殷鵬凱, 王明明, 楊自忠, 楊大松, 楊銀河

(大理大學(xué)藥學(xué)院, 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 大理 671000)

病原菌感染是全球公共健康面臨的主要威脅之一，其導(dǎo)致的死亡人數(shù)在逐年上升，2017年全球范圍內(nèi)就有超過(guò)800萬(wàn)人因感染病原體而死亡(Ordonezetal., 2019)。盡管抗生素是治療感染性疾病的有效手段，但新型抗生素尋找速率的降低以及耐藥病原菌的出現(xiàn)，給現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)(Jacksonetal., 2018)。因此，挖掘抗生素新來(lái)源和尋找安全高效的抗菌物質(zhì)不僅是醫(yī)藥研究的前沿領(lǐng)域，也是國(guó)家重大的戰(zhàn)略需求(劉昌孝, 2017)。

昆蟲是地球上數(shù)量最大、種類最多、分布最廣的生物類群(Stork, 2018)，許多特異微生物已與昆蟲形成共生關(guān)系并發(fā)揮重要作用，如黃蜂和甲蟲的共生菌能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)幫助宿主抵御病原菌的侵害，表明昆蟲共生菌是開發(fā)抗菌藥物的重要生物資源(Kaltenpoth, 2009)。 美洲大蠊Periplanetaamericana屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)昆蟲綱(Insecta)蜚蠊目(Blattaria)，作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材蜚蠊的代表性蟲種，目前已以其提取物為主成分制成康復(fù)新液、肝龍膠囊、心脈隆注射液等藥物(高陽(yáng)陽(yáng)等, 2021)；同時(shí)，作為一種世界衛(wèi)生害蟲，它能在污水管道和化糞池等污染環(huán)境中長(zhǎng)期自由生活(Leeetal., 2012)，表明其具有超強(qiáng)的抗病能力，是研究抵御病原菌機(jī)制、探尋抗菌物質(zhì)的良好材料。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊腸道內(nèi)含有豐富的微生物(Tinker and Ottesen, 2016)。安然(2009)對(duì)廈門室內(nèi)的美洲大蠊腸道放線菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)了一些抗菌活性較弱的放線菌；而蔣詩(shī)林等(2021)在廣東室外的美洲大蠊腸道內(nèi)則發(fā)現(xiàn)了一些抗菌活性較強(qiáng)的放線菌，表明美洲大蠊腸道內(nèi)含有抗菌活性的放線菌，其超強(qiáng)抗病能力可能與其腸道內(nèi)微生物菌群有密切關(guān)系，而且不同的生存環(huán)境可能會(huì)對(duì)共生菌的抗菌活性產(chǎn)生影響。

作者以來(lái)源于云南省大理白族自治州的野外美洲大蠊為研究材料，從其腸道中共分離得到41株放線菌，以金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌Escherichiacoli、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、糞腸球菌Enterococcusfaecalis和鼠傷寒沙門氏菌Salmonellatyphimurium共6種人體常見病原細(xì)菌為指示菌，采用牛津杯法對(duì)這些放線菌進(jìn)行體外抗病原細(xì)菌活性篩選，并結(jié)合菌落特征觀察和分子生物學(xué)方法，對(duì)具有廣譜和明顯抗菌活性的菌株進(jìn)行分類鑒定，為后續(xù)發(fā)現(xiàn)新型抗菌物質(zhì)提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與指示菌

供試美洲大蠊成蟲于2020年7月在云南省大理白族自治州彌渡縣室外垃圾堆附近捕捉。采集的樣品經(jīng)由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行核實(shí)(李軍德等, 2013)，確為美洲大蠊。

用作抗菌活性指示菌株的6種病原細(xì)菌中，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌 (ATCC9027)和糞腸球菌(ATCC47077)由昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種儲(chǔ)藏庫(kù)提供，鼠傷寒沙門氏菌(CMCCB50222, BNCC103281) 購(gòu)自北納生物科技有限公司，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)(ATCC43300)購(gòu)自廣東省科學(xué)院微生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

病原細(xì)菌的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，放線菌純化培養(yǎng)基為高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；為抑制真菌和其他細(xì)菌生長(zhǎng)，向高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中添加重鉻酸鉀(西隴科學(xué)股份有限公司)，終濃度為50 μg/mL，此作為放線菌分離培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均用超純水配制，經(jīng)高溫蒸汽滅菌30 min后使用。

主要試劑包括氯霉素和鹽酸萬(wàn)古霉素(上海麥克林生化科技有限公司)、細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、PCR產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒(碩美公司)，PCR預(yù)混液、DNA Ladder和PCR引物購(gòu)自北京六合華大基因科技有限公司。

1.3 腸道共生放線菌的分離、純化及保存

取采集的美洲大蠊成蟲樣品10頭，先置于-20℃的低溫冰箱20 min，使其進(jìn)入昏迷狀態(tài)，然后采用表面消毒法(Bertino-Grimaldietal., 2013)進(jìn)行處理：先用流水沖洗，75%乙醇浸泡3 min，3.5%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，最后用無(wú)菌水洗滌3次。用無(wú)菌濾紙將美洲大蠊樣品外表擦干。剪去其觸角、附肢以及翅。從側(cè)面將美洲大蠊的腹部剖開，取出腸道，放入玻璃研磨器中，加入5 mL無(wú)菌水研磨，靜置后取上清液1 mL稀釋至不同的濃度(10-2～10-6g/mL)，吸取各濃度的稀釋液0.1 mL，均勻涂布于含有50 μg/mL重鉻酸鉀的高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，將培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出可見菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征(呈菌絲狀生長(zhǎng)，大多有發(fā)達(dá)的分支菌絲，以孢子繁殖，菌落顏色不一)、隆起程度、邊緣整齊度等特征挑選出不同的放線菌，接種于高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基平板上。每個(gè)菌落至少純化5次以上以得到單一菌落，以40%甘油為凍存液將菌種于-80℃保存。

1.4 腸道放線菌的抗菌活性測(cè)試

菌株的小規(guī)模發(fā)酵：將已純化菌株從低溫冰箱取出，經(jīng)37℃水浴解凍后，劃線接種到高氏Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板上活化，置28℃培養(yǎng)7 d。 將活化的純化菌株擴(kuò)大培養(yǎng)至10個(gè)高氏合成Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板，于28℃培養(yǎng)14 d，以生成足夠次生代謝產(chǎn)物。

菌株代謝粗提物的制備：將培養(yǎng)基平板的瓊脂切割成等厘米見方的小塊置于500 mL錐形瓶中，以乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=80∶15∶5(v/v)的配比液浸泡3次，每次間隔3, 2和1 d。將每次的浸泡液用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，合并3次濾液旋蒸至干，稱取代謝粗提物約50 mg備用，剩余樣品在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分離放線菌次生代謝粗提物的抗菌活性測(cè)試：方法基本同Ju等(2021)。按1%的接種量把6種指示病原細(xì)菌接入到10 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱以37℃和200 r/min條件培養(yǎng)3～4 h，調(diào)整菌液濃度至1×106CFU/mL。吸取0.1 mL菌液均勻涂布于LB培養(yǎng)基平板上，夾取牛津杯放置在平板上，并向杯中加入100 μL的待測(cè)樣品(濃度為20 mg/mL)，把培養(yǎng)平板置于生化培養(yǎng)箱中，以37℃培養(yǎng)12 h，記錄抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值。設(shè)鹽酸萬(wàn)古霉素、氯霉素(濃度為200 μg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照組藥物，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。抑菌圈平均直徑在10～12 mm判斷為弱抑制作用，12～14 mm為中度抑制作用，大于14 mm為明顯抑制作用。

1.5 抗菌活性菌株的形態(tài)特征觀察

將抗菌活性放線菌接種于高氏Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)7 d，從菌落形態(tài)、孢子顏色、邊緣形狀、是否產(chǎn)生色素等方面觀察培養(yǎng)基上菌株的表觀形態(tài)。

1.6 抗菌活性菌株的16S rRNA基因測(cè)序、同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

按照細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒說(shuō)明書步驟提取放線菌DNA，使用16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物(Dongetal., 2017)27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′和1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3′，對(duì)篩選出的抗菌活性放線菌進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(30 μL): Super Mix 15 μL, 上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL, 模板(1 ng/μL)1 μL, ddH2O 12 μL。擴(kuò)增程序: 96℃ 5 min; 96℃ 20 s, 62℃ 20 s, 72℃ 30 s, 共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物(1 500 bp)進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

將PCR產(chǎn)物委托北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，取相似性最高者作為參照菌株，在MEGA11軟件(Tamuraetal., 2021)中采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Gunathilakaetal., 2020)，Bootstrap抽樣重復(fù)1 000次，所構(gòu)建的發(fā)育樹各節(jié)點(diǎn)數(shù)值代表自展的重復(fù)比例。

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊腸道放線菌的分離純化

選擇適高氏Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板為分離菌株用平板，挑選出不同形態(tài)特征的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)5次以上分離純化，共獲得41株美洲大蠊腸道共生放線菌，記錄編號(hào)為PAS1-PAS41，于-80℃保存。

2.2 抗菌活性放線菌菌株的篩選

為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，采用牛津杯法測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照組藥物對(duì)6種人體病原細(xì)菌的抑菌圈直徑，分析抗菌活性，其中鹽酸萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA的抑菌圈直徑為15.50±0.75 mm，氯霉素對(duì)除MRSA和銅綠假單胞菌之外的其他4種病原細(xì)菌抑菌圈直徑均大于14 mm，表明均具有較強(qiáng)的抗菌活性(表1)。

表1 陽(yáng)性對(duì)照藥物對(duì)6種人體病原細(xì)菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 Inhibition zone diameters (mm) of positive control drugs against six human pathogenic bacteria

抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，41株美洲大蠊腸道分離放線菌中有34株(82.9%)對(duì)至少1種指示細(xì)菌具有抑制作用。對(duì)這些活性菌株的抗菌作用分析發(fā)現(xiàn)，1株(PAS6)對(duì)5種指示細(xì)菌均有抑制作用，有6株(PAS1, PAS3, PAS4, PAS8, PAS30和PAS36)對(duì)4種指示細(xì)菌有抑制作用，有2株(PAS5和PAS17)對(duì)3種指示細(xì)菌有抑制作用(表2)。

表2 美洲大蠊成蟲腸道抗菌活性放線菌的抑菌圈直徑(mm)Table 2 Inhibition zone diameters(mm) of actinomycetes with antibacterial activity from the guts of Periplaneta americana adults

基于前人提出的抑菌圈大小的抑制程度判斷標(biāo)準(zhǔn)(Bibietal., 2011)，發(fā)現(xiàn)3株(PAS4, PAS6和PAS30)對(duì)大腸桿菌中度抑制，4株(PAS3, PAS5, PAS30和PAS36)對(duì)金黃色葡萄球菌明顯抑制，5株(PAS8, PAS21, PAS28, PAS35和PAS37)對(duì)MRSA明顯抑制，1株(PAS36)對(duì)糞腸球菌明顯抑制，1株(PAS28)對(duì)銅綠假單胞菌明顯抑制，但所有放線菌對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制均較弱。部分放線菌的抑制活性如圖1所示。結(jié)果表明美洲大蠊腸道內(nèi)存在廣譜(抑制3種以上病原細(xì)菌)和抗菌活性明顯(抑菌圈平均直徑≥14 mm)的放線菌，其中具廣譜抗菌活性的共有7株，為PAS1, PAS3, PAS4, PAS6, PAS8, PAS30, PAS36；具明顯抗菌活性的有9株，為PAS3, PAS5, PAS8, PAS21, PAS28, PAS30, PAS35, PAS36和PAS37。

圖1 美洲大蠊成蟲部分腸道放線菌代謝粗提物對(duì)6種人體病原細(xì)菌的抑制活性Fig. 1 Inhibitory activities of crude metabolic extracts from some gut actinomycetes of Periplaneta americanaadults against six human pathogenic bacteria照片A-F分別顯示菌株P(guān)AS30、PAS5、PAS8、PAS36、PAS6和PAS28的代謝粗提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、MRSA、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌和銅綠假單胞的抑制作用；其中照片C中使用鹽酸萬(wàn)古霉素作為陽(yáng)性對(duì)照藥，其他照片中使用氯霉素作為陽(yáng)性對(duì)照藥。Photos A-F display the inhibitory effects of crude metabolic extracts of strains PAS30, PAS5, PAS8, PAS36, PA6 and PAS28 on Escherichia coli, Staphylococcus aureus, MRSA, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa, respectively. In photo C, vancomycin hydrochloride was used as the positive control drug, while in other photos, chloramphenicol was used as the positive control drug.

2.3 抗菌活性放線菌菌株的形態(tài)特征

對(duì)上述具廣譜抗菌活性或明顯抗菌活性的12株放線菌(PAS1, PAS3, PAS4, PAS5, PAS6, PAS8, PAS21, PAS28, PAS30, PAS35, PAS36和PAS37)的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)差異較大(圖2)。

圖2 美洲大蠊成蟲腸道中具有抗菌活性的12株放線菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)Fig. 2 Growth forms of 12 actinomycetes strains with antibacterial activity from the guts of Periplaneta americana adults on media菌株在高氏Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，28℃生長(zhǎng)7 d后拍攝。Strains were cultured on Gao I agar medium and photographed after growing at 28℃ for 7 d.

2.4 抗菌活性放線菌菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育

PAS1等12株活性菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增到的16S rRNA基因長(zhǎng)約1 500 bp，利用MEGA11軟件，經(jīng)BLAST比對(duì)序列同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步鑒定這12株放線菌均為鏈霉菌屬Streptomycesspp.。其中菌株P(guān)AS28, PAS36, PAS4, PAS5和PAS8之間的親緣關(guān)系較近，PAS35和PAS1間的親緣關(guān)系較近，PAS6和PAS3間的親緣關(guān)系較近，PAS30與其他菌株的親緣關(guān)系遠(yuǎn)，表現(xiàn)出美洲大蠊腸道鏈霉菌的多樣性(圖3)。將12株鏈霉菌的16S rRNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為OL677377-OL677381, OM421793, OM421794, OM421797和ON146335-ON146338。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于16S rRNA基因序列的美洲大蠊成蟲腸道中具有抗菌活性的12株放線菌和其他菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 3 Phylogenetic tree of 12 actinomycetes strains with antibacterial activity from the guts of Periplaneta americana adults and other species based on the 16S rRNA gene sequences constructed by neighbor-joining method (1 000 replicates)標(biāo)尺示遺傳距離。Scale bar indicates the genetic distance.

3 討論

昆蟲腸道共生菌是一類特境微生物，在與宿主長(zhǎng)期共生和協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，可產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)保護(hù)宿主防御外來(lái)病原菌感染(Arangoetal., 2016)。美洲大蠊是一類常見的病媒生物，長(zhǎng)期攜帶病原菌卻不受影響，其強(qiáng)大的抗病能力可能與腸道微生物相關(guān)。但目前關(guān)于美洲大蠊體內(nèi)微生物的抗細(xì)菌活性研究尚不豐富，蔣詩(shī)林等(2021)測(cè)試了美洲大蠊腸道放線菌對(duì)金黃色葡萄球菌與MRSA兩種病原細(xì)菌的拮抗作用，但對(duì)于其他類型病原細(xì)菌的抑制作用未見報(bào)道。

本研究從云南省大理州捕捉的野外美洲大蠊腸道內(nèi)分離到41株放線菌，以3種革蘭氏陽(yáng)性和3種革蘭氏陰性病原菌為指示菌株，采用牛津杯法定量測(cè)定了這些放線菌的潛在抗菌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離放線菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果較好，其中以抗MRSA的菌株數(shù)量最多，有20株(48.7%)。據(jù)報(bào)道，在廣東室外的美洲大蠊腸道放線菌中也曾發(fā)現(xiàn)一些抗MRSA的放線菌(蔣詩(shī)林等, 2021)，但這些放線菌的形態(tài)及種屬分類與本實(shí)驗(yàn)分離到的差異較大，說(shuō)明宿主的生存環(huán)境可影響其腸道內(nèi)共生菌的類群組成。此外，本研究分離的多數(shù)放線菌對(duì)革蘭氏陰性病原菌只有微弱的抗菌活性，但也有一部分菌株對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性病原細(xì)菌具有中度或明顯的抑制作用，如菌株P(guān)AS4, PAS6, PAS24, PAS28和PAS30(表2)。結(jié)果揭示了在惡劣環(huán)境下生存的美洲大蠊，其腸道放線菌的抗細(xì)菌活性豐富多樣，推測(cè)這些菌株產(chǎn)生的抗菌活性天然物質(zhì)有助于美洲大蠊抵御外來(lái)病原細(xì)菌的感染。

對(duì)具有廣譜和明顯抗菌活性的放線菌進(jìn)行分類鑒定，發(fā)現(xiàn)這些放線菌均歸屬于鏈霉菌屬；鏈霉菌屬是至今放線菌中種類最多、數(shù)量最大的一個(gè)屬，是一類具有重要應(yīng)用價(jià)值的微生物(Tiwari and Gupta, 2013)。例如，與PAS36親緣關(guān)系較近的三色鏈霉菌Streptomycestricolor，有報(bào)道稱其具有較強(qiáng)的抗真菌活性(Rehanetal., 2021)；加利利鏈霉菌Streptomycesgalilaeus能夠產(chǎn)生阿克拉霉素類的抗腫瘤抗生素(Grocholskietal., 2019)；在紫紅鏈霉菌Streptomyyceviolaceoruber的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了具有抗菌、抗腫瘤等活性的天然化合物(Wenzeletal., 2000; Maetal., 2017)；變鉛青鏈霉菌Streptomyceslividans是一類用于生物活性研究的模式菌株，其基因序列包含了25個(gè)功能基因簇，已從其次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了放線菌素和十一烷基靈菌紅素等多種高效抗生素(Ahmedetal., 2020)。上述鏈霉菌表現(xiàn)出極大的研發(fā)潛力，后續(xù)課題組也將采用生物活性追蹤和現(xiàn)代分離純化技術(shù)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)分離鑒定的抗菌活性菌株進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物及其作用機(jī)制研究。

總之，本研究以惡劣環(huán)境下生存的美洲大蠊為研究材料，以6種人體病原細(xì)菌為指示菌株，篩選出34株具有不同程度抗菌活性的腸道共生放線菌，為后續(xù)挖掘新型高效抗生素提供了重要的微生物資源。