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        野薔薇內(nèi)源多胺的HPLC測定方法及其組織變化規(guī)律

        2022-03-15 10:39:28陳金萍楊雯翔鄧致運程文翰
        安徽大學學報(自然科學版) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:冰浴腐胺野薔薇

        陳 銳,陳金萍,楊雯翔,鄧致運,程文翰*

        (1.荊楚理工學院 生物工程學院,湖北 荊門 448000; 2.特色花卉生物育種湖北省工程研究中心,湖北 荊門 448000;3.新疆農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830052)

        多胺(polyamines, 簡稱PAs)存在于幾乎所有生物體內(nèi),多胺分為腐胺(putrescine, 簡稱Put)、亞精胺(spermidine, 簡稱Spd)、精胺(spermine, 簡稱Spm)及熱精胺[1].多胺在植物體內(nèi)被認為像“第二信使”般發(fā)揮重要作用,如調(diào)節(jié)保衛(wèi)細胞質(zhì)膜中依賴電壓的內(nèi)向K+通道,并調(diào)節(jié)氣孔孔徑[2].研究表明,多胺是一種植物生長調(diào)節(jié)劑[3],能參與高等植物體內(nèi)的許多生理過程,諸如形態(tài)發(fā)生、根系形成、花發(fā)育、果實發(fā)育以及衰老等.多胺可在外植體成花過程中積累,是成花的物質(zhì)基礎(chǔ)[4].多胺的合成從鳥氨酸的合成開始,腐胺是合成途徑的中心產(chǎn)物.腐胺是精氨酸經(jīng)兩條不同途徑形成的:一條是由鳥氨酸通過鳥氨酸脫羧酶脫羧直接形成腐胺,另一條是由精氨酸經(jīng)過精胺酸脫羧酶的催化形成鯡精胺,鯡精胺水解成N-氨甲基腐胺后再形成腐胺.腐胺再經(jīng)連續(xù)加入氨丙基殘基生成亞精氨和精氨,而氨丙基是由S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)脫羧產(chǎn)生的脫羧SAM而來.脫羧S-腺苷甲硫氨酸除了作為甲基的供體外,也是多胺和乙烯合成的共同前體.多胺經(jīng)由二胺氧化酶(DAO)和多胺氧化酶(PAO)代謝產(chǎn)生過氧化氫,而過氧化氫是一種重要的信號分子,參與調(diào)控各種生物過程.此外,多胺合成上游的前體精氨酸,在一氧化氮合成酶作用下可以合成一氧化氮(NO),而NO也是生物體內(nèi)最重要的信號分子之一,具有很重要的生物學功能[5-6].在玉米幼胚的離體培養(yǎng)中,外源添加適量多胺,可有效提高根系活力,促進再生,再生苗株高、葉長、葉寬、鮮重均有顯著增加[7].棉花的相關(guān)研究表明,外源多胺可改變內(nèi)源多胺代謝,使內(nèi)源多胺水平增加;在陸地棉體細胞胚胎發(fā)生過程中,多胺可提高誘導成苗率,表現(xiàn)為促進下胚軸產(chǎn)生愈傷組織、胚性愈傷組織分化、早期胚狀體形成、成熟胚分化,最后形成再生植株,在不同時期,發(fā)揮主要作用的多胺不同[8].伏令夏橙的胚性愈傷組織中多胺含量較非胚性愈傷組織高,多胺對其體細胞胚發(fā)生表現(xiàn)為正調(diào)控[9].前人在對棉花[8]和伏令夏橙[9]的研究中還發(fā)現(xiàn),腐胺有利于體細胞胚胎發(fā)生,隨著體胚發(fā)生過程,腐胺逐漸轉(zhuǎn)化為亞精胺和精胺,在胚狀體時期,亞精胺和精胺的水平顯著增加并達到最大值.在枸杞[10]中,腐胺含量先升后降,最后再升至最高,亞精胺只在胚性細胞分化早期出現(xiàn),精胺只在胚狀體發(fā)育晚期出現(xiàn).此外,多胺可增強植物對環(huán)境的適應(yīng)性,提高不同脅迫下植物的抗性,促進生長[11-17].

        野薔薇(RosamultifloraThunb.)是薔薇科薔薇屬雙子葉植物,用途廣泛,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景,但植株的高效再生是前提,而關(guān)于野薔薇體細胞胚胎發(fā)生的報道較少,且體細胞胚誘導率較低[18].多胺在野薔薇組織培養(yǎng)方面的作用目前未見報道,野薔薇不同器官和不同培養(yǎng)時期的組織多胺含量尚不清楚,多胺提取的方法及測定體系也鮮見報道.關(guān)于其他植物組織多胺提取的報道較多,如茶葉[19]、水稻[20]、棉花[21]等均采用高效液相色譜法,以苯甲酰氯做衍生化反應(yīng)劑,以甲醇為溶劑.但多胺含量受基因差異表達影響,不同種植物、不同器官,多胺含量也不盡相同[22],因此,多胺的提取方法也可能不同,需針對不同植物材料建立不同的方法體系.筆者參照程文翰等[21]的方法,以野薔薇為材料,初步探索野薔薇組織多胺的提取方法及高效液相色譜(HPLC)測定方法,并用該法測定野薔薇組培不同階段愈傷組織及莖、葉、花等器官游離多胺的含量,探索野薔薇體細胞胚胎發(fā)生過程中內(nèi)源多胺的變化規(guī)律.

        1 材料與方法

        1.1 植物材料

        試驗所有樣品材料均為當?shù)匾八N薇,于荊楚理工學院內(nèi)取樣.分別取花瓣、花蕊、花苞、莖、葉片,培養(yǎng)3 h,3 d,5 d后的葉片,培養(yǎng)25 d的愈傷組織為材料,上述材料摘取后立即用液氮冷凍,后置于-70 ℃超低溫冰箱中保存,備用.

        1.2 植物組織培養(yǎng)

        在野薔薇生長期(4月初)摘取新鮮幼嫩葉片,流水沖洗盡表面塵土后,移到超凈工作臺內(nèi),用乙醇和升汞消毒滅菌,即得到處理好的無菌野薔薇葉片.滅菌流程如下:先用70%~75%乙醇浸泡30~60 s,立即用無菌水清洗3~5次,再用0.1%~0.2%的升汞浸泡10 min,再次用無菌水清洗3~5次.

        將上述無菌葉片切成邊長為0.5 cm × 0.5 cm的小四方塊,接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中,每皿均勻接種6片,接種時,應(yīng)使葉片背面接觸培養(yǎng)基,葉片正面朝上.完成接種后,放置于無菌組培室培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:溫度28 ℃、光照周期16 h光照/8h黑暗、光照強度2 000~3 000 lx.

        1.3 試劑與儀器

        多胺標準品均購自Sigma公司,純度≥99%;甲醇為色譜純;高氯酸、氫氧化鈉、氯化鈉、苯甲酰氯、乙醚均為國產(chǎn)分析純;水為超純水,電阻率為18.25 MΩ·cm;高效液相色譜儀型號為Waterse2695型,色譜柱型號為Waters C18 20 cm;低溫離心機型號為湘儀TGL-16.

        1.4 試驗方法

        1.4.1 多胺標準品測定

        參考程文翰等[21]的方法,標準品測定:將多胺(Put, Spd, Spm)標準品配置成1 mmol·L-1的混合貯液,取40 μL混合液進行苯甲酰化反應(yīng)及測定,繪制標準曲線.

        1.4.2 野薔薇器官及組織多胺的提取與測定

        分別稱取0.2 g各野薔薇材料,用液氮研磨成粉末,轉(zhuǎn)入2 mL離心管中,立即加入1.5 mL 5%預冷的高氯酸,渦旋2 min,冰浴浸提1 h后12 000 r·min-14 ℃離心20 min,取300 μL上清液于新的2mL離心管中,加入4 μL苯甲酰氯、300 μL 2 mol·L-1NaOH,渦旋30 s,37 ℃水浴衍生化反應(yīng)25 min后,加入400 μL飽和NaCl 、500 μL乙醚,渦旋1 min, 5 000 r·min-14 ℃離心5 min,小心吸取上層300 μL乙醚相于1.5 mL離心管中,打開管蓋,4 000 r·min-125 ℃離心,待乙醚完全揮發(fā)后,加入300 μL甲醇,渦旋5~10 min,靜置溶解1 h,最后8 000 r·min-14 ℃離心1.5 min以去除提取過程中可能含有的少量雜質(zhì),收集苯甲酰多胺的甲醇溶解液至樣品瓶,再加甲醇定容至500 μL,待HPLC檢測.每個野薔薇樣品生物學重復2次,技術(shù)重復3次.數(shù)據(jù)采用Excel 2019版、SPSS 26.0軟件處理,origin 9.6.5軟件繪圖.HPLC檢測參數(shù):流動相為V(甲醇)∶V(水)(60∶40);進樣量15 μL;流速1 mL·min-1;柱溫30 ℃;檢測波長254 nm;保留時間15 min.

        1.5 方法設(shè)計

        1.5.1 苯甲?;磻?yīng)溫度

        參照劉俊等[23]對苯甲酰氯衍生化反應(yīng)時不同溫度的探索,試驗設(shè)置30,37,40 ℃ 3個不同溫度,以探索野薔薇苯甲?;磻?yīng)的最佳溫度.

        1.5.2 冰浴浸提液取用量

        探索不同冰浴浸提液取用量對多胺提取的影響,比較200,300,400 μL 3個不同體積取用量,以確定最終的反應(yīng)體系.

        1.6 回收率測定

        試驗采用梯度加標回收的方法,隨機選取花苞和葉片為樣品材料進行回收率試驗.取不同體積的樣品和標準品冰浴浸提液,按照2∶1 , 1∶1 , 1∶2的配比混合,然后按照1.4.2的流程反應(yīng)、提取分離多胺并測定其含量,每個處理重復3次.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 多胺標準品HPLC測定

        將3種多胺標準品反應(yīng)液按比例加入甲醇,以此推算標準品濃度.經(jīng)HPLC檢測后,對測定結(jié)果以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標作圖,得到標準曲線(如圖1所示).標準曲線的線性方程:腐胺Puty=0.003 9x+0.001 2(R2=0.994 5);亞精胺Spdy=0.003 9x+0.000 8(R2=0.998 2);精胺Spmy=0.000 9x+0.002 7(R2=0.996 8).

        3種多胺混合液經(jīng)HPLC測定,分離出單個多胺的色譜峰,峰型良好無重疊,可得到單個多胺標準品的出峰時間(保留時間),以此確定待測樣品中的色譜峰為何種多胺.由于氨基酸數(shù)目不同,Put(二胺)、Spd(三胺)、Spm(四胺)苯甲?;磻?yīng)后3種多胺的極性差異較大,在分離過程中,3種多胺依次出峰,未出現(xiàn)峰重疊現(xiàn)象(如圖2所示).

        圖1 多胺標準曲線 圖2 多胺標準品測定色譜圖

        2.2 野薔薇內(nèi)源多胺的提取及測定

        試驗以葉片為材料,比較了苯甲?;磻?yīng)溫度(30, 37,40 ℃)、不同冰浴浸提液用量(200,300,400 μL)對野薔薇多胺提取的影響,HPLC檢測結(jié)果表明(如表1所示):3個不同溫度對提取結(jié)果無顯著性差異;冰浴浸提液為300 μL時,精胺峰面積最大,顯著大于取400 μL浸提液的峰面積,而亞精胺峰面積無顯著差異,300 μL為冰浴浸提液最佳反應(yīng)用量.綜合3種多胺的提取效果,最終選擇37 ℃作為反應(yīng)溫度,300 μL為最佳體系.

        表1 不同處理下多胺的相對含量 mg·g-1

        2.3 野薔薇組織培養(yǎng)物HPLC測定

        按照1.4.2方法中所列參數(shù),對野薔薇組織做HPLC檢測.樣品中3種多胺的出峰時間分別為:腐胺(Put)3.5 min,亞精胺(Spd)5.5 min,精胺(Spm)9.1 min,色譜圖如圖3所示,3種多胺依次出峰,無重疊,峰型良好,峰高、峰寬適宜,出峰時間與多胺標準品一致.

        圖3 野薔薇組織多胺測定色譜圖

        2.4 回收率測定

        回收率是檢驗提取方法是否可靠的依據(jù).較高的回收率說明提取方法具有較高的準確性.實驗測定結(jié)果如表2所示:回收率為87.17%~103.64%,標準差為1.71~4.60,表明方法可靠.

        表2 加標回收率

        2.5 野薔薇不同組織內(nèi)源游離多胺含量

        試驗取自然生長的野薔薇花瓣、花蕊、花苞、莖、葉片,培養(yǎng)3 h,3 d,5 d后的葉片,培養(yǎng)25 d的愈傷組織為材料(如圖4所示),測定內(nèi)源多胺含量,測定結(jié)果如圖5所示.

        (a)3 h 葉片;(b)3 d葉片;(c)5 d葉片;(d)25 d愈傷組織;(e)葉片;(f)花瓣和花蕊;(g)花苞;(h)莖.圖4 野薔薇組織與器官

        在野薔薇體細胞胚胎發(fā)生過程中(3 h,3 d,5 d,25 d callus),內(nèi)源多胺總量呈現(xiàn)出先逐漸上升,再逐漸下降的變化趨勢,在培養(yǎng)3 d后達到最大值0.295 mg·g-1(FW),培養(yǎng)25 d的愈傷組織中多胺含量顯著下降,在野薔薇器官(花瓣、花蕊、花苞、葉、莖)中,花蕊的多胺含量最高,野薔薇體胚發(fā)生過程多胺總含量是野薔薇器官的2.5倍(如圖 5(a));體胚發(fā)生過程中Put相對含量先升高后降低,在3 d時達到最高相對含量0.259 mg·g-1(FW),與其他時期以及其他組織相比均有極顯著差異,其他組織Put含量無顯著性差異(圖 5(b));Spd在各組織中含量最高,其中,5 d時含量最多,達到0.265 mg·g-1(FW),花蕊其次,含量為0.050 4 mg·g-1(FW),體細胞胚胎發(fā)生過程中,Spd含量變化趨勢與多胺總量變化趨勢一致,不同組織間Spd含量差異為5 d>花蕊>3 d>3 h>25 d>葉>花瓣>莖>花苞(圖5 (a),(c));野薔薇組織中Spm含量較少,在5 d時達到最高,并且顯著高于花、莖、葉、愈傷,其相對含量為0.006 36 mg·g-1(FW),Spm含量變化趨勢與腐胺含量變化趨勢一致(圖5(b),(d)).以上結(jié)果表明,多胺可能對野薔薇體細胞胚胎發(fā)生有調(diào)控作用.

        (a)多胺總量;(b)腐胺含量;(c)亞精胺含量;(d)精胺含量.數(shù)據(jù)是平均值±標準偏差(n = 3);條形上方的不同小寫字母表示根據(jù)LSD多重比較在p< 0.05處存在顯著差異,相同小寫字母表示根據(jù)LSD多重比較在p< 0.05處無顯著差異.圖5 野薔薇不同組織多胺含量

        3 討 論

        多胺性質(zhì)不穩(wěn)定,易分解,直接測定難度較大且結(jié)果不準確[24].過去檢測多胺的方法有氨基酸分析儀、紙電泳和熒光比色等, 但這些方法的樣品回收率低、靈敏度不高[25].現(xiàn)在主要采用HPLC法檢測植物內(nèi)源多胺,該方法較為成熟、靈敏、迅速[23].該試驗采用高效液相色譜(HPLC)法檢測野薔薇花瓣、花蕊、花苞、莖、葉,以及組織培養(yǎng)過程不同階段(3 h,3 d,5 d,25 d callus)的內(nèi)源多胺(腐胺、亞精胺、精胺)含量,15 min內(nèi)3種多胺可完全分離,通過對標品的線性分析,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,可用得到的回歸方程計算樣品中的多胺含量.通過多次方法和技術(shù)重復試驗,得到樣品多胺的HPLC色譜圖及數(shù)據(jù)分析柱形圖,樣品出峰時間與標準品基本一致,峰型適宜,該方法能很好地測定野薔薇組織內(nèi)源多胺含量.在提取樣品多胺時,取0.2 g樣品材料、300 μL冰浴浸提液、苯甲酰氯衍生化反應(yīng)37 ℃,多胺可被充分提取,經(jīng)HPLC檢測結(jié)果較好.由于苯甲酰多胺不宜長期保存,在-70 ℃時避光環(huán)境下貯存1周后, 亞精胺就會開始發(fā)生變化, 高于-70 ℃則3種多胺均會發(fā)生不同程度的分解, 在24 h 內(nèi),多胺衍生物不會發(fā)生明顯分解[26],故須在提取后盡快檢測,以免誤差太大影響測定結(jié)果.通過預實驗得知,苯甲酰衍生化反應(yīng)的時間不宜過短,會造成反應(yīng)不完全,苯甲酰氯殘留,影響測定結(jié)果;也不宜過長,可能會使多胺分解,造成出現(xiàn)多個色譜峰的情況.提取多胺過程中,冰浴浸提和衍生化反應(yīng)的溫度、時間長短,對多胺含量測定有重要影響.程文翰等[21]的研究中,冰浴浸提3 h、37 ℃衍生化反應(yīng)30 min,棉花組織多胺溶解量達到最大值;劉俊等[23]對苯甲酰衍生化反應(yīng)溫度及時間做了研究,發(fā)現(xiàn) 37 ℃反應(yīng)20~25 min,峰面積最大且副反應(yīng)少,室溫(30 ℃左右)反應(yīng) 30~40 min也可獲得十分接近的結(jié)果,隨著溫度升高(< 37 ℃),Put的反應(yīng)更加完全,而Spd與Spm的面積變化無顯著差異.筆者所采用的方法為冰浴浸提1 h、37 ℃苯甲酰化反應(yīng)25 min,峰面積較大.在12.2 min左右,檢測樣品出現(xiàn)一個色譜峰,峰面積較小,推測可能是熱精胺(五胺),需要做質(zhì)譜法進一步檢測.目前提取多胺多采用10 mL體系,如程文翰等[21]取棉花組織培養(yǎng)物0.4 g,胡文等[20]取秈稻愈傷組織1 g,蔣學美等[25]取荔枝葉片2.0 g,對樣品材料的用量較大.筆者參照程文翰等[21]的方法,并對提取體系做了優(yōu)化,用2 mL體系即可提取出野薔薇內(nèi)源多胺,可減少樣品及試劑的用量,簡化操作.

        在植物組織離體培養(yǎng)過程中,多胺能發(fā)揮諸多生理效應(yīng)[27],如代謝、發(fā)育調(diào)控以及非生物脅迫反應(yīng)[28].該研究表明:在野薔薇花瓣、花蕊、花苞、莖、葉中,花蕊的多胺總含量及3種多胺含量均高于其他器官,暗示多胺可能與植物受精及性別分化有關(guān).野薔薇是雌雄同花植物,由于采集花蕊時,未將雌蕊與雄蕊分開,無法得知雌雄蕊多胺含量的規(guī)律.相較于野薔薇器官,在野薔薇的體胚發(fā)生過程中,內(nèi)源多胺含量較高,不同培養(yǎng)階段其含量變化較大,則多胺很可能參與了野薔薇體細胞胚胎發(fā)生過程,在不同時期對體胚發(fā)生的作用不同.腐胺向下游產(chǎn)物亞精胺和精胺轉(zhuǎn)化,使它們含量增加,說明在體細胞胚胎發(fā)生初期腐胺可能發(fā)揮著重要作用,腐胺向亞精胺和精胺的轉(zhuǎn)化,可能有利于野薔薇體細胞胚胎發(fā)生.在野薔薇愈傷組織增殖階段,精胺作用可能不顯著,根據(jù)前人的研究結(jié)果[8-10],精胺可能會在體細胞胚胎發(fā)生后期胚狀體及再生苗階段發(fā)揮作用.目前對多胺在野薔薇體內(nèi)的代謝通路還未見報道,闡明多胺如何影響野薔薇體細胞胚胎發(fā)生和多胺作用機制尚需探究.

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