張吉松, 張 卓, 張德詠, 張戰(zhàn)泓, 劉 勇, 史曉斌,*, 張友軍

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 長沙 410125; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 北京 100081; 3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 長沙 410125; 4. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 長沙 410125)

煙粉虱Bemisiatabaci隸屬于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，現(xiàn)在普遍認為煙粉虱是一個至少由36種形態(tài)上無法區(qū)分但遺傳結(jié)構(gòu)差異顯著的隱存種組成的隱存種復(fù)合群(cryptic species complex)(劉銀泉和劉樹生, 2012; 劉健全, 2016; 劉樹生, 2016; 徐偉和車靜, 2019)。目前主要利用線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ(mitochondrial cytchrome oxidase Ⅰ, mtCOⅠ)基因酶切法來區(qū)分。中國境內(nèi)危害最嚴重的兩種煙粉虱隱存種分別是：起源于中東和小亞細亞地區(qū)的Middle East-Asia Minor 1煙粉虱，簡稱MEAM1，也稱B型煙粉虱；起源于地中海地區(qū)的Mediterranean煙粉虱，簡稱MED，也稱Q型煙粉虱(Chuetal., 2010; Huetal., 2011)。MED目前已經(jīng)是國內(nèi)田間優(yōu)勢種群，但還存在MEAM1和MED混合發(fā)生的情況(Zhengetal., 2021)。煙粉虱傳播多種植物病毒病，影響植物生長、造成植物減產(chǎn)是煙粉虱嚴重危害世界農(nóng)業(yè)安全的方式之一。煙粉虱可以傳播200余種植物病毒，主要包括番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)等(Jones, 2003; 衛(wèi)靜等, 2015)。

ToCV隸屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬Crinivirus。ToCV主要通過媒介昆蟲煙粉虱以半持久非循環(huán)方式傳播(Polstonetal., 2014; Orfanidouetal., 2016)。ToCV的流行與煙粉虱的發(fā)生密切相關(guān)(Shietal., 2018)。 該病毒的寄主主要有茄科(Solanaceae)和夾竹桃科(Apocynaceae)等7個科的植物(Wintermantel and Wisler, 2006; 周濤等, 2014)。ToCV的不同傳毒介體其傳毒能力有差異，尤其是在煙粉虱中，與煙粉虱的種類、數(shù)量和取食時間密切相關(guān)，例如ToCV在MEAM1中保留時間為2 d，但是在MED中保留時間達到6 d(Wintermantel and Wisler, 2006)；番茄上ToCV感病株率隨著帶毒MED煙粉虱數(shù)量與取食時間的增加而明顯升高等(代惠潔等, 2016; Orfanidouetal., 2016)。

辣椒Capsicumannuum是中國的重要蔬菜和調(diào)味品，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前全國辣椒播種面積130萬hm2，產(chǎn)量2 700萬t，年產(chǎn)值達270億元(徐小萬等, 2008)。煙粉虱及其傳播的ToCV病毒病是為害辣椒的重要因素，嚴重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。關(guān)于煙粉虱-ToCV-辣椒三者之間的互作關(guān)系還尚未探究過，尤其是煙粉虱在辣椒上的獲毒和傳毒特性，以及煙粉虱對健康和帶毒辣椒的取食偏好，明確這些問題將幫助我們采取有效措施對辣椒病毒病進行防控。

本研究通過利用室內(nèi)飼養(yǎng)的煙粉虱MEAM1和MED成蟲及ToCV cDNA侵染性克隆，對MEAM1和MED在辣椒上獲取和傳播ToCV能力進行比較研究，同時比較它們對健康和攜帶ToCV辣椒的取食偏好。分析不同煙粉虱隱種在辣椒上傳播ToCV的差異，解析昆蟲-病毒-植物之間復(fù)雜的互作關(guān)系，用于指導(dǎo)田間及辣椒種植區(qū)防治煙粉虱和ToCV病毒病。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲和植物

1.1.1煙粉虱：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所饋贈。煙粉虱MEAM1和MED都飼喂在番茄植株上，并在溫室中隔離飼養(yǎng)，溫度條件：平均溫度25±2℃，相對濕度70%±5%，光周期14L∶10D。在實驗之前，將煙粉虱MEAM1和MED分別轉(zhuǎn)移至健康的辣椒苗上分開飼養(yǎng)，并且每隔2個月通過提取煙粉虱的DNA，使用mtCOⅠ酶切鑒定方法(Khasdanetal., 2005; Chuetal., 2010)進行種群鑒定，飼養(yǎng)6代后的成蟲用于本實驗。

1.1.2辣椒：由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所提供，品種為自交系6421，并在溫室內(nèi)種植，溫室條件：平均溫度26±2℃，相對濕度70%±5%，光周期14L∶10D。期間沒有使用任何農(nóng)藥以及接觸昆蟲。

1.2 辣椒感染ToCV

ToCV侵染性克隆由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院周濤老師課題組構(gòu)建與饋贈。由于ToCV侵染性克隆接種辣椒的成功率較低，因此首先用ToCV侵染性克隆接種黃瓜，確認黃瓜帶毒之后，用健康煙粉虱取食已感染ToCV的黃瓜植株48 h，用吸蟲器吸取50頭獲毒后的煙粉虱放入微蟲籠中并將其夾在健康辣椒植株(4-5葉期)的底部葉片進行傳毒，4 d后移去煙粉虱并摘掉該葉片。25 d后檢測傳毒是否成功，確認感染ToCV的辣椒植株可用于后續(xù)試驗。

1.3 煙粉虱獲取ToCV能力測定

取剛羽化的健康煙粉虱MEAM1和MED成蟲，分別放在不同的干凈養(yǎng)蟲籠中，用微蟲籠分別將其夾在感染ToCV的辣椒植株上，每個處理用20棵辣椒植株，每棵辣椒植株放5個微蟲籠，每個微蟲籠內(nèi)放40頭煙粉虱成蟲。設(shè)置6個接蟲時間(接蟲后6, 12, 24, 48, 72和96 h)，在每個時間點分別從接有煙粉虱MEAM1和MED成蟲的辣椒植株中隨機選取3棵，每棵取蟲各20頭，存放于-80℃冰箱。最后提取煙粉虱成蟲RNA，用熒光定量PCR法分別測定不同時間內(nèi)煙粉虱MEAM1和MED成蟲體內(nèi)ToCV表達量，與未在感染ToCV的辣椒植株上取食的煙粉虱體內(nèi)ToCV表達量對比，測定煙粉虱的獲毒量。ToCV的qPCR擴增引物設(shè)計根據(jù)其外殼蛋白(coat protein, CP)序列設(shè)計(Shietal., 2018): ToCV-2F: 5′-ATGGAGAACAGCCGTTGG-3′; ToCV-2R: 5′-TTAGCAACCAGTTATCGATGC-3′; WF-F: 5′-CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT-3′; WF-R: 5′-CCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC-3′；煙粉虱內(nèi)參基因Actin和EF-1α引物參考Shi等(2018)設(shè)計: Actin-F: 5′-CGCTGCCTCCACCTCATT-3′; Actin-F: 5′-ACCGCAAGATTCCATACCC-3′; EF-1αF: 5′-TAG CCTTGTGCCAATTTCCG-3′; EF-1αR: 5′-CCTTCAG CATTACCGTCC-3′。根據(jù)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(Vazyme)的AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒的操作說明書，反應(yīng)體系: 2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 L, 正反向引物各0.4 μL, cDNA 1 L, ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 1 min; 95℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 40次循環(huán)。利用qTOWER3G qPCR儀(Analytik Jena公司)進行檢測。反應(yīng)結(jié)束后采集目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)分析基因的相對表達量。每個處理重復(fù)3次。

1.4 煙粉虱傳播ToCV能力測定

選取攜帶ToCV的煙粉虱MEAM1和MED成蟲1, 10和30頭3組，按1.2節(jié)獲毒48 h后將其分別轉(zhuǎn)移到3片葉片的健康小辣椒苗上。接毒48 h后，將煙粉虱吸走，并分別將通過煙粉虱MEAM1和MED成蟲接毒后的植物放入不同的干凈養(yǎng)蟲籠中進行培養(yǎng)，1, 10和30頭的處理組在接毒后30 d時檢測其是否帶毒，30頭的處理組分別在接毒后30, 40, 50和60 d 時取對應(yīng)的辣椒葉片，提取葉片RNA，用熒光定量PCR法比較葉片帶毒量與未接觸獲毒48 h后的煙粉虱的葉片進行對比，比較煙粉虱MEAM1和MED成蟲在辣椒上的傳毒量的差異，方法同1.3節(jié)。煙粉虱內(nèi)參基因Actin和UBI引物參照Shi等(2018)設(shè)計: Actin-F: 5′-GGAAAAGCTT GCCTATGTGG-3′; Actin-R: 5′-CCTGCAGCTTCCAT ACCAAT-3′; UBI-F: 5′-TCGTAAGGAGTGCCCTAAT GCTGA-3′; UBI-R: 5′-CAATCGCCTCCAGCCTTGTT GTAA-3′。每個處理重復(fù)3次。

1.5 煙粉虱對辣椒植株的取食選擇性測定

分別取1株感染ToCV和1株健康辣椒放入干凈的養(yǎng)蟲籠中(兩株辣椒生長情況相同)，二者間隔20 cm。每個養(yǎng)蟲籠為1個重復(fù)，共設(shè)6個重復(fù)。早上6:00-7:00時，用吸蟲器吸取飼養(yǎng)在健康辣椒上取食的健康煙粉虱MEAM1和MED成蟲各約100頭，分別將其轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL離心管中，并將離心管放于2棵植物下端的中心處，打開離心管的蓋子，讓煙粉虱自行爬出離心管進行取食選擇。在煙粉虱做完選擇后調(diào)查每株辣椒上煙粉虱的數(shù)量，每個處理重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS2.0(SPSS Inc., Chicago, IL, 美國)對數(shù)據(jù)進行分析，用重復(fù)測量方差分析(repeated measures ANOVA)用于分別比較煙粉虱MEAM1和MED成蟲在獲毒、傳毒方面的差異；比較煙粉虱對辣椒取食選擇性的數(shù)據(jù)采用Generalized Linear Model方差分析，并用Duncan氏多重比較進行差異顯著性分析，顯著水平設(shè)為P<0.05；作圖采用GraphPad Prism 7。

2 結(jié)果

2.1 煙粉虱獲取ToCV能力

通過在感染ToCV辣椒植株上取食的煙粉虱體內(nèi)ToCV表達量進行對比發(fā)現(xiàn)，在攜帶ToCV的辣椒植株上，隨著取食時間的增加，煙粉虱MEAM1和MED成蟲體內(nèi)病毒的積累量均逐漸增多。同時，煙粉虱MED成蟲病毒積累量的上升趨勢快于煙粉虱MEAM1成蟲，且煙粉虱MED成蟲能從攜帶ToCV的辣椒植株上獲得更多病毒，接蟲后96 h時，煙粉虱MED成蟲獲毒量是煙粉虱MEAM1成蟲的1.74倍，兩者差異極顯著(P<0.001)(圖1)。

圖1 煙粉虱MEAM1和MED成蟲在攜帶ToCV的辣椒植株上的獲毒量差異Fig. 1 Differences in the level of virus acquisition by Bemisiatabaci MEAM1 and MED adults on ToCV-infectedCapsicum annuum plants圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上星號表示兩組間差異顯著(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(重復(fù)測量方差分析)。Data in the figure are mean±SE. Asterisks above bars indicate significant difference between two groups (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(repeated measures ANOVA).

2.2 煙粉虱傳播ToCV能力測定

對1, 10和30頭煙粉虱MEAM1和MED成蟲在辣椒植株上的傳毒率進行對比發(fā)現(xiàn)，10和30頭煙粉虱成蟲傳毒后，煙粉虱MED成蟲的傳毒率顯著高于煙粉虱MEAM1成蟲的(P<0.05)，傳毒率平均相差29%，此外，隨著煙粉虱數(shù)量的增加，煙粉虱MED和MEAM1成蟲在辣椒植株上的傳毒率也增加(圖2)。

圖2 不同數(shù)量煙粉虱MEAM1和MED成蟲在辣椒植株上的傳毒率差異Fig. 2 Differences in the virus transmission rate by different numbers of Bemisia tabaci MEAM1 and MED adults on Capsicum annuum plants圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上符號表示兩組間差異顯著性(nsP>0.05; *P<0.05)(重復(fù)測量方差分析)。圖3同。Data in the figure are mean±SE. Symbols above bars indicate significance of difference between two groups (nsP>0.05; *P<0.05)(repeated measures ANOVA). The same for Fig. 3.

根據(jù)傳毒率試驗結(jié)果，選用30頭煙粉虱成蟲的傳毒量進行對比發(fā)現(xiàn)，接毒40和50 d后，煙粉虱MED的傳毒量均顯著高于煙粉虱MEAM1的(P<0.05)，煙粉虱MED成蟲傳毒量平均是煙粉虱MEAM1成蟲的10倍(圖3)。

圖3 煙粉虱MEAM1和MED成蟲在辣椒植株上接蟲后不同時間的傳毒量差異Fig. 3 Differences in the level of virus transmission inCapsicum annuum plants transmitted by Bemisiatabaci MEAM1 and MED adults at different time after inoculation每植株接種30頭煙粉虱成蟲進行傳毒量測定。On each plant 30 adults of B. tabaci were inoculated to determine the level of virus transmission.

攜帶ToCV的兩種煙粉虱侵染的辣椒植株和葉片的癥狀也完全不一樣，被煙粉虱MED成蟲侵染的辣椒有明顯的褪色變形，癥狀比被煙粉虱MEAM1成蟲侵染的更加明顯(圖4和5)。

圖4 被攜帶ToCV的煙粉虱MED(A)和MEAM1(B)成蟲侵染后的辣椒植株癥狀Fig. 4 Symptoms of Capsicum annuum plants infected by Bemisia tabaci MED (A) and MEAM1 (B) adults carrying ToCVA: 接種帶ToCV的MED成蟲的辣椒植株C. annuum plants infected with MED adults carrying ToCV; B: 接種帶ToCV的MEAM1成蟲的辣椒植株C. annuum plants infected with MEAM1 adults carrying ToCV.

圖5 煙粉虱MEAM1和MED成蟲傳毒后的辣椒葉片癥狀Fig. 5 Symptoms of Capsicum annuum leaves infected by viruliferous Bemisia tabaci MEAM1 and MED adultsA: 接種攜帶ToCV的MED成蟲的辣椒葉片C. annuum leaf infected with MED adults carrying ToCV; B: 接種攜帶ToCV的MEAM1成蟲的辣椒葉片C. annuum leaf infected with MEAM1 adults carrying ToCV.

2.3 煙粉虱對辣椒植株的取食選擇性

可以發(fā)現(xiàn)，健康的煙粉虱MEAM1和MED成蟲對健康和感染ToCV辣椒植株取食趨向相似，即健康的煙粉虱MEAM1和MED成蟲皆傾向于取食被ToCV侵染的辣椒植株，并且煙粉虱MED成蟲選擇感染ToCV的辣椒植株的數(shù)量高于煙粉虱MEAM1成蟲(圖6)。

圖6 煙粉虱MEAM1和MED成蟲對辣椒植株的取食選擇性Fig. 6 Feeding preference of Bemisia tabaci MEAM1 and MED adults to Capsicum annuum plantsNV: 健康辣椒植株Healthy C. annuum plants; V: 攜帶ToCV的辣椒植株C. annuum plants carrying ToCV. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；三星號表示兩組間差異極顯著(P<0.001, 重復(fù)測量方差分析)。Data in the figure are mean±SE. The triple asterisks indicate extremely significant difference between two groups (P<0.001, repeated measures ANOVA).

3 結(jié)論與討論

ToCV首次在佛羅里達州被報道之后，在十幾年時間內(nèi)迅速傳遍世界，2004年在我國臺灣首次發(fā)現(xiàn) (Tsaietal., 2004)，之后又在我國山東被報道發(fā)現(xiàn)，很快傳播到其他地區(qū)，造成極大危害(Tzanetakisetal., 2013; Zhaoetal., 2013)。ToCV不能靠汁液摩擦傳播，僅靠媒介昆蟲粉虱進行傳播，雖然ToCV是辣椒上的重要病害之一，然而不同煙粉虱在辣椒上傳播量和傳播效率仍缺乏研究，而明確這些問題能夠幫助我們提前采取措施，減少ToCV在辣椒上的發(fā)生。

煙粉虱在感染ToCV辣椒植株上的獲毒試驗表明，煙粉虱MEAM1和MED成蟲在帶毒的辣椒植株上0-96 h獲毒量逐漸積累，煙粉虱MED成蟲的獲毒能力總體比煙粉虱MEAM1成蟲強(圖1)，該結(jié)果與在研究攜帶ToCV番茄上煙粉虱MEAM1和MED成蟲獲取ToCV差異結(jié)果(Shietal., 2018)相似。不同的是，在相同時間內(nèi)，煙粉虱在辣椒上的獲毒量低于煙粉虱在番茄上的獲毒量，可能是由于感染ToCV后，番茄比辣椒更適合煙粉虱。此外，不同試驗環(huán)境和不同的操作也可能會造成差異。

煙粉虱在辣椒植株上的ToCV傳毒試驗表明，煙粉虱MED成蟲傳毒能力高于煙粉虱MEAM1成蟲(圖2)，該結(jié)果與研究攜帶ToCV的煙粉虱MEAM1和MED成蟲在番茄上傳毒能力的試驗結(jié)果(Shietal., 2018)相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著煙粉虱數(shù)量的增加，煙粉虱MED的傳毒量高于MEAM1，并造成了辣椒植株上更為顯著的褪綠癥狀(圖4和5)。煙粉虱傳播番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)的結(jié)果表明煙粉虱MED成蟲的獲毒和傳毒能力都強于煙粉虱MEAM1成蟲(Panetal., 2013; Ningetal., 2015)，證明煙粉虱MED成蟲在不同寄主上傳播病毒的能力均高于煙粉虱MEAM1成蟲。不僅煙粉虱MED成蟲相較于煙粉虱MEAM1在一些雜草和農(nóng)作物上有更強的生物學(xué)優(yōu)勢(Muiz and Nombela, 2001)，而且對化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了極高的抗性(Horowitzetal., 2005)。煙粉虱MED作為目前我國主要的田間種群，且其傳播ToCV的能力很強，因此導(dǎo)致了目前我國ToCV發(fā)生嚴重(胡榮等, 2020)。本實驗創(chuàng)新性地研究了被攜帶ToCV的煙粉虱成蟲侵染后的辣椒發(fā)病癥狀的差異，發(fā)現(xiàn)被攜帶ToCV的煙粉虱MED成蟲侵染的辣椒植株癥狀更加嚴重，這是之前關(guān)于煙粉虱MEAM1和MED成蟲在作物上傳毒所沒有注意到的差異。這能在一定程度上為ToCV在田間辣椒上的早期防控提供了參考。

健康煙粉虱MEAM1和MED成蟲均趨向于取食感染ToCV的辣椒植株，且煙粉虱MED成蟲更偏向于選擇帶毒辣椒植株(圖6)，說明健康的煙粉虱可能被攜帶ToCV的辣椒植株所吸引，當(dāng)煙粉虱通過取食獲得ToCV之后，能夠更好地傳播ToCV。在對煙粉虱傳播的其他雙生病毒的試驗中，研究結(jié)果也與此相似(糾敏等, 2006)。推測可能ToCV侵染改變了辣椒的揮發(fā)物進而吸引了煙粉虱進行取食，這還需要進一步的試驗驗證。另一方面，有研究指出辣椒對煙粉虱具有較強的抗異種作用，辣椒不是煙粉虱的最適寄主，相較之下，煙粉虱更愿意選擇其他更適宜生活的寄主。并且發(fā)現(xiàn)煙粉虱MED比煙粉虱MEAM1對辣椒的耐受性更強(Iidaetal., 2009; Tsueda and Tsuchida, 2011; Jiaoetal., 2014)。本研究所得煙粉虱MED比煙粉虱MEAM1在辣椒植株上獲取和傳播ToCV能力更強，更能接受辣椒寄主的結(jié)果與此結(jié)論達成了一致。

辣椒與番茄同為在經(jīng)濟作物中主要的兩大茄科植物，之前的研究多以番茄為主，本實驗系統(tǒng)研究了煙粉虱在辣椒植株上獲毒和傳毒的特點，及不同煙粉虱傳毒后，感染ToCV的辣椒植株的不同發(fā)病癥狀。ToCV由煙粉虱以半持久方式傳播，而TYLCV由煙粉虱以持久方式傳播，研究發(fā)現(xiàn)煙粉虱傳播不同病毒的特性存在相似性，間接證明了煙粉虱MED較強的傳毒能力。同時有文獻報道，被ToCV與TYLCV復(fù)合侵染的煙粉虱成蟲對ToCV的獲毒和傳毒能力顯著增強(廖錦鈺等, 2021)，說明了煙粉虱在田間傳播ToCV和TYLCV是存在相互促進作用的，但具體機制還有待于進一步研究。這些都說明了在我國蔬菜病毒病的發(fā)生與煙粉虱MED有著密切的聯(lián)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著煙粉虱數(shù)量的增加，煙粉虱的傳毒能力也顯著增強(圖2)，因此，應(yīng)在早期預(yù)防煙粉虱的發(fā)生，從而降低ToCV的傳播。