郭 帥，熊 琪，陶 虎，楊 娟，韓世昌

(1.湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，武漢 430000)

【研究意義】我國是世界上牛品種最多的國家，共有53個地方品種和8個培育品種[1]。近年來，由于外來品種的引進(jìn)，我國原有的地方品種資源在逐漸減少，對牛的品種篩選與繁育變得至關(guān)重要。牛的親子鑒定是牛品種篩選的重要環(huán)節(jié)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微衛(wèi)星標(biāo)記就被認(rèn)為是表征品種遺傳多樣性的首選標(biāo)記[2]。Chaudhari等[3]利用25對熒光微衛(wèi)星標(biāo)記對Kenkatha和Gaolao這2個品種的牛進(jìn)行了分子鑒定，證明這2個品種間幾乎沒有遺傳分化。Acosta[4]利用30對微衛(wèi)星標(biāo)記評估了5個古巴牛品種的遺傳多樣性和關(guān)系，結(jié)果顯示當(dāng)?shù)嘏Ｈ褐斜３至舜罅康倪z傳變異。Novoa和Usaquén 等[5]檢測了來自哥倫比亞的178只婆羅門牛的11個微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性，結(jié)果顯示婆羅門牛的高度雜合性，揭示了品種起源。李芳玉[6]對云嶺牛線粒體DNA全基因組遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，云嶺牛是以云南地方黃牛為母本進(jìn)行培育的肉牛品種，包括普通牛和瘤牛2個母系起源，且以瘤牛起源為主。李榮嶺等[7]采用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增STR，通過全自動基因分析儀檢測基因型，這種高通量檢測方法準(zhǔn)確、可靠，但檢測費用昂貴。Ciampolinie 等[8]將1個由54頭荷斯坦牛與4頭意大利肉牛組成的測試組，用微衛(wèi)星DNA測定，結(jié)果顯示4頭‘意大利?！g的遺傳相似度較高，54頭‘荷斯坦?！g的遺傳相似度低。吳偉等[9]利用4種微衛(wèi)星標(biāo)記對5個中外牛品種/群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)西門塔爾牛自成一類，延邊牛、韓牛為一類，南陽牛和雜種牛為一類。張自富等[10]利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究了14個中外黃牛品種的遺傳多樣性，篩選出ILSTS005和ETH10 2個微衛(wèi)星位點?！颈狙芯壳腥朦c】親子鑒定是通過分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)等技術(shù)手段，分析親代和子代的遺傳特性，從而判斷是否具有親緣關(guān)系[11-12]。親子鑒定的遺傳基礎(chǔ)是孟德爾的遺傳定律，包括基因分離和自由組合規(guī)律。在家畜的親子鑒定中，通常使用排除法和似然法。排除法是利用各個位點的等位基因頻率把不是親生父親的候選父親排除的概率。似然法是通過建立候選父親和子代的似然函數(shù)，在一定置信水平下為子代找到最似親本[13]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究中共有3頭牛，通過Sry雄性特異性基因檢測來證明這3頭牛的性別，再根據(jù)終止法測序，比對mtDNA的D-loop區(qū)的位點突變情況，最后根據(jù)STR位點基因型來確定3頭牛的親子代關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品

爭議公牛C和嫌疑母牛A、B的外周血液樣品。

1.2 試劑

基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖購自上海貝晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 利用mtDNA D-loop區(qū)遺傳標(biāo)記進(jìn)行牛母系血緣鑒定

采用Tris-飽和酚提取牛外周血液DNA。根據(jù)牛mtDNA的D-loop區(qū)設(shè)計引物(表1)，以牛外周血基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳回收純化后，以雙脫氧鏈終止法進(jìn)行測序。Mutation Surveyor軟件(v5.0.2)分析測序結(jié)果后，判斷親權(quán)關(guān)系。以牛 Sry 基因作為雄性特異性基因設(shè)計引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于性別鑒定。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存，PCR擴(kuò)增體系如表2所示。

1.4 利用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記進(jìn)行牛單親親權(quán)鑒定

采用Tris-飽和酚法提取牛尾靜脈血DNA。選定的位點除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122這8個作牛的親權(quán)鑒定必須包括在內(nèi)的“國際標(biāo)記組”外，參考賀建寧[14]的研究結(jié)果，增加了有豐富等位基因、高多態(tài)性特點的INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT275個STR位點。合成13個STR位點，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并于AB 3130xl 遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離、收集熒光信號、自動分析PCR 產(chǎn)物的長度，運用GeneMarker軟件(v2.2.0)自動分析各等位基因的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體D-loop區(qū)檢測結(jié)果

牛A、牛B和牛C的線粒體D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，擴(kuò)增產(chǎn)物約1000 bp，條帶單一，無非特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。Sry雄性特異性基因檢測結(jié)果(圖1)顯示，只有牛C的Sry雄性特異性基因可以形成擴(kuò)增條帶，表明牛A和牛B為雌性個體，與送檢樣品標(biāo)注相符。

mtDNA的D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，用雙脫氧鏈終止法測序，并進(jìn)行序列比對。與參照序列(AY337535)相比，牛B、牛C的mtDNA D-loop區(qū)雙脫氧鏈終止法測序結(jié)果共檢測到47個突變，牛A共檢測到46個突變(表3)，其中牛B mtDNA D-loop區(qū)的47個位點與牛C突變方式完全一致，而牛A的291A>G這個位點與參照序列(AY337535)相同，不同于牛C。以上mtDNA D-loop區(qū)測序分析結(jié)果表明，牛B與牛C是來源于同一母系的個體。

表1 牛mtDNA的D-loop區(qū)鑒定使用的引物

表2 PCR擴(kuò)增體系

圖1 牛A、牛 B和牛C的mtDNA D-loop區(qū)及Sry基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of mtDNA D-loop region and Sry gene PCR products of cow A,cow B and cow C

表3 被鑒定對象mtDNA D-loop區(qū)測序結(jié)果與參照序列(AY337535)的比對情況

表4 13個位點等位基因的基因型

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記檢測結(jié)果

13個STR位點的PCR產(chǎn)物均有條帶(圖2)。3件送檢樣本的BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、INRA037、INRA032、CSSM66、SPS115、TGLA53、TGLA227、TGLA122、HAUT27基因座中均檢出基因型(即等位基因片段后者大于前者)。利用AB 3130xl 遺傳分析儀對13個位點的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離。牛B和牛C的BM1824位點符合孟德爾遺傳規(guī)律(圖3)，而牛A與牛C在這個位點不符合(因為牛B基因型片段小于等于牛C，牛A基因型片段比牛C大)。牛B和牛C在13個STR位點的基因型全部符合孟德爾遺傳規(guī)律(表4)，牛A和牛C在1號染色體的BM1824位點、2號染色體的BM2113位點、3號染色體的INRA023位點、10號染色體的INRA037位點、11號染色體的INRA032位點、16號染色體的TGLA53位點和26號染色體的HAUT27位點不符合孟德爾遺傳規(guī)律。

圖2 牛A、牛 B和牛C的1～13個微衛(wèi)星標(biāo)記PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 1-13 microsatellite markers in cow A,cow B and cow C

3 討 論

mtDNA(mitochondrial DNA)又稱線粒體DNA，是重要的遺傳標(biāo)記，是細(xì)胞中唯一的核外基因組DNA[15]。線粒體以母系遺傳方式遺傳，不受染色體重組的影響，可彌補微衛(wèi)星因發(fā)生重組影響基因頻率和基因型頻率，最終導(dǎo)致鑒定率降低的不足。同時，線粒體拷貝數(shù)多，每個細(xì)胞含有10～1000個線粒體，多數(shù)線粒體內(nèi)含有多拷貝的mtDNA，因此對mtDNA的檢測比核基因組DNA(nDNA)的靈敏性高，具有更高的檢出率[16]。但是線粒體DNA存在結(jié)構(gòu)多樣性，且單獨使用線粒體DNA測序技術(shù)作為分子標(biāo)記存在一定的缺陷[17]。

根據(jù)本次送檢樣品的檢測結(jié)果，基本可以排除牛A與牛C具有親子關(guān)系的可能性。鑒于牛B和牛C的 mtDNA D-loop區(qū)47個位點的突變方式完全相同，該方法檢測結(jié)果只能說明牛B與牛C有母系血緣關(guān)系，其親子關(guān)系還必須通過常染色體STR來確定。

STR本研究共選定為位點除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122這8 個作牛的親權(quán)鑒定必須包括在內(nèi)的“國際標(biāo)記組”外，還增加了INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT27這5個STR位點。其中INRA037位點等位基因數(shù)為14，多肽信息含量為0.671；INRA032等位基因為8，多肽信息含量為0.537；CSSM66等位基因數(shù)為11，多肽信息含量為0.734；TGLA53等位基因數(shù)為18，多肽信息含量為0.881；HAUT27等位基因數(shù)為11，多肽信息含量為0.737。王均輝等[18]研究發(fā)現(xiàn)，秦川牛的平均多肽信息含量為0.7686，平均雜合度為0.7959。王敏強等[19]研究發(fā)現(xiàn)，魯西黃牛平均多肽信息含量為0.797，平均雜合度為0.820；渤海黑牛的平均多肽信息含量為0.798，平均雜合度為0.821；秦川牛的平均多肽信息含量為0.795，平均雜合度為0.819。遺傳連鎖分析顯示，多肽信息含量大于0.7的微衛(wèi)星位點為最理想的選擇標(biāo)記，所以本實驗中13個STR可以作為進(jìn)一步連鎖分析的候選遺傳標(biāo)記和個體鑒定。母牛B和公牛C在13個STR基因座均符合孟德爾遺傳規(guī)律[12]，相對親權(quán)概率(RCP)為99.99%，母牛B是公牛C的生物學(xué)母本的幾率大于99.99%；母牛A和公牛C之間有7個STR基因座不符合孟德爾遺傳規(guī)律，因此，排除母牛A與公牛C具有親子關(guān)系的可能性。

圖3 1號染色體BM1824位點毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig.3 Results of capillary electrophoresis at bm1824 site on chromosome 1

吳繼法等[20]在研究中選用了36個STR位點，采用熒光多重PCR，對涼山半細(xì)毛羊進(jìn)行親子鑒定，得到的累積非父概率為99.999 999%。賈名威等[21]研究顯示，采用6個STR位點，得到奶牛的累積非父排除率98.827%，肉牛累積非父排除率99.578。其結(jié)果低于國內(nèi)外親子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。本研究所檢測的13個基因座既可以達(dá)到國內(nèi)外親子鑒定的精確度要求，又做到實驗操作簡便，成本較低，更加適應(yīng)生產(chǎn)實際。這13個基因座具有高遺傳多態(tài)性，在同一模板濃度下，各位點PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過遺傳分析儀分析，得到的檢測峰信號較強且峰型好。本研究采用的STR復(fù)合擴(kuò)增[22]、熒光標(biāo)記、毛細(xì)管電泳檢測[23]、GeneMarker軟件[24]分析的方法優(yōu)點較多，比如高分辨率、高準(zhǔn)確度、速度快等，表明這種方法在動物遺傳研究中有很強的實用性[25]。

4 結(jié) 論

根據(jù)mtDNA D-loop基因分型結(jié)果，確定牛B與牛C具有母系血緣關(guān)系，排除牛A與牛C存在母系血緣關(guān)系。根據(jù)DNA遺傳標(biāo)記分型結(jié)果，確定牛B是牛C的生物學(xué)母親；排除牛A是牛C的生物學(xué)母親，說明該方法用于牛親子鑒定具有可靠性。