿株高和根長的抑制作用，其株高較漬水處理分別提高了8.99% (P ＞ 0.05)和14.65% (P ＜ 0.05)，根長也分別顯著 (P ＜ 0.05)提高了34.16%和43.61% (圖1B 和圖1C)。
2.2 鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿生物量的影響
漬水脅迫在限制紫花苜蓿植株和根系伸長生長的同時也抑制了其生物量的積累。漬水脅迫下，紫花苜蓿的根干重和莖葉干重較對照顯著降低了52.0%和27.84% (P ＜ 0.05) (圖2)。施用KCl 和KNO3能夠緩解漬水脅迫對紫花苜蓿生物量積累的抑制。其中，漬水脅迫下施用KCl 時，紫花苜蓿的根干重和莖葉干重較漬水脅迫顯著增加了80.64%和15.18%(P ＜ 0.05) (圖2)。漬水脅迫下施用KNO3時，其根干重和莖葉干重較漬水脅迫顯著增加了97.99%和35.45% (P ＜ 0.05) (圖2)。由此可見，KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿生物量積累的促進作用優(yōu)于KCl 。
2.3 鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量的影響
如圖3 所示，漬水脅迫下，紫花苜蓿葉綠素含量顯著降低(P ＜ 0.05)，葉綠素a (Chl a)、葉綠素b (Chl b)和葉綠素總含量(Chl tot)分別較對照降低了9.45%、60.30%和36.83%，漬水脅迫顯著提高了紫花苜蓿的Chl a/Chl b。由此可見，漬水脅迫對紫花苜蓿葉綠素b 的抑制作用大于對葉綠素a 的抑制作用。KCl和KNO3能夠明顯緩解水漬脅迫對紫花苜蓿葉綠素含量的影響，其中KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素b 含量和總?cè)~綠素的含量的促進作用明顯優(yōu)于KCl。然而，漬水脅迫下施用KCl 時紫花苜蓿的Chl a/Chl b 顯著高于施用KNO3時紫花苜蓿的Chl a/Chl b (P ＜ 0.05)。
2.4 鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿OJIP 瞬態(tài)曲線的影響以及JIP 檢驗
圖 1 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿生長的影響Figure 1 Effects of KCl and KNO3 on growth of alfalfa under waterlogging
植物葉綠素a 熒光與植物的光合作用密切相關(guān)，漬水脅迫下，紫花苜蓿的葉綠素a 熒光Fo(圖4中O 點對應(yīng)的熒光強度值) 高于對照，F(xiàn)m(圖4 中P 點對應(yīng)的熒光強度值)則低于對照。與此相反，無論是KCl 還是KNO3都提高了漬水脅迫下紫花苜蓿的OJIP 熒光瞬態(tài)曲線(圖4A)。為了增加不同處理之間的可比性，隨后對OJIP 曲線按照O-P 標(biāo)準(zhǔn)分析(ΔVt) (圖4B)，漬水脅迫下紫花苜蓿的OJIP 曲線J 點、I 點、P 點的相對熒光強度變化最為強烈，而施用KCl 和KNO3之后，相對熒光強度明顯降低，說明施用鉀之后明顯降低了J 點、I 點、P 點的熒光散耗。將漬水脅迫時紫花苜蓿的OJIP 曲線進行O-K標(biāo)準(zhǔn)化、O-J 標(biāo)準(zhǔn)化以及O-I 標(biāo)準(zhǔn)化之后與CK 組標(biāo)準(zhǔn)化曲線做差而得到差別動力學(xué)曲線ΔWOK、ΔWOJ和ΔWOI，對比發(fā)現(xiàn)，施用鉀肥可以恢復(fù)漬水脅迫所引起的ΔWOK、ΔWOJ和ΔWOI的升高。
為了進一步檢驗KCl 和KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素?zé)晒夤δ軈?shù)和性能指標(biāo)的影響，對其進行JIP-test 分析。首先，從OJIP 熒光瞬態(tài)曲線上對其原始數(shù)據(jù)進行提取(表1)，漬水脅迫和施用鉀肥對紫花苜蓿的初始熒光值(Fo) 均無顯著性差異，但漬水脅迫使得紫花苜蓿的最大熒光值(Fm)顯著低于對照，漬水脅迫下施用KCl 和KNO3顯著增加了紫花苜蓿的最大熒光值(Fm)，較單一漬水處理分別增加了16.13%和20.43%。φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC 是評價葉綠素a 熒光光合效率和量子產(chǎn)率的4 個重要指標(biāo)。漬水脅迫下紫花苜蓿的φEo、ψEo、RC/ABS和?RC 顯著(P ＜ 0.05)低于對照組，較對照分別降低了37.21%、32.08%、40.00% 和34.48%，而漬水脅迫下施用KCl 和KNO3能夠顯著(P ＜ 0.05)增加紫花苜蓿的φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC。其中漬水脅迫下施用KCl 時，其φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC值較單一漬水處理增加了40.74%、33.33%、41.67%和31.58 %。漬水脅迫下施用KNO3時，φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC值較單一漬水處理分別增加了44.44%、36.11%、33.33%和26.32%。ABS/RC、TPo/RC 和REo/RC 是評價葉綠素a 熒光比能量通量的3 個重要指標(biāo)，漬水脅迫顯著增加了紫花苜蓿的ABS/RC、TRo/RC 和REo/RC，較對照分別增加了68.00%、55.22% 和21.62%，漬水脅迫下施用KCl 和KNO3能夠顯著降低紫花苜蓿的ABS/RC 和TPo/RC(P ＜ 0.05)，降低REo/RC (P ＞0.05)。
圖 2 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿生物量的影響Figure 2 Effects of KCl and KNO3 on alfalfa biomass under waterlogging
圖 3 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量的影響Figure 3 Effects of KCl and KNO3 on chlorophyll content of alfalfa under waterlogging
PIABS和PItotal是葉綠素a 熒光的兩個重要性能指標(biāo)。漬水脅迫下紫花苜蓿的PIABS和PItotal顯著低于對照處理，較對照降低了77.04%和73.21%。漬水脅迫下施用KCl 和KNO3與漬水脅迫相比顯著(P ＜0.05)提高了紫花苜蓿的PIABS和PItotal，其中漬水脅迫下施用KCl 時PIABS和PItotal值較單獨漬水處理提高了164.44%和116.67%；漬水脅迫下施用KNO3時，其PIABS和PItotal值較單獨漬水處理提高了162.22%和96.67%。
圖 4 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿OJIP 瞬態(tài)曲線的影響Figure 4 Effects of KCl and KNO3 on the OJIP transient curve of alfalfa under waterlogging
2.5 不同鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿慢速葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
最大光合效率(Fv/Fm) 反映了植物對生長環(huán)境長期適應(yīng)的機制，是反映光合效率最重要的因素之一。漬水脅迫顯著降低了紫花苜蓿的Fv/Fm，然而漬水脅迫下施用KCl 和KNO3相比漬水脅迫能顯著提高紫花苜蓿的Fv/Fm(圖5)。Y(Ⅱ) 為實際光量子產(chǎn)量，Y(NPQ) 為PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額，而Y(NO)為PSⅡ非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額，這三者之間的關(guān)系為Y(Ⅱ) + Y(NPQ) + Y(NO) = 1。漬水脅迫顯著降低了紫花苜蓿的Y(Ⅱ)，同時提高了Y(NPQ)和Y(NO)，而施用KCl 和KNO3顯著提高了紫花苜蓿的Y(Ⅱ)以及降低了Y(NPQ)和Y(NO)，說明施用KCl 和KNO3之后可以提高植物光化學(xué)能的利用，降低熱散耗和熒光散耗。除此之外，漬水脅迫顯著提高了植物的非光化學(xué)淬滅(NPQ和qN)，并降低了植物的化學(xué)淬滅(qP 和qL)，使得更多的光能以熱量等形式散失，進而導(dǎo)致光合速率的降低，而外源施用KCl 和KNO3顯著提高了紫花苜蓿的qP和qL，并降低了NPQ 和qN。ETR 為電子傳遞效率，單獨漬水處理下紫花苜蓿的電子傳遞速率顯著低于對照處理，而施用KCl 和KNO3之后能夠提高漬水脅迫下紫花苜蓿的電子傳遞速率。
3 討論
圖 5 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿熒光參數(shù)的影響Figure 5 Effects of KCl and KNO3 on fluorescence parameters of alfalfa under waterlogging
水在植物的整個生命周期中起著重要的作用，是決定植物生產(chǎn)力的主要因素，但過多或過少的水分都不利于植物生長。南方地區(qū)降水量較多，往往會形成短暫或較長時間的漬水環(huán)境。根系是紫花苜蓿從周圍環(huán)境中吸收營養(yǎng)成分的主要器官，也是漬水脅迫下最先受到影響的部位[3,9,13]。漬水脅迫造成土壤的缺氧環(huán)境，紫花苜蓿的根系功能受到限制，并開始變黑，腐爛，生物量顯著降低，并進一步導(dǎo)致紫花苜蓿葉片失綠發(fā)黃[3-4,6]。而葉片是紫花苜蓿進行光合作用的主要場所[14]，葉片的失綠發(fā)黃其必然導(dǎo)致紫花苜蓿最大光合效率和實際光合效率的降低，從而導(dǎo)致紫花苜蓿生長緩慢，生物量積累減少。
鉀元素常常被稱為“品質(zhì)元素”，可以促進葉綠素合成和光合作用相關(guān)酶的活性[15-17]。據(jù)報道，漬水脅迫下會限制植物對營養(yǎng)元素的吸收和利用，其中特別是氮元素和鉀元素[9,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，漬水脅迫下施用鉀元素能夠提高紫花苜蓿的葉綠素含量、最大光合效率和實際光合效率，從而促進了漬水脅迫下紫花苜蓿生物量的積累。同時，漬水脅迫下鉀肥的施用能有效地保護紫花苜蓿根系，減緩了其腐爛速度，從而促進了紫花苜蓿根系生物量的積累。
氮元素也在植物的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，植物葉綠素和蛋白質(zhì)的合成均與氮元素直接相關(guān)[19-20]。硝態(tài)氮是植物可以直接吸收利用的氮素形態(tài)[19]。而傳統(tǒng)觀念中認(rèn)為紫花苜蓿能夠自己固定氮素，從而在一定程度上忽略了氮肥對提高紫花苜?？鼓嫘缘淖饔?。鉀的施用除了可以改善植物的光合作用，還能夠促進植物對硝態(tài)氮素的吸收和利用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，漬水脅迫下施用KNO3對紫花苜蓿耐漬水能力的促進作用優(yōu)于KCl。其原因可能是漬水脅迫下鉀元素和氮元素的同時施用更能夠促進紫花苜蓿對營養(yǎng)元素的吸收和利用，解除了漬水脅迫紫花苜蓿造成的營養(yǎng)限制，為紫花苜蓿抵抗逆境環(huán)境提供了重要基礎(chǔ)物質(zhì)，促進了葉綠素的合成，減緩了光化學(xué)原件的損傷，減緩漬水脅迫所帶來的影響，提高了紫花苜蓿凈光合速率和生物量的積累。
4 結(jié)論
施用鉀肥(KCl 和KNO3)能夠有效提高漬水脅迫下的紫花苜蓿的葉綠素含量、最大光合效率和實際光合效率，從而提高紫花苜蓿的耐漬水能力。此外，KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿耐漬水能力的作用優(yōu)于KCl，漬水脅迫下同時補充氮肥和鉀肥更能夠有效提高紫花苜蓿的耐漬水能力。
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1 材料與方法
1.1 植物材料與培養(yǎng)
試驗采用盆栽法，即在直徑25 cm、高30 cm 的花盆內(nèi)裝入相同質(zhì)量的土壤。挑選飽滿的紫花苜蓿種子，用0.1% HgCl2消毒5 min 后，蒸餾水沖洗3～4 次后，進行播種，播深1 cm，然后將其置于溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：恒溫28 ℃、14 h /10 h(晝/夜)，光照強度850 μmol·(m2·s)-1，相對濕度60%～70%。待出苗后，每盆保留長勢一致的幼苗20 株，將其繼續(xù)置于該溫室中進行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至1 月齡時對其進行漬水處理。
1.2 試驗設(shè)計與處理
將花盆置入55 cm × 40 cm × 40 cm (長×寬×高)的塑料盆中，以水面淹過土壤表面2 cm 作為漬水脅迫標(biāo)準(zhǔn)。試驗設(shè)置4 個處理，對照處理組(不進行漬水脅迫和施用鉀肥，記作CK)、漬水處理組(單一漬水脅迫，記作W)、漬水 + 5 mmol·L-1KCl 處理組(添加與單一漬水處理組相同體積的5 mmol·L-1KCl 水溶液，記作W + KCl)和漬水 + 5 mmol·L-1KNO3處理組(添加與單一漬水處理組相同體積的5 mmol·L-1KNO3水溶液，記作W + KNO3)，每個處理均為5 次重復(fù)：漬水處理時每3 d 分別補充1 次蒸發(fā)掉的水溶液，使水面一直處于淹過土壤表面2 cm 的狀態(tài)，處理15 d 后進行取樣，并分別測定各項指標(biāo)。
1.3 測定項目與方法
1.3.1 生長特性與生物量的測定
水漬處理15 d 后，每盆隨機選取10 株紫花苜蓿，將幼苗從花盆中取出，將根用自來水沖洗干凈后，再用蒸餾水沖洗3～4 次，用濾紙吸干表面的水分，使用直尺(精度0.1 cm)測量其株高和根長的絕對長度。將根、莖、葉分離后置于105 ℃殺青30 min后，65 ℃烘干至恒重，分別測其質(zhì)量。
1.3.2 葉綠素含量的測定
稱取紫花苜蓿新鮮葉片0.1 g，剪碎，放入10 mL離心管中，加入5 mL 95%酒精，在黑暗條件下振蕩浸提直至組織變白，靜置3～5 min，用分光光度計測665 和659 nm 下的吸光度，計算葉綠素a (Chl a)、葉綠素b (Chl b)和總?cè)~綠素含量(Chl tot)。
Chl a (mg·g-1) = (13.95×OD665- 6.88×OD649) ×0.005 ÷ m；
Chl b (mg·g-1) = (24.96×OD649- 7.32 × OD665) ×0.005 ÷ m；
Chl tot (mg·g-1) = (18.08 × OD649+ 6.63 × OD665) ×0.005 ÷ m。
式中：OD649和OD665分別為浸提液在649 和665 nm下的吸光度，m 為紫花苜蓿葉片質(zhì)量。
1.3.3 葉綠素a 熒光瞬態(tài)曲線的測定
采 用PAM 2500 (Heinz Walz，Germany) 測 定 紫花苜蓿葉片葉綠素a 熒光參數(shù)。測定時首先將紫花苜蓿暗適應(yīng)25 min，然后使用葉綠素?zé)晒鈨x測定葉綠素?zé)晒釵JIP 瞬態(tài)曲線，每個處理測9 次重復(fù)。為了保證所有光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的閉合以獲得真正的最大熒光激發(fā)強度，暗適應(yīng)25 min 后，OJIP 瞬變由3 000 μmol·(m2·s)-1的紅光(λ = 650 nm)激發(fā)，測量強光脈沖引起的葉綠素?zé)晒?，?0 μs 和320 ms之間進行數(shù)字化，使用JIP 測試方法和計算公式計算分析OJIP 瞬時曲線。
1.3.4 慢速熒光參數(shù)的測定
采 用PAM 2500 (Heinz Walz，Germany) 測 定 紫花苜蓿葉片慢速熒光。經(jīng)過30 min 的黑暗適應(yīng)后，在遠(yuǎn)紅外光[FR，730 nm，10 μmol·(m2·s)-1]激發(fā)下測定暗適應(yīng)狀態(tài)下的最小熒光值(Fo)。然后，施加0.8 s飽和脈沖[3 000 μmol·(m2·s)-1]測定暗適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光(Fm)。隨后，給予白光[160 μmol·(m2·s)-1]以誘導(dǎo)光化學(xué)反應(yīng)并使其達(dá)到穩(wěn)定。誘導(dǎo)期間，每施以一次飽和脈沖[3 000 μmol·(m2·s)-1]，以記錄光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光產(chǎn)量(F'm)，用于淬滅分析。在誘導(dǎo)結(jié)束時，關(guān)閉光照，立即在遠(yuǎn)紅光激發(fā)下記錄光適應(yīng)狀態(tài)(F'o)的最小熒光。
1.4 統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)均通過Excel 2010 進行匯總，采用SPSS 19.0 對其進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 檢驗對不同處理組紫花苜蓿的株高、生物量、葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)進行方差分析和多重比較，結(jié)果以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Origin 軟件作圖，不同小寫字母表示顯著性差異(P ＜ 0.05)。
2 結(jié)果與分析
2.1 鉀肥對漬水脅迫下對紫花苜蓿生長特性的影響
施用鉀肥能夠有效提高紫花苜蓿的耐漬水能力。如圖1A 所示，漬水脅迫下，紫花苜蓿莖稈變紅、變細(xì)。根系發(fā)黑腐爛，葉片脫落。然而，漬水脅迫下施用KCl 和KNO3均能夠有效減緩了紫花苜蓿葉片的脫落和根系的發(fā)黑程度，其中KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿的緩解作用優(yōu)于KCl。此外，漬水脅迫顯著抑制了紫花苜蓿的根長，較對照降低了29.24%(P ＜ 0.05)；而漬水脅迫下施用KCl 和KNO3能夠有效緩解漬水脅迫對紫花苜蓿株高和根長的抑制作用，其株高較漬水處理分別提高了8.99% (P ＞ 0.05)和14.65% (P ＜ 0.05)，根長也分別顯著 (P ＜ 0.05)提高了34.16%和43.61% (圖1B 和圖1C)。
2.2 鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿生物量的影響
漬水脅迫在限制紫花苜蓿植株和根系伸長生長的同時也抑制了其生物量的積累。漬水脅迫下，紫花苜蓿的根干重和莖葉干重較對照顯著降低了52.0%和27.84% (P ＜ 0.05) (圖2)。施用KCl 和KNO3能夠緩解漬水脅迫對紫花苜蓿生物量積累的抑制。其中，漬水脅迫下施用KCl 時，紫花苜蓿的根干重和莖葉干重較漬水脅迫顯著增加了80.64%和15.18%(P ＜ 0.05) (圖2)。漬水脅迫下施用KNO3時，其根干重和莖葉干重較漬水脅迫顯著增加了97.99%和35.45% (P ＜ 0.05) (圖2)。由此可見，KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿生物量積累的促進作用優(yōu)于KCl 。
2.3 鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量的影響
如圖3 所示，漬水脅迫下，紫花苜蓿葉綠素含量顯著降低(P ＜ 0.05)，葉綠素a (Chl a)、葉綠素b (Chl b)和葉綠素總含量(Chl tot)分別較對照降低了9.45%、60.30%和36.83%，漬水脅迫顯著提高了紫花苜蓿的Chl a/Chl b。由此可見，漬水脅迫對紫花苜蓿葉綠素b 的抑制作用大于對葉綠素a 的抑制作用。KCl和KNO3能夠明顯緩解水漬脅迫對紫花苜蓿葉綠素含量的影響，其中KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素b 含量和總?cè)~綠素的含量的促進作用明顯優(yōu)于KCl。然而，漬水脅迫下施用KCl 時紫花苜蓿的Chl a/Chl b 顯著高于施用KNO3時紫花苜蓿的Chl a/Chl b (P ＜ 0.05)。
2.4 鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿OJIP 瞬態(tài)曲線的影響以及JIP 檢驗
圖 1 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿生長的影響Figure 1 Effects of KCl and KNO3 on growth of alfalfa under waterlogging
植物葉綠素a 熒光與植物的光合作用密切相關(guān)，漬水脅迫下，紫花苜蓿的葉綠素a 熒光Fo(圖4中O 點對應(yīng)的熒光強度值) 高于對照，F(xiàn)m(圖4 中P 點對應(yīng)的熒光強度值)則低于對照。與此相反，無論是KCl 還是KNO3都提高了漬水脅迫下紫花苜蓿的OJIP 熒光瞬態(tài)曲線(圖4A)。為了增加不同處理之間的可比性，隨后對OJIP 曲線按照O-P 標(biāo)準(zhǔn)分析(ΔVt) (圖4B)，漬水脅迫下紫花苜蓿的OJIP 曲線J 點、I 點、P 點的相對熒光強度變化最為強烈，而施用KCl 和KNO3之后，相對熒光強度明顯降低，說明施用鉀之后明顯降低了J 點、I 點、P 點的熒光散耗。將漬水脅迫時紫花苜蓿的OJIP 曲線進行O-K標(biāo)準(zhǔn)化、O-J 標(biāo)準(zhǔn)化以及O-I 標(biāo)準(zhǔn)化之后與CK 組標(biāo)準(zhǔn)化曲線做差而得到差別動力學(xué)曲線ΔWOK、ΔWOJ和ΔWOI，對比發(fā)現(xiàn)，施用鉀肥可以恢復(fù)漬水脅迫所引起的ΔWOK、ΔWOJ和ΔWOI的升高。
為了進一步檢驗KCl 和KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素?zé)晒夤δ軈?shù)和性能指標(biāo)的影響，對其進行JIP-test 分析。首先，從OJIP 熒光瞬態(tài)曲線上對其原始數(shù)據(jù)進行提取(表1)，漬水脅迫和施用鉀肥對紫花苜蓿的初始熒光值(Fo) 均無顯著性差異，但漬水脅迫使得紫花苜蓿的最大熒光值(Fm)顯著低于對照，漬水脅迫下施用KCl 和KNO3顯著增加了紫花苜蓿的最大熒光值(Fm)，較單一漬水處理分別增加了16.13%和20.43%。φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC 是評價葉綠素a 熒光光合效率和量子產(chǎn)率的4 個重要指標(biāo)。漬水脅迫下紫花苜蓿的φEo、ψEo、RC/ABS和?RC 顯著(P ＜ 0.05)低于對照組，較對照分別降低了37.21%、32.08%、40.00% 和34.48%，而漬水脅迫下施用KCl 和KNO3能夠顯著(P ＜ 0.05)增加紫花苜蓿的φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC。其中漬水脅迫下施用KCl 時，其φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC值較單一漬水處理增加了40.74%、33.33%、41.67%和31.58 %。漬水脅迫下施用KNO3時，φEo、ψEo、RC/ABS 和?RC值較單一漬水處理分別增加了44.44%、36.11%、33.33%和26.32%。ABS/RC、TPo/RC 和REo/RC 是評價葉綠素a 熒光比能量通量的3 個重要指標(biāo)，漬水脅迫顯著增加了紫花苜蓿的ABS/RC、TRo/RC 和REo/RC，較對照分別增加了68.00%、55.22% 和21.62%，漬水脅迫下施用KCl 和KNO3能夠顯著降低紫花苜蓿的ABS/RC 和TPo/RC(P ＜ 0.05)，降低REo/RC (P ＞0.05)。
圖 2 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿生物量的影響Figure 2 Effects of KCl and KNO3 on alfalfa biomass under waterlogging
圖 3 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量的影響Figure 3 Effects of KCl and KNO3 on chlorophyll content of alfalfa under waterlogging
PIABS和PItotal是葉綠素a 熒光的兩個重要性能指標(biāo)。漬水脅迫下紫花苜蓿的PIABS和PItotal顯著低于對照處理，較對照降低了77.04%和73.21%。漬水脅迫下施用KCl 和KNO3與漬水脅迫相比顯著(P ＜0.05)提高了紫花苜蓿的PIABS和PItotal，其中漬水脅迫下施用KCl 時PIABS和PItotal值較單獨漬水處理提高了164.44%和116.67%；漬水脅迫下施用KNO3時，其PIABS和PItotal值較單獨漬水處理提高了162.22%和96.67%。
圖 4 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿OJIP 瞬態(tài)曲線的影響Figure 4 Effects of KCl and KNO3 on the OJIP transient curve of alfalfa under waterlogging
2.5 不同鉀肥對漬水脅迫下紫花苜蓿慢速葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
最大光合效率(Fv/Fm) 反映了植物對生長環(huán)境長期適應(yīng)的機制，是反映光合效率最重要的因素之一。漬水脅迫顯著降低了紫花苜蓿的Fv/Fm，然而漬水脅迫下施用KCl 和KNO3相比漬水脅迫能顯著提高紫花苜蓿的Fv/Fm(圖5)。Y(Ⅱ) 為實際光量子產(chǎn)量，Y(NPQ) 為PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額，而Y(NO)為PSⅡ非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額，這三者之間的關(guān)系為Y(Ⅱ) + Y(NPQ) + Y(NO) = 1。漬水脅迫顯著降低了紫花苜蓿的Y(Ⅱ)，同時提高了Y(NPQ)和Y(NO)，而施用KCl 和KNO3顯著提高了紫花苜蓿的Y(Ⅱ)以及降低了Y(NPQ)和Y(NO)，說明施用KCl 和KNO3之后可以提高植物光化學(xué)能的利用，降低熱散耗和熒光散耗。除此之外，漬水脅迫顯著提高了植物的非光化學(xué)淬滅(NPQ和qN)，并降低了植物的化學(xué)淬滅(qP 和qL)，使得更多的光能以熱量等形式散失，進而導(dǎo)致光合速率的降低，而外源施用KCl 和KNO3顯著提高了紫花苜蓿的qP和qL，并降低了NPQ 和qN。ETR 為電子傳遞效率，單獨漬水處理下紫花苜蓿的電子傳遞速率顯著低于對照處理，而施用KCl 和KNO3之后能夠提高漬水脅迫下紫花苜蓿的電子傳遞速率。
3 討論
圖 5 不同鉀肥(KCl 和KNO3)對漬水脅迫下紫花苜蓿熒光參數(shù)的影響Figure 5 Effects of KCl and KNO3 on fluorescence parameters of alfalfa under waterlogging
水在植物的整個生命周期中起著重要的作用，是決定植物生產(chǎn)力的主要因素，但過多或過少的水分都不利于植物生長。南方地區(qū)降水量較多，往往會形成短暫或較長時間的漬水環(huán)境。根系是紫花苜蓿從周圍環(huán)境中吸收營養(yǎng)成分的主要器官，也是漬水脅迫下最先受到影響的部位[3,9,13]。漬水脅迫造成土壤的缺氧環(huán)境，紫花苜蓿的根系功能受到限制，并開始變黑，腐爛，生物量顯著降低，并進一步導(dǎo)致紫花苜蓿葉片失綠發(fā)黃[3-4,6]。而葉片是紫花苜蓿進行光合作用的主要場所[14]，葉片的失綠發(fā)黃其必然導(dǎo)致紫花苜蓿最大光合效率和實際光合效率的降低，從而導(dǎo)致紫花苜蓿生長緩慢，生物量積累減少。
鉀元素常常被稱為“品質(zhì)元素”，可以促進葉綠素合成和光合作用相關(guān)酶的活性[15-17]。據(jù)報道，漬水脅迫下會限制植物對營養(yǎng)元素的吸收和利用，其中特別是氮元素和鉀元素[9,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，漬水脅迫下施用鉀元素能夠提高紫花苜蓿的葉綠素含量、最大光合效率和實際光合效率，從而促進了漬水脅迫下紫花苜蓿生物量的積累。同時，漬水脅迫下鉀肥的施用能有效地保護紫花苜蓿根系，減緩了其腐爛速度，從而促進了紫花苜蓿根系生物量的積累。
氮元素也在植物的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，植物葉綠素和蛋白質(zhì)的合成均與氮元素直接相關(guān)[19-20]。硝態(tài)氮是植物可以直接吸收利用的氮素形態(tài)[19]。而傳統(tǒng)觀念中認(rèn)為紫花苜蓿能夠自己固定氮素，從而在一定程度上忽略了氮肥對提高紫花苜?？鼓嫘缘淖饔?。鉀的施用除了可以改善植物的光合作用，還能夠促進植物對硝態(tài)氮素的吸收和利用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，漬水脅迫下施用KNO3對紫花苜蓿耐漬水能力的促進作用優(yōu)于KCl。其原因可能是漬水脅迫下鉀元素和氮元素的同時施用更能夠促進紫花苜蓿對營養(yǎng)元素的吸收和利用，解除了漬水脅迫紫花苜蓿造成的營養(yǎng)限制，為紫花苜蓿抵抗逆境環(huán)境提供了重要基礎(chǔ)物質(zhì)，促進了葉綠素的合成，減緩了光化學(xué)原件的損傷，減緩漬水脅迫所帶來的影響，提高了紫花苜蓿凈光合速率和生物量的積累。
4 結(jié)論
施用鉀肥(KCl 和KNO3)能夠有效提高漬水脅迫下的紫花苜蓿的葉綠素含量、最大光合效率和實際光合效率，從而提高紫花苜蓿的耐漬水能力。此外，KNO3對漬水脅迫下紫花苜蓿耐漬水能力的作用優(yōu)于KCl，漬水脅迫下同時補充氮肥和鉀肥更能夠有效提高紫花苜蓿的耐漬水能力。
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