張斐斐,劉圓圓,王炎炎,楊雅云,阿新祥,湯翠鳳,董 超,王 斌,胡 劍

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650205；3.農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650205；4.農(nóng)業(yè)部云南稻種資源科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，昆明 650205； 5.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國際農(nóng)業(yè)研究所，昆明 650205；6.怒江綠色香料產(chǎn)業(yè)研究院，云南 瀘水 673199)

【研究意義】近年來，植物病毒—介體昆蟲—寄主植物三者互作關(guān)系已經(jīng)成為國際上的研究熱點(diǎn)。一方面，植物由于其不可移動性而經(jīng)常受到不同類型植食性昆蟲的取食和病毒的侵染，影響其生長和代謝過程，進(jìn)而影響植物的產(chǎn)量及品質(zhì)[1-2]。另一方面，大部分植物病毒需要介體來傳播，而昆蟲是病毒傳播的重要的介體[3-4]。病毒侵染寄主植物后會引起植物體內(nèi)一系列的生理過程發(fā)生變化，也會進(jìn)一步影響介體昆蟲對寄主的選擇行為及其生長發(fā)育等特性，最終又影響介體對于病毒的傳播[1]。它們之間的互作會對其個(gè)體及整個(gè)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)物種的種群動態(tài)產(chǎn)生重要影響。因此，植物病毒—介體昆蟲—寄主植物三者互作機(jī)制的解析有助于為抵抗植物病害與蟲害提供新的防控策略。【前人研究進(jìn)展】煙粉虱[Bemisiatabaci(Gennadius)]為半翅目粉虱科的一類具刺吸式口器的小型昆蟲，是一類具有入侵性的農(nóng)業(yè)害蟲，包含不少于40個(gè)在形態(tài)學(xué)上不可分辨的隱種[5-6]。不同隱種間在宿主范圍、取食習(xí)性、病毒傳播力、抗藥性、內(nèi)共生菌組成等方面都存在顯著差異。煙粉虱的寄主范圍廣泛，在其生存過程中通過口器取食寄主植物韌皮部的汁液維持生命，進(jìn)而導(dǎo)致植株衰弱，若蟲和成蟲在取食過程中還可以分泌蜜露，誘發(fā)煤污病的產(chǎn)生，影響果實(shí)的品質(zhì)及價(jià)值。此外，煙粉虱還可以傳播多種植物病毒，引發(fā)多種植物病害，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失[3,7-8]。梁鑫等[9]發(fā)現(xiàn)B煙粉虱為害可顯著降低3種葫蘆科寄主植物的株高、莖粗、葉面積和單位面積干重。蔡沖等[10]的研究表明在響應(yīng)B煙粉虱隱種脅迫時(shí)，不同品種之間存在差異，具體表現(xiàn)為抗蟲番茄品種響應(yīng)次生代謝物質(zhì)含量和防御酶活性的變化更強(qiáng)烈，而感蟲品種響應(yīng)光合參數(shù)、活性氧、細(xì)胞膜脂過氧化和胰蛋白酶抑制劑活性的變化更強(qiáng)烈。嘎奧云朝倫等[11]研究發(fā)現(xiàn)番茄木虱的取食顯著提高了番茄葉片抗氧化酶的活性，誘導(dǎo)了抗病蛋白的表達(dá)及水楊酸信號途徑?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對雙生病毒—煙粉虱—寄主植物三者互作的機(jī)制已有一定了解[12-16]，云南本地雙生病毒及煙粉虱隱種類型豐富，但云南本地雙生病毒優(yōu)勢種、云南煙粉虱優(yōu)勢種與寄主植物三者之間的互作關(guān)系還不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】以不同番茄品種為實(shí)驗(yàn)材料，通過接入云南煙粉虱優(yōu)勢種MED隱種取食或接種兩種云南本地雙生病毒優(yōu)勢種PaLCuCNV和TYLCTHV，探究不同雙生病毒、媒介昆蟲及其互作對不同番茄品種生長發(fā)育及防御基因表達(dá)的影響，以期為將來的田間煙粉虱和植物病毒防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的番茄品種，分別為合作903、荷粉二號、奧尼爾，TYLCTHV(泰國番茄黃化曲葉病毒)和PaLCuCNV(中國番木瓜曲葉病毒)侵染性克隆為毒源，MED隱種煙粉虱為供試蟲源。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為：處理1(CK)，不對植株做任何處理的對照組；處理2，接種滅菌ddH2O組；處理3，接種PaLCuCNV組；處理4，接種TYLCTHV組；處理5，MED煙粉虱取食組;處理6，接種PaLCuCNV 并放入MED煙粉虱取食組；處理7，接種TYLCTHV 并放入 MED煙粉虱取食組。每處理測量6棵番茄植株，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 感毒植株的獲取 番茄種子置于25 ℃的溫度條件下浸種催芽，2 d后取出，轉(zhuǎn)入基質(zhì)土(基質(zhì)∶蛭石∶珍珠鹽∶有機(jī)肥=5∶1∶1∶1)中育苗，14 d后，移栽到內(nèi)徑為12 cm，高10 cm的花盆。

將PaLCuCNV和TYLCTHV于-80 ℃取出解凍，在YEP固體培養(yǎng)基(含100 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平)上劃線，并在28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，然后挑單菌落置于20 mL YEP液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL利福平)中，最后置于溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中培養(yǎng)16～18 h 至OD值為0.6～0.8時(shí)用于接種。番茄長至3～4葉時(shí)，用一次性無菌注射器給植株接種PaLCuCNV和TYLCTHV。

1.3.2 病毒檢測 接毒14 d后采集葉片，提取DNA，分別用PaLCuCNV(F: 5′-TAGTCATTTCCAC TCCCGC-3′，R: 5′-TGAAAGTCATACTTCGCAGC-3′)和TYLCTHV(F: 5′-CGGAATTCCGCCTTTAATTTGAACTGG-3′，R: 5′-GCGTCGACCTTGCCAACAAAA TAAAGTG-3′)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行病毒檢測。擴(kuò)增體系20 μL (10×PCR buffer 0.4 μL,dNTPs 1.6 μL,上下游引物(10 μM)各0.4 μL,Taq0.4 μL)，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，(PaLCuCNV 52 ℃,TYLCTHV 55 ℃)退火30 s,72 ℃延伸10 s，30個(gè)循環(huán)。

1.3.3 番茄株高的測量 各處理組番茄植株從接毒開始日用刻度尺測量地上部分到植株最頂端的距離，每7 d量取1次，處理5，處理6和處理7中的番茄植株按60頭/株的投放量放入煙粉虱取食，所有材料一同置于人工可控溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

表1 熒光定量PCR所用基因及引物序列

1.3.4 植株鮮重與干重測定 剪取各處理組番茄植株地上部分，置于電子天平上稱量鮮重，放入托盤中置于80 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重，稱量干重。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將各處理組的幼嫩葉片剪下，加入液氮，用Trizol抽提液提取葉片RNA，用TSINGKE的Goldenstar TMRT6 cDNA Synthesis Mix的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，熒光定量的具體方法參照2×TSINGKE Master qPCR Mix試劑盒說明書進(jìn)行。以UBI基因?yàn)閮?nèi)參，所使用引物的信息如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用軟件SPSS 17和Sigmaplot 12.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和制圖， 并運(yùn)用Duncan’s檢驗(yàn)法對顯著性差異(P<0.05)進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙生病毒侵染、煙粉虱取食及其互作對不同品種番茄株高的影響

如圖1所示，與對照相比， 給植株接種滅菌ddH2O的處理對番茄的株高基本沒有影響，而感染PaLCuCNV和TYLCTHV的番茄植株株高顯著地降低(P<0.05)。經(jīng)煙粉虱取食的番茄植株株高比正常植株低2～5 cm，雙生病毒感染并伴有煙粉虱取食的番茄植株株高發(fā)生大幅度下降。相同處理對不同品種番茄的影響差異較大。病毒和煙粉虱雙重影響下，3種番茄品種中合作903的株高降幅最大，奧尼爾次之，荷粉二號的降幅最小，且PaLCuCNV對番茄株高的影響比TYLCTHV的要大。隨著時(shí)間的推移，各處理組間番茄植株的株高差異越來越顯著(P<0.05)。

2.2 雙生病毒侵染、昆蟲取食及其互作對番茄植株生物量的影響

如圖2所示，對荷粉二號植株鮮重與干重的影響由強(qiáng)到弱的是PaLCuCNV與MED煙粉虱互作>MED煙粉虱取食>PaLCuCNV侵染，而對奧尼爾和合作903植株鮮重與干重的影響由強(qiáng)到弱的是PaLCuCNV與MED煙粉虱互作>PaLCuCNV侵染>MED煙粉虱取食。對荷粉二號植株干重的影響由強(qiáng)到弱的是MED煙粉虱取食>TYLCTHV與MED煙粉虱互作>TYLCTHV侵染，對荷粉二號植株鮮重、奧尼爾和合作903的干重和鮮重的影響由強(qiáng)到弱的是TYLCTHV與MED煙粉虱互作>TYLCTHV侵染>MED煙粉虱取食。

2.3 雙生病毒侵染、昆蟲取食及其互作對番茄防御基因表達(dá)的影響

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SA(水楊酸)和JA(茉莉酸)信號途徑中NPRI、LOX、PIII和PRI4個(gè)防御基因的表達(dá)情況(以荷粉二號的正常番茄植株為對照)，如圖3所示。在不同番茄植株中，雙生病毒侵染、MED煙粉虱取食和雙生病毒-MED煙粉虱互作都會誘發(fā)NPRI、LOX、PIII和PRI這幾個(gè)防御基因不同程度地上調(diào)表達(dá)。其中，荷粉二號和合作903中基因上調(diào)的幅度較奧尼爾的要大，且SA信號途徑中的NPRI和PRI的上調(diào)幅度較JA信號途徑中的LOX和PIII也要大。同一番茄品種中的同一基因，不同的處理所引起的基因表達(dá)也是差異顯著。以荷粉二號為例，與對照相比，各處理均能引起LOX的上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)幅度不一致，以PaLCuCNV與MED煙粉虱互作影響最大，然后分別是MED煙粉虱取食、TYLCTHV與MED煙粉虱互作、TYLCTHV侵染、PaLCuCNV侵染。引起NPRI上調(diào)表達(dá)的幅度由大到小的處理分別是PaLCuCNV與MED煙粉虱互作、TYLCTHV與MED煙粉虱互作、PaLCuCNV侵染、TYLCTHV侵染和MED煙粉虱取食。引起PIII上調(diào)表達(dá)的幅度由大到小的處理分別是PaLCuCNV與MED煙粉虱互作、TYLCTHV與MED煙粉虱互作、PaLCuCNV侵染、TYLCTHV侵染和MED煙粉虱取食。引起PRI上調(diào)表達(dá)的幅度由大到小的處理分別是PaLCuCNV與MED煙粉虱互作、TYLCTHV與MED煙粉虱互作、PaLCuCNV感染、TYLCTHV侵染和MED煙粉虱取食。

A: 合作903；B: 奧尼爾；C: 荷粉二號。CK：不對植株做任何處理的對照組；ddH2O：接種滅菌ddH2O組；PaLCuCNV：接種PaLCuCNV組；TYLCTHV：接種TYLCTHV組；Whitefly：MED煙粉虱取食組；PaLCuCNV + whitefly，接種PaLCuCNV 并放入MED煙粉虱取食組；TYLCTHV + whitefly，接種TYLCTHV 并放入 MED煙粉虱取食組。下同A: Heizuo903; B: Aonier; C: Hefen2;CK:Control; ddH2O:Inoculated with distilled water; PaLCuCNV:Plants infected with PaLCuCNV; TYLCTHV:Plants infected with TYLCTHV; Whitefly:Health tomato plants had whiteflies feeding on them; PaLCuCNV + whitefly:Plants infected with PaLCuCNV and had whiteflies feeding on them; TYLCTHV + whitefly:Plants infected with TYLCTHV and had whiteflies feeding on them; The same as below圖1 雙生病毒侵染、煙粉虱取食及其互作對番茄株高的影響對番茄株高的影響Fig.1 The effect of virus infection,whitefly feeding,and their interaction on plant height of tomatoes

3 討 論

植物病毒—介體昆蟲—寄主植物三者互作關(guān)系微妙而復(fù)雜。一方面為抵御病菌與植食性昆蟲的危害，植物進(jìn)化出一套復(fù)雜的機(jī)制以保證能快速感應(yīng)并啟動防御反應(yīng)，另一方面，病菌與植食性昆蟲也進(jìn)化出一套相應(yīng)地躲避或抵制植物防御反應(yīng)的機(jī)制。通常，植食者取食時(shí)誘發(fā)的植物防御反應(yīng)會引起植物體內(nèi)物質(zhì)分配從生長轉(zhuǎn)向防御，從而抑制植物的生長發(fā)育。實(shí)驗(yàn)采用人工接毒的方法模擬番茄感毒狀態(tài)，接滅菌水的番茄植株株高與正常植株無明顯差異，可排除實(shí)驗(yàn)過程中機(jī)械損傷對番茄植株株高的影響，在實(shí)驗(yàn)中受到PaLCuCNV和TYLCTHV兩種雙生病毒侵染的番茄植株其株高明顯受到抑制，正常植株放入煙粉虱取食后，其株高也會降低，與有關(guān)雙生病毒和煙粉虱的危害報(bào)道比較一致[19-20]。而實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)煙粉虱和病毒共同作用時(shí)顯著降低了各番茄植株的株高，說明煙粉虱和病毒互作的效果要比它們單作的效果強(qiáng)，且具有加強(qiáng)效應(yīng)。其次，病毒侵染和煙粉虱取食后，各番茄植株的鮮重和干重與正常植株相比較，均會降低，且病毒侵染組的降幅比煙粉虱取食組的降幅要大，當(dāng)二者一起作用時(shí)，各番茄植株的鮮重與干重更是大幅下降，這說明雙生病毒和煙粉虱能夠不同程度地影響番茄植株體內(nèi)水分的運(yùn)輸和干物質(zhì)的積累，而當(dāng)二者一起在番茄植株上作用時(shí)，這種影響是疊加的，從而降低番茄植株的鮮重與干重。

JA和SA途徑為目前已知的參與高等植物防御反應(yīng)的重要途徑[21-22]。有研究表明寄主植物遭受病毒侵染或煙粉虱取食均會引起茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)途徑防御基因的表達(dá)。脂氧合酶(LOX)是JA合成途徑中的重要關(guān)鍵酶，通過脂氧合酶途徑合成的茉莉酸甲酯、茉莉酸酮酸和7-異茉莉酸都可激活植物的防御基因，從而在植物的生長發(fā)育過程中對環(huán)境脅迫反應(yīng)中起著調(diào)控的作用[23]。Shi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與其它處理相比，被攜帶TYLCV的MED煙粉虱取食的番茄植株中JA的含量、JA途徑LOX和PIII的表達(dá)量都是最低的，顯示攜帶TYLCV的MED煙粉虱能顯著抑制寄主植物的防御反應(yīng)。Lin等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，不同的昆蟲及昆蟲組合取食都能誘導(dǎo)黃瓜LOX的顯著上調(diào)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中，番茄植株在雙生病毒侵染和雙生病毒與煙粉虱互作雙重脅迫下，LOX普遍上調(diào)表達(dá)，表明JA途徑參與了番茄抵御雙生病毒侵害與煙粉虱取食的防御反應(yīng)過程。NPR1是SA信號途徑中重要的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在植物的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Shi等[18]發(fā)現(xiàn)帶毒B煙粉虱取食能誘發(fā)SA信號途徑NPR1和PR1的上調(diào)表達(dá)，而帶毒MED煙粉虱取食卻不能。實(shí)驗(yàn)中，不同處理均能誘發(fā)番茄NPR1和PR1的上調(diào)表達(dá)，且整體上調(diào)幅度較JA途徑中的LOX和PIII的要大，說明不同處理在番茄植株中誘發(fā)的 SA信號途徑反應(yīng)更強(qiáng)烈。

HF: 荷粉2號;Aoer: 奧尼爾;HZ: 合作903。不同小寫字母表示不同處理、不同材料之間在0.05水平差異顯著HF:Heifen2; Aoer:Aonier;HZ:Hezuo903.Different lower-case letter indicated that there was significant difference between different treatment and varieties at the significance level of 0.05圖2 雙生病毒侵染、煙粉虱取食及其互作對不同番茄植株生物量的影響Fig.2 The impact of virus,insect and virus-insect interaction on tomato biomass

4 結(jié) 論

云南本地雙生病毒優(yōu)勢種PaLCuCNV和TYLCTHV侵染、MED煙粉虱取食及其互作均能不同程度地影響番茄植株株高和鮮干重，普遍表現(xiàn)為雙生病毒-MED煙粉虱互作的影響最大。同一處理對番茄植株株高和鮮干重的影響也呈現(xiàn)出品種間的差異，呈現(xiàn)對合作903的影響最大，奧尼爾次之，荷粉二號的影響最小。此外，不同處理均能誘導(dǎo)SA和JA信號途徑中NPRI、LOX、PIII和PRI4個(gè)防御基因的上調(diào)表達(dá)，且SA信號途徑中的NPRI和PRI

圖3 各植株中防御基因在不同處理下的表達(dá)差異Fig.3 Defensive gene expression in tomatoes under different treatments

的上調(diào)幅度較JA信號途徑中的LOX和PIII也要大。綜上所述，植物病毒—介體昆蟲—寄主植物之間的互作關(guān)系及機(jī)制因植物種類、昆蟲種類及病毒種類的不同而不同，還需要針對不同的組合情況進(jìn)一步地深入分析。