閆小蘭，侯生珍，李鵬翔，王志友，楊葆春，賈建磊

（青海大學農(nóng)牧學院, 青海 西寧 810016）

硫是反芻動物體內(nèi)一種常量礦物質(zhì)元素，也是構(gòu)成牛、羊等動物第一限制性氨基酸的元素，在體內(nèi)通常以有機物的形式存在。硫?qū)λ袆游锒际潜夭豢缮俚?，因為含硫化合物，如氨基酸、激素、B 族維生素和輔酶，是所有生物體正常代謝、結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)功能所必需的。動物對硫的需要是一個適宜量，缺乏和不足均會影響飼料轉(zhuǎn)化率，降低動物的生產(chǎn)性能[1-2]。研究表明，反芻動物的硫需要量通常以氮硫比的形式表示，氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎元素，適宜的氮硫比可促進瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成，促進氮的沉積，從而促進反芻動物的生長[3-4]。動物營養(yǎng)學家們早期研究發(fā)現(xiàn)動物品種、生長時期以及硫來源都是影響動物適宜的氮硫比的因素[5-9]。

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所。研究表明，小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力受小腸組織形態(tài)發(fā)育狀況、腸道消化酶以及腸道菌群多樣性等因素的影響[10]。動物腸道寄居著大量微生物，包括細菌（最多）、古菌、真菌、原蟲和病毒。腸道微生物區(qū)系的形成受個體、年齡、健康狀況和環(huán)境等多種因素的影響?？漳c占小腸長度的2/5，空腸微生物數(shù)量相對較少，主要是與空腸中較快的食糜流動速度有關[11]?？漳c微生物組發(fā)酵結(jié)構(gòu)性碳水化合物生成的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)，具有促進腸道黏液分泌、抑制炎癥發(fā)生和為腸上皮提供能量等作用。此外，SCFAs 還能通過抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDACs)活性的方式促使腸上皮細胞緊密連接，增強機體免疫功能[12]。

目前國內(nèi)飼養(yǎng)模式主要以現(xiàn)有的作物秸稈類為主要粗飼料，這類飼料能量濃度低，粗蛋白含量少。必需氨基酸嚴重缺乏。長期飼喂可造成蛋白質(zhì)的缺乏和氨基酸的不平衡，制約養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展。日糧中添加硫或降低氮硫比能增加飼料的轉(zhuǎn)化率，但是各國的飼養(yǎng)標準對反芻動物的適宜氮硫比的規(guī)定存在一定差異。已有的研究結(jié)果也不盡一致，而且多集中在產(chǎn)毛動物上，并且多以無機硫為添加源，尚未進行有機硫為添加源方面的研究。已有研究主要集中于對反芻動物瘤胃發(fā)酵的影響上，而對于其他消化器官的研究較少。因此，本研究以藏羊為研究對象，用利用率較高的蛋氨酸為補充硫源，通過對空腸組織形態(tài)和微生物結(jié)構(gòu)與功能的研究，從而篩選出藏羔羊所適宜的氮硫比例。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試驗飼糧

試驗選擇健康狀況良好、體重相近[(12.0 ± 1.0) kg]的60 日齡斷奶藏羔羊150 只(公母比1 ∶ 1)，隨機分為5 組，每組30 只，用蛋氨酸和賴氨酸替代精料補充料中的麩皮以此調(diào)節(jié)日糧中的氮硫質(zhì)量比為10.5 ∶ 1(A)、9 ∶ 1 (B)、7.5 ∶ 1 (C)、6 ∶ 1 (D)、4.5 ∶ 1 (E)[8-9]。根據(jù)青海省當?shù)仫暳显吓渲颇芰亢偷鞍姿较嗨贫蛸|(zhì)量比不同的5 組日糧，日糧組成和營養(yǎng)水平如表1 所列。

1.2 試驗設計與樣品采集

將5 組藏羔羊，分別以氮硫質(zhì)量比不同的日糧進行限量飼喂(參考中國肉羊飼養(yǎng)標準，干物質(zhì)采食量為羔羊體重的3%)；采用按組分欄的方式舍飼飼養(yǎng)，分別在每天08:00、16:00 進行飼喂，自由飲水。60 日齡開始補飼(羔羊隨機采食)，預試驗5 d，65 日齡開始正式試驗。飼養(yǎng)至180 日齡后，每組隨機選擇6 只羔羊早上空腹，頸動脈放血屠宰(符合醫(yī)學倫理學)，解剖，采集空腸食糜于凍存管中，液氮帶回實驗室-80 ℃冷凍保存，用于后期空腸食糜細菌多樣性的測定。另外采集空腸組織(長度2～3 cm)用生理鹽水清洗后，立即放入4%多聚甲醛中固定。

表 1 日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutritional level of experimental diets (dry weight basis)

1.3 試驗樣品的測定

1)空腸組織形態(tài)的測定：

空腸組織在固定液中固定3 d 后即可制作冰凍切片，具體制作過程參考于晶[13]方法。制作完成的切片在Olympus BX51 顯微鏡下觀察，Olympus DP21圖像分析系統(tǒng)中的測量工具進行測量。每個樣本隨機選擇3 張非連續(xù)性切片，每張切片選擇3 個非臨近的視野，每個視野中選擇3～5 處測定試驗數(shù)據(jù)。

2)微生物多樣性的測定

將采集的空腸食糜樣品送到北京百邁客科技有限公司利用Illumina Hiseq2500 高通量測序平臺進行測序。主要流程：提取細菌中的DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度合格后，使用位于V3+V4 高變區(qū)兩側(cè)的引物338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R: 5'-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3'進行PCR 擴增，擴增反應條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)，最后在72 ℃下延長7 min。然后將PCR 擴增產(chǎn)物進行純化、定量和均一形成測序文庫，建好的文庫先進行庫文質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Hiseq2500 進行測序。

1.4 生物信息學分析

生物信息學分析具體參考閆小蘭等[14]方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2013 對數(shù)據(jù)初步整理，應用SPSS 25 軟件進行正態(tài)分布檢驗，然后使用Kruskal-Wallis 分析，數(shù)據(jù)以平均值 ± 標準誤表示，P ＜ 0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮硫比對藏羔羊空腸組織形態(tài)的影響

B 組和E 組的空腸絨毛長度和絨毛寬度顯著高于A、C、D 組(P ＜ 0.05)，且A、D 組的絨毛長度顯著高于C 組(P ＜ 0.05)；D 組的隱窩深度顯著高于其他4 組(P ＜ 0.05)，A、C 組的隱窩深度顯著高于B 組和E 組(P ＜ 0.05)；B、E 組的絨毛長度/隱窩深度顯著高于A、C、D 組(P ＜ 0.05)；B 組和E 組的黏膜層厚度顯著高于C、D 組(P ＜ 0.05)，A 組的黏膜層厚度與其他4 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；B 組的肌肉層厚度顯著高于其他4 組(P ＜ 0.05) (表2)。

表 2 飼糧不同氮硫比對藏羊空腸組織形態(tài)的影響Table 2 Effects of different nitrogen to sulfur ratios on jejunum morphology of Tibetan lambs

2.2 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸食糜微生物多樣性的影響

使用QIIME (version 1.8.0)軟件中的UCLUST對Tags 在97% 的相似度閾值下進行聚類，將這些經(jīng)過拼接和優(yōu)化的有效序列數(shù)劃分成1 212 個OTU。每個樣品的OTU 統(tǒng)計結(jié)果如表3 所列。通過每組樣品OTU 的Venn 圖(圖1)可知：A、B、C、D、E 共5 組之間的共有OTU 數(shù)為95 個，獨有OTU 數(shù)分別為37、131、34、42和167個，占OTU總數(shù)的比例分別為3.05%、10.81%、2.81%、3.47%和13.78%，表明B 和E 組OTU的組成與其他組相似度較小，差異較大。

空腸細菌在OTU 水平上基于Bray-Curtis 距離計算的主坐標分析結(jié)果(圖2)顯示，主成分1 和主成分2 的貢獻值分別為17.63% 和12.86%。飼喂同一飼糧的樣品點之間的距離較近，飼喂不同飼糧的樣品點之間的距離較遠。

表3 列出了5 組藏羔羊空腸食糜樣品的Alpha多樣性指數(shù)。結(jié)果顯示，B、E 兩組的Shannon 指數(shù)顯著高于其他組(P ＜ 0.05)；C、D 兩組的Simpson指數(shù)顯著高于A、B、E 組(P ＜ 0.05)；B、D、E 組的Ace指數(shù)顯著高于A、C 組(P ＜ 0.05)；B、E 組的Chao1 指數(shù)顯著高于A、C 組(P ＜ 0.05)，并且與D 組差異不顯著(P ＞ 0.05)?；蛭膸旄采w率均大于99.9%，因此本研究測序深度能夠滿足后續(xù)分析的要求。

表 3 Alpha 多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indices

圖 1 瘤胃液韋恩圖Figure 1 Venn diagram of rumen fluid

圖 2 主成分分析圖Figure 2 PCoA diagram

2.3 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸微生物菌群結(jié)構(gòu)及功能的影響

2.3.1 飼糧氮硫比對藏羔羊空腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

將所得有效序列在不同分類水平上進行物種注釋和統(tǒng)計，本研究在門水平上共注釋得到25 種細菌，其中5 組優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria) (表4)。B 組厚壁菌門的豐度顯著高于C 組(P ＜ 0.05)，但與A、D、E 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；A、C 組的放線菌門豐度顯著高于B、E 兩組(P ＜ 0.05)；B、E 組擬桿菌門的豐度顯著高于A、C 組(P ＜ 0.05)，D 組放線菌門和擬桿菌門的豐度與其他4 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；E 組的變形菌門豐度顯著高于B、D 組(P ＜ 0.05)，A、C 組變形菌門的豐度與B、D、E 組差異不顯著(P ＞ 0.05)。

在屬水平上空腸微生物區(qū)系物種的相對豐度(表5)可看出，厚壁菌門下的克里斯滕森氏菌R7 菌群(Christensenellaceae-R-7-group) 和Quinella 屬、放線菌門下的紅球菌屬(Rhodococcus) 和短桿菌屬(Brevibacterium)以及擬桿菌門下的理研菌科RC9 腸道菌群(Rikenellaceae-RC9-gut-group) 為5 組的優(yōu)勢菌屬。A、C、D 組紅球菌屬的豐度顯著高于B、E 兩組(P ＜ 0.05)；B 組的克里斯滕森氏菌R7 菌群豐度顯著高于其他組(P ＜ 0.05)；A、B 組的Quinella 屬豐度顯著高于D、E 組(P ＜ 0.05)，并且A、B、D、E 組的Quinella 屬豐度與C 組差異不顯著(P ＞ 0.05)；短桿菌屬和理研菌科RC9 腸道菌群的豐度在各組之間差異不顯著(P ＞ 0.05)。

表 4 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸細菌門水平豐度的變化的影響Table 4 Effects of different nitrogen to sulfur ratios on the abundance of jejunum bacteria in Tibetan lambs at the phylum level%

表 5 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸細菌屬水平豐度的變化的影響Table 5 Effects of different nitrogen to sulfur ratios on the abundance of jejunum bacteria in Tibetan lambs at the genus leve l%

2.3.2 功能基因預測

為比較5 組處理在空腸細菌功能上的差異，利用16S rRNA 預測工具PICRUSt 1 軟件對這5 組樣品進行功能預測，在預測基因功能的同時，參考蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(Clusters of orthologous groups of proteins, COG)對預測的功能類別進行注釋(圖3)?？梢钥闯?，從5 組藏羔羊空腸細菌注釋到的COG 分別隸屬于25 個功能類別。其中豐度較高的前5 個功能基因為僅一般功能預測、轉(zhuǎn)錄、氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、碳水化合物運輸和代謝、未知功能。其中A、C 組僅一般功能預測顯著高于B (P ＜ 0.05)，D 組和E 組僅一般功能預測與其他3 組差異不顯著(P ＞0.05)；D 組轉(zhuǎn)錄顯著高于B、E 組(P ＜ 0.05)；未知功能、氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝以及碳水化合物運輸和代謝在各組間差異不顯著(P ＞ 0.05) (表6)。

3 討論與結(jié)論

3.1 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸組織形態(tài)的影響

圖 3 原核生物同源蛋白簇數(shù)據(jù)庫功能注釋Figure 3 COG function note

動物機體的生長發(fā)育不但與營養(yǎng)物質(zhì)的攝入量有關，而且與其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力密切相關[15]。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，維持小腸的正常結(jié)構(gòu)與功能對于動物健康至關重要。評價腸道結(jié)構(gòu)是否完善的指標主要有腸道絨毛高度、隱窩深度、腸壁厚度以及黏膜厚度[16]。絨毛長度和高度決定了腸道內(nèi)容物和腸上皮的接觸面積，其值越大對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收速率也就越強。隱窩是絨毛根部上皮下陷至固有層而形成。隱窩的深淺可以反映隱窩細胞的生成率，隱窩變淺表明腸上皮細胞成熟率增加，分泌功能增強，消化速率加快[17]。絨毛長度和隱窩深度的比值(villus length/crypt depth, V/C)能夠反映小腸吸收功能和黏膜的損傷情況，比值下降，表明成熟腸上皮細胞減少，腸黏膜受到損傷，其消化吸收功能降低[18]。小腸腸壁主要由絨毛和隱窩構(gòu)成，腸道消化酶含量和活性對小腸充分消化吸收日糧營養(yǎng)素起著決定性作用[19]。腸道肌層的主要功能是緊張性收縮維持腸道形態(tài)以及參與腸道運動。研究發(fā)現(xiàn)，腸道組織形態(tài)的發(fā)育受營養(yǎng)物質(zhì)攝入水平的調(diào)控[20]。對于反芻動物而言，飼糧中未被瘤胃發(fā)酵消化的蛋白質(zhì)、非結(jié)構(gòu)性碳水化合物及微生物蛋白質(zhì)進入十二指腸和空腸后由其進行進一步消化吸收。有研究發(fā)現(xiàn)氮硫比不同會影響瘤胃的發(fā)酵水平，因此造成由瘤胃發(fā)酵后流入空腸的營養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量與質(zhì)量有所不同，進而影響空腸的發(fā)育[3-4]。本研究結(jié)果顯示，B 和E 組羔羊的空腸絨毛長度、絨毛寬度、絨毛長度/隱窩深度、黏膜層厚度以及肌層厚度高于其他組，隱窩深度顯著低于其他組，說明氮硫比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1 時小腸的組織形態(tài)發(fā)育較好，更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.2 飼糧不同氮硫比對藏羔羊空腸微生物結(jié)構(gòu)及功能的影響

小腸是動物消化道重要的組成部分，腸道菌群具有參與營養(yǎng)與代謝和免疫與保護、維持腸道菌群平衡、改善腸道環(huán)境、促進動物生長發(fā)育等作用[21]。腸道微生物結(jié)構(gòu)受飼糧的調(diào)控。本研究中，B 和E 組的OTU 個數(shù)高于其他組。多樣性指數(shù)間接反映了微生物群落種類以及結(jié)構(gòu)的多樣性，Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)可反映微生物菌群的多樣性，Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)可反映微生物菌群的豐富度。本研究中B 和E 組的Ace 指數(shù)較高，Shannon 指數(shù)顯著高于其他各組，表明飼糧中氮硫比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1 時藏羔羊空腸微生物的豐富度和多樣性較高。本研究中各組覆蓋度均高于99.9%，覆蓋度高于97% 說明測序樣品取樣充分[22]。因此本次測序結(jié)果能真實地反映藏羔羊空腸微生物群落種類和結(jié)構(gòu)多樣性。

表 6 基因功能豐度Table 6 Gene function abundance%

研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是胃腸道的優(yōu)勢菌門[23-24]。厚壁菌門下的細菌具有分泌淀粉、半乳糖及丁酸等代謝酶的功能，有助于促進機體對能量的吸收，更利于脂肪的沉積；而擬桿菌門主要參與復合碳水化合物的發(fā)酵以及其他有機物的消化[25-26]。另外，有研究表明腸道共生的擬桿菌表達的一種蛋白能夠快速地招募白細胞，從而殺死一種導致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的免疫系統(tǒng)細胞，從而阻止IBD 的發(fā)生[27]。本研究中在所有羔羊空腸細菌中厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門以及變形菌門的相對豐度均較高，是5 組的優(yōu)勢菌門。這與Wang 等[28]研究報道的綿羊胃腸道中細菌主要以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為主的結(jié)果基本一致。厚壁菌門是胃腸道內(nèi)重要的纖維消化菌，能夠消化纖維生成乙酸。擬桿菌門為重要的淀粉消化菌，能夠促進丙酸的沉積[29]。本研究中B 組和E 組的厚壁菌門和擬桿菌門數(shù)量較高，說明B 組和E 組更有利于空腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化。放線菌門諾卡菌科中含有許多機會致病菌，能引起動物多處炎癥反應[30]。本研究中，羔羊空腸放線菌門的豐度呈現(xiàn)C ＞A ＞ D ＞ E ＞ B 的變化趨勢，并且C 組的放線菌門豐度顯著高于B 和E 組，說明氮硫比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1時能有效降低條件病原菌的豐度。另外，B 組互養(yǎng)菌門的相對豐度高于其他組?；ヰB(yǎng)菌門具有降解氨基酸和丙酮酸的能力，屬于革蘭氏陰性厭氧桿菌。在屬水平上，5 組的優(yōu)勢菌群均為紅球菌屬、短桿菌屬、克里斯滕森氏菌科R7 菌群、理研菌科RC9 腸道菌群以及Quinella 屬。紅球菌屬和短桿菌屬均屬于放線菌門諾卡菌科下的菌屬。紅球菌屬是一類可利用許多有機化合物作為唯一碳源的菌屬，但是不具備降解酪蛋白、纖維糖、幾丁質(zhì)、彈性蛋白或木聚糖的能力，并且動物感染后會出現(xiàn)發(fā)燒、乏力等癥狀[31]。短桿菌屬是膽固醇氧化酶的高產(chǎn)菌[32]。在B 和E 組紅球菌屬的豐度顯著低于其他水平，B 組的克里斯滕森氏菌科R7 菌群豐度顯著高于其他各組，理研菌科RC9 腸道菌群在各水平之間差異不顯著，但在B 水平下豐度較高，A 和B 水平下Quinella 屬的相對豐度顯著高于D 和E 組。克里斯滕森氏菌科R7菌群和Quinella 屬是厚壁菌門下的菌屬，與纖維的消化分解有關，而理研菌科具有降解結(jié)構(gòu)性碳水化合物的作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)，理研菌科RC9 腸道菌群能夠促進肌肉中n-3 多不飽和脂肪酸 (n-3 Polyunsaturated fatty acids, n-3PUFA)的沉積。因此，B 和E 組羔羊空腸食糜微生物的結(jié)構(gòu)均有利于動物的生長發(fā)育。

腸道菌群可促進羔羊營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，提高免疫力。本研究中PICRUSt 預測結(jié)果顯示，試驗羊空腸菌群主要的功能與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝等新陳代謝類功能有關，表明腸道菌群積極參與了藏羔羊的日常代謝活動。轉(zhuǎn)錄和能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換與化合物的代謝緊密聯(lián)系。因此本研究結(jié)果也顯示出微生物中含有較高豐度的與轉(zhuǎn)錄、能量轉(zhuǎn)換相關的基因。5 組樣品的微生物群落所具有的基因功能一致，但是相對豐度不同，其原因可能為不同菌群所具有的基因功能具有相似性。

綜上所述，可以得出以下結(jié)論：1) 飼糧氮硫質(zhì)量比為9 ∶ 1 和4.5 ∶ 1 時羔羊空腸組織形態(tài)發(fā)育較好，微生物的相對豐度和多樣性較高；2) 羔羊空腸微生物菌群功能主要集中于氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝和碳水化合物的運輸與代謝；3)蛋氨酸價格較高且有毒性，不適用于羔羊的長期飼喂，因此日糧氮硫質(zhì)量比為9 ∶ 1 更有利于藏羊的規(guī)模化養(yǎng)殖。