胡雅輝，孫書娥，高陽

（1.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南 長沙 410125；2.中南大學(xué) 隆平分院，湖南 長沙 410125）

煙粉虱常常對黃瓜、番茄、茄子、蘿卜、紅菜薹、甘藍(lán)等蔬菜造成危害，同時(shí)也為害棉花。依據(jù)煙粉虱的寄主范圍、為害習(xí)性、傳毒能力的差異等，煙粉虱被分為多種生物型，其中B型和Q型為常見生物型[1-3]，是近年來從國外傳入并在中國廣大地區(qū)為害的入侵種群。對煙粉虱生物型的鑒定方法有4種[4]，即銀葉反應(yīng)、酯酶電泳分析、提取煙粉虱DNA進(jìn)行隨機(jī)多態(tài)性DNA擴(kuò)增、進(jìn)行區(qū)段基因的測序等。筆者于2009—2010年對長沙市煙粉虱的種群動(dòng)態(tài)進(jìn)行了調(diào)查，并通過線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因COI測序，對長沙市煙粉虱的生物型進(jìn)行了鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 煙粉虱種群調(diào)查

于2009年4—11月和2010年4—10月，每半個(gè)月對長沙市東郊的番茄、黃瓜、棉花、甘藍(lán)和紅菜薹等作物葉片上的煙粉虱進(jìn)行1次調(diào)查，每次調(diào)查3～4種，每種寄主植物隨機(jī)調(diào)查10株，每株隨機(jī)調(diào)查2片葉，記錄寄主植物葉片上的煙粉虱成蟲數(shù)量。

1.2 煙粉虱mtDNACOⅠ基因序列測定

從長沙市芙蓉區(qū)湖南省植物保護(hù)研究所的棉花和湖南省蔬菜研究所的大棚黃瓜分別采集煙粉虱成蟲100頭，研磨后，加入200 μL DNA提取液（長沙維爾生物技術(shù)公司產(chǎn)品），研磨成勻漿，8 000 r/min離心3 min，收集上清液，加入1倍體積的冷卻無水乙醇，顛倒6次，靜置3 min，吸棄溶液，加入75%乙醇洗1次，吸棄溶液，加入100 μL無菌雙蒸水，－4 ℃保存，備用。

通用引物對 C1-J-2195[5-6]（5′-TTBATTTTT TGGTCATCCAGAAGT-3′）和 R2819[6]（5′-CTGA ATATCGAGGCATTCC-3′） 用于擴(kuò)增Q型煙粉虱的COI基因片段；引物對 C1-J-2195和 L2-N-3014[5]（5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA -3'）用于擴(kuò)增B型煙粉虱的COI基因片段，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系為：10×Buffer 2 μL，25 mmol/L Mg2+1 μL，0.25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，5 U/μL的Taq酶0.2 μL，2 μL模板，雙蒸水10.3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物直接送長沙維爾生物技術(shù)公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對主要寄主植物葉片上煙粉虱成蟲數(shù)量平均值作煙粉虱種群季節(jié)動(dòng)態(tài)圖。將從煙粉虱中擴(kuò)增的基因片段測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)頁上進(jìn)行Blast搜索，找出數(shù)據(jù)庫中相似度高的煙粉虱的COI基因序列。

2 結(jié) 果

2.1 長沙市煙粉虱種群動(dòng)態(tài)

圖1 長沙煙粉虱種群發(fā)生動(dòng)態(tài)Fig. 1 Population dynamic of Bemisia tabaci from host plant leaves in Changsha

2009年和2010年，長沙市煙粉虱均有2個(gè)發(fā)生高峰，第1個(gè)高峰發(fā)生在5—6月，第2個(gè)高峰發(fā)生在9月（圖1），2年種群發(fā)生動(dòng)態(tài)基本一致，2010年煙粉虱種群發(fā)生比2009年略早。2010年煙粉虱種群密度為每葉2～30頭，比2009年（每葉1～23頭）高，2010年5月下旬和6月上旬煙粉虱成蟲數(shù)量與2009年相比，差異明顯，其余月份差異不大。

2.2 長沙市煙粉虱的生物型

將第1對引物C1-J-2195和R2819對煙粉虱DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測，成功擴(kuò)增出1段600 bp左右的基因片段（圖2），而將第2對引物C1-J-2195和L2-N-3014對煙粉虱DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則無擴(kuò)增條帶。擴(kuò)增的目的基因測序結(jié)果與NCBI上杭州煙粉虱COI（GU384316.1）、呼和浩特?zé)煼凼瑿OI（GU384318.1）、武漢煙粉虱COI（GU384314.1）序列同源性為 100%，與美國 Frolida煙粉虱COI（FJ188570.1）序列僅相差1個(gè)堿基（圖3），而杭州、呼和浩特、武漢和美國Frolida煙粉虱種群均為Q型，因此推斷長沙煙粉虱種群生物型為Q型。

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products

圖 3 長沙煙粉虱與其他地區(qū)Q型煙粉虱COⅠ基因部分片段序列對比Fig.3 Contrast of COI gene sequences between from B. tabaci in Changsha and Q biotype B. tabaci in other region

3 討 論

長沙市露地蔬菜和棉花上煙粉虱種群發(fā)生高峰在春、秋兩季，主要是因?yàn)闇囟冗m宜煙粉虱種群的發(fā)生和繁殖。長沙冬季氣溫在5 ℃以下、夏季氣溫在35 ℃以上，都將直接導(dǎo)致煙粉虱發(fā)育停滯[7]?；诖?，5月初如發(fā)現(xiàn)煙粉虱，需及時(shí)防治，一旦錯(cuò)過時(shí)機(jī)，煙粉虱很有可能在短時(shí)間內(nèi)暴發(fā)為害。值得注意的是，溫室大棚內(nèi)蔬菜上煙粉虱的種群密度往往高于露地蔬菜，尤其到10、11月，露地寄主植物上煙粉虱種群密度下降時(shí)，溫室大棚內(nèi)黃瓜上的煙粉虱成蟲種群密度還可維持在每葉 500頭以上。

由于用B型煙粉虱COI基因的特異PCR引物無法擴(kuò)增出目的基因，因此，斷定從湖南省植物保護(hù)研究所和湖南省蔬菜研究所采集的煙粉虱標(biāo)本里沒有B型煙粉虱。而第1對引物擴(kuò)增出來的目的基因序列與其他Q型煙粉虱的COI基因序列同源性超過99%，因此可以判定長沙市煙粉虱種群生物型為Q型。2006年以前，湖南省內(nèi)煙粉虱生物型為B型和非B型[4]，并沒有發(fā)現(xiàn)Q型。但是，隨著時(shí)間的推移，長沙市煙粉虱的生物型已經(jīng)發(fā)生了變化，可見，在長沙Q型煙粉虱較B型煙粉虱更具競爭力。有結(jié)果顯示，Q型煙粉虱在其他省份也有逐步取代B型煙粉虱的趨勢[8]。

關(guān)于煙粉虱不同生物型的競爭機(jī)制，有過一些研究[9]，比較B型和Q型煙粉虱的生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，Q型煙粉虱雌蟲產(chǎn)卵量、化蛹數(shù)、成蟲羽化率等明顯比B型煙粉虱高；Q型煙粉虱在17 ℃和33 ℃時(shí)平均世代歷期（分別為46、17 d）比B型煙粉虱的（分別為49、18 d）要短[10]。在番茄上，Q型煙粉虱比B型煙粉虱均具有更強(qiáng)的危害性[11]。還有一些研究[12]表明，在沒有農(nóng)藥選擇壓力下，Q型煙粉虱對新類煙堿農(nóng)藥的抗性比較穩(wěn)定，而B型煙粉虱對新類煙堿農(nóng)藥的抗性則會(huì)急劇下降[12]。根據(jù)Q型煙粉虱的這些生物學(xué)特性，應(yīng)當(dāng)較多考慮非化學(xué)的防治措施，比如懸掛黃板等，以免產(chǎn)生抗藥性；不應(yīng)當(dāng)依賴化學(xué)農(nóng)藥，以免再生猖獗。

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