陳自宏,陳 凱,徐 玲,柳 青,張?jiān)茓?石龍敏,彭興艷,陳家富

(1.保山學(xué)院高黎貢山生物資源研究所,云南 保山 678000; 2.云南省高校滇西昆蟲資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 保山 678000)

【研究意義】農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)是一種以農(nóng)作物為中心、受人為干擾強(qiáng)烈的半自然生態(tài)系統(tǒng)，由于受人類有目的的選擇和控制，其植被類型和群落結(jié)構(gòu)相對較單一[1]。研究農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌的自然發(fā)生狀況，對農(nóng)業(yè)害蟲的綜合管理和持續(xù)防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的提高和全球經(jīng)濟(jì)變化加速，環(huán)境日益多變，害蟲危害劇增，化學(xué)農(nóng)藥的大量施用造成環(huán)境污染不斷加重，給農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性發(fā)展帶來了巨大壓力[2-3]。蟲生真菌是自然界中控制害蟲種群消長的重要因子，對害蟲的防治具有安全有效、容易大量生產(chǎn)、容易流行等優(yōu)點(diǎn)，利用蟲生真菌防治農(nóng)業(yè)害蟲已成為新趨勢[4-5]。自然界中蟲生真菌資源豐富，分布廣泛。近年來，關(guān)于蟲生真菌物種多樣性的研究非常多，但多數(shù)集中在森林、自然保護(hù)區(qū)等植被種類較豐富的生態(tài)系統(tǒng)中[6-8]，對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌資源的關(guān)注較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】保山是滇西農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)區(qū)，屬低緯高原季風(fēng)氣候，海拔差異大、地勢地形復(fù)雜、地貌特征多樣，適合耕種的土地類型多樣，作物種類豐富。保山潞江壩是典型的亞熱帶干熱河谷，年均氣溫21.3 ℃、積溫7694 ℃，是云南享有盛譽(yù)的熱作種植區(qū)[9]。保山騰沖市是中國著名的內(nèi)陸型火山地?zé)釁^(qū)，年均氣溫14.7 ℃，積溫4613 ℃，其火山灰土肥力優(yōu)異，在農(nóng)業(yè)用地中占據(jù)重要地位[10-11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在保山市2個區(qū)域的4種典型的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中開展蟲生真菌物種多樣性及其發(fā)生動態(tài)研究，為挖掘該地區(qū)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)蟲生真菌的應(yīng)用潛力和持續(xù)控制農(nóng)業(yè)害蟲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年在云南省保山市潞江壩熱作種植區(qū)和騰沖火山灰區(qū)選取4種農(nóng)田開展蟲生真菌的調(diào)查(表1)。多年生作物農(nóng)田：潞江壩咖啡田、騰沖市茶園，均無混栽或間作植物；1年生作物農(nóng)田：潞江壩玉米田，玉米(4—9月)與四季豆(9月至下一年3月)輪作；騰沖的煙田，烤煙(5—10月)與油菜(上一年10月至4月)輪作。

每種作物農(nóng)田選取6個樣方(兩樣方間隔5 km以上)。每個樣方總面積為400 m2(20 m×20 m)，取4個對角小樣方和1個中心小樣方(每個小樣方為2 m×2 m)。1—12月，每月中旬在每種農(nóng)田樣方中采集植株根際土壤樣品30個，各樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后于4 ℃下暫時保存，并在3 d內(nèi)處理。

1.2 蟲生真菌菌株分離純化與鑒定

參考Keyser等[12]的方法，用黃粉蟲誘導(dǎo)法從各土壤樣品中分離蟲生真菌菌株。取200 g土壤樣品轉(zhuǎn)移至無菌罐頭培養(yǎng)瓶中，每瓶放入10只黃粉蟲幼蟲，被感染后，挑取蟲體表面分生孢子粉或取蟲體內(nèi)部組織，于PPDA培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基+1%蛋白胨)上25 ℃培養(yǎng)，獲得的純化菌株于4 ℃保存。

根據(jù)菌落形態(tài)、營養(yǎng)體、孢子等形態(tài)特征對分離純化到的菌株進(jìn)行初步分類鑒定，再結(jié)合5基因序列(nrSSU,nrLSU,EF-1α,RPB1和RPB2)的系統(tǒng)發(fā)育分析來確定蟲生真菌的分類地位[13-14]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

多基因系統(tǒng)發(fā)育分析：根據(jù)近年來的研究報道[13,15-16]，在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索并下載已登錄的蟲生真菌5基因序列。每個物種中選取1～2個代表性菌株(共選取了30株菌)顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹上，將其5基因序列上傳到GenBank并獲得序列號。對每個基因數(shù)據(jù)矩陣序列進(jìn)行比對，片段的缺失用“N”表示，將5基因數(shù)據(jù)矩陣序列進(jìn)行拼接合并，以Clonostachysrosea和Hydropisphaerapeziza作為外類群，用RAxML軟件進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析。

物種多樣性分析：不同類型作物農(nóng)田中蟲生真菌的數(shù)量特征采用α多樣性進(jìn)行分析，物種豐富度指數(shù)、物種多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)用R2.12.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[17]。優(yōu)勢種：菌株數(shù)占比>9%，菌株數(shù)占比(%)=物種菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%。

表1 采集地點(diǎn)的自然概況

2 結(jié)果與分析

2.1 保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)蟲生真菌物種多樣性

從保山4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的土壤中誘導(dǎo)分離純化蟲生真菌，結(jié)合形態(tài)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，共確定了3340個菌株屬于蟲生真菌。參與多基因系統(tǒng)發(fā)育分析的組合序列共93條，在系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)中被分為10個類群(clade 1～10)，外類群物種(ClonostachysroseaGJS90-227,HydropisphaerapezizaGJS92-101)序列明顯形成了1個獨(dú)立的分支(clade 10)。保山農(nóng)田蟲生真菌分屬于3科(麥角菌科、蟲草科、線蟲草科)6屬20種，麥角菌科包含1個屬：綠僵菌屬(clade 9)8種(Metarhiziumanisopliae,M.baoshanense,M.brunneum,M.gaoligongensis,M.indigotica,M.pemphigi,M.pinghaense和M.rileyi)；蟲草科包含3個屬：白僵菌屬(clade 4)4種(Beauveriaasiatica,B.bassiana,B.brongniartii和B.pseudobassiana)，蟲草屬(clade 5)5種(Cordycepscateniannulata,C.cateniobliqua,C.fumosorosea,C.militaris和C.tenuipes)，刺束梗孢屬(clade 6)1種(Akanthomycessp.)；線蟲草科包含2個屬：線蟲草屬(clade 7)1種(Ophiocordycepsmyrmicarum)，紫孢菌屬(clade 8)1種(Purpureocilliumlilacinum)(圖1，表1)。

2.2 保山4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)蟲生真菌的分布

保山4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌的物種和菌株數(shù)都比較豐富(表2)。從物種來看，騰沖火山區(qū)的茶園和潞江壩熱作區(qū)的咖啡田蟲生真菌物種豐富度(分別為18和17種)和多樣性指數(shù)較高(分別為2.150和2.161)，潞江壩玉米田和騰沖煙田的物種豐富度(分別為13和12種)和香農(nóng)多樣性指數(shù)(分別為1.697和1.974)相對較低。從菌株數(shù)來看，茶園蟲生真菌的菌株數(shù)量最多(1087株)，其次是咖啡田(858株)；玉米田的菌株數(shù)量較少(774株)，煙田的菌株數(shù)最少(621株)。

表2 保山4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌的物種及其數(shù)量

保山農(nóng)田蟲生真菌的基因序列進(jìn)行字體加粗顯示Those from Baoshan field ecosystemwere showed in bold type圖1 保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)蟲生真菌多基因(nrSSU,nrLSU,EF-1α,RPB1和RPB2)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of entomogenous fungi in Baoshan field ecosystem based on multigene (nrSSU,nrLSU,EF-1α,RPB1 and RPB2) dataset

表3 保山4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)種土壤蟲生真菌優(yōu)勢屬和種的菌株數(shù)量占比

獲得的20種蟲生真菌中，金龜子綠僵菌(茶園)和斜鏈蟲草(咖啡田)只在1種農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)；高黎貢綠僵菌、環(huán)鏈蟲草、高雄山蟲草和蛹蟲草在咖啡田與茶園中發(fā)現(xiàn)，靛青綠僵菌和萊氏綠僵菌在玉米田和茶園中發(fā)現(xiàn)，紅蟻線蟲草在咖啡田和煙田中發(fā)現(xiàn)；其余11個物種在4種農(nóng)田中均有分布(表2)。

保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤中蟲生真菌優(yōu)勢種屬現(xiàn)象明顯(表2～3)，玉米田和煙田蟲生真菌的優(yōu)勢度較高(分別為0.252和0.191)，咖啡田和茶園蟲生真菌的優(yōu)勢度較低(分別為0.161和0.175)。綠僵菌屬、白僵菌屬和蟲草屬在4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中都為優(yōu)勢屬，這3個屬共有17個物種，菌株數(shù)(2809株)占農(nóng)田土壤總菌株數(shù)的84.10%。尤其是第一優(yōu)勢屬綠僵菌屬，其物種數(shù)(8種)最多，菌株數(shù)占農(nóng)田土壤總菌株數(shù)的64.76%；第二優(yōu)勢屬為白僵菌屬(4種，菌株數(shù)占13.32%)和蟲草屬(5種，菌株數(shù)占6.02%)。而紫孢菌屬和刺束梗孢屬雖然菌株數(shù)也較多(分別占總數(shù)的9.94%和5.66%)，但分別都只發(fā)現(xiàn)1個物種；線蟲草屬中也只有1個種，菌株數(shù)最少(10株)。

保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)20種蟲生真菌中，菌株數(shù)量≥300株的優(yōu)勢物種有4個：M.brunneum、M.baoshanense、Purpureocilliumlilacinum、Beauveriabassiana。菌株數(shù)量≤10的稀有物種有4個：M.rileyi、M.anisopliae、C.cateniobliqua和O.myrmicarum。從表3可見，M.brunneum為第一優(yōu)勢物種(總占比為34.25%)，在不同類型農(nóng)田土壤中都最占優(yōu)勢(28.79%～39.92%)，玉米田檢出的菌株數(shù)最多(占39.92%)，咖啡田菌株數(shù)最少(占28.79%)。第二優(yōu)勢種為M.baoshanense，在保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)總占比為19.91%，在各種農(nóng)田土壤中的數(shù)量占比為16.83%～24.16%。P.lilacinum和B.bassiana在4種農(nóng)田土壤中的分布也占一定優(yōu)勢，其菌株數(shù)總占比分別為9.94%和9.58%。

2.3 保山4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)蟲生真菌不同月份的消長動態(tài)

從圖2可見，一年中每個月份保山4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤中都有蟲生真菌的分布，菌株數(shù)量具有相似的季節(jié)分布規(guī)律，夏季(6—8月)菌株檢出率較高，春季(3—5月)和秋季(9—11月)較少，冬季(1—2月和12月)最少。其中，7月的菌株檢出率最高(498株，占總數(shù)的15.1%)，1—7月菌株數(shù)量逐漸增多，7—12月菌株數(shù)量逐漸減少。

不同類型作物農(nóng)田的蟲生真菌在一年內(nèi)不同月份的分布不同?？傮w來看，茶園中各月檢出的菌株數(shù)都為最高，咖啡田為其次，玉米田較低，煙田各月的菌株數(shù)量最少(可能受煙堿等抑菌抗蟲物質(zhì)的影響)。茶園、咖啡田和玉米田在7月菌株數(shù)量較接近，都達(dá)到頂峰，茶園主要在1—5月和9—12月的菌株數(shù)量遠(yuǎn)高于其它農(nóng)田，從而拉開差距，說明茶園在春秋冬季比其它3種農(nóng)田更適宜蟲生真菌的繁衍。不同作物農(nóng)田的消長動態(tài)波動幅度略有不同，玉米田2月和8月的菌株數(shù)量略高于咖啡田，煙田6月和10月的菌株數(shù)量略高于玉米田。不同栽培模式對蟲生真菌的分布有影響，一年生作物農(nóng)田(玉米田和煙田)中蟲生真菌菌株數(shù)低于多年生作物農(nóng)田(茶園和咖啡田)。

圖2 保山典型農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)蟲生真菌不同月份的消長動態(tài)Fig.2 Monthly fluctuation of entomogenous fungi in Baoshan field ecosystem

3 討 論

在保山4種類型農(nóng)田土壤中分離到3340株蟲生真菌菌株，包括了3科6屬20種，說明保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)蟲生真菌資源豐富、物種多樣性也較高。王品[18]從中國8省4大茶區(qū)土壤中分離的蟲生真菌有4屬11種。郭先見等[19]在安徽黃山市湯口鎮(zhèn)茶園分離到1041株蟲生真菌，屬于6屬13種。這些研究表明，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中也存在多種類型的蟲生真菌能適應(yīng)其生境。保山氣候溫暖濕潤，調(diào)查的2個區(qū)域(潞江壩和騰沖)的生態(tài)條件較好，屬于典型的山地生態(tài)系統(tǒng)，植被資源豐富，是蟲生真菌野生資源的天然儲藏庫，有利于蟲生真菌向農(nóng)田擴(kuò)散分布。

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)受人為擾動較大，生物多樣性往往低于同地區(qū)的自然生態(tài)系統(tǒng)[1,20]。本課題組前期在保山市太保山森林公園進(jìn)行了為期一年的調(diào)查，分離到3科9屬24種共計(jì)395株蟲生真菌菌株[21]。保山市2個地區(qū)4種農(nóng)田全年獲得的菌株數(shù)量(3340株)遠(yuǎn)超過太保山森林公園(395株)，但物種豐富度相對較低(4種農(nóng)田中共20種，太保山24種)。這說明農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的土壤營養(yǎng)豐富，有利于蟲生真菌菌株數(shù)量的增加，而山地生態(tài)系統(tǒng)的生境多樣性更有利于蟲生真菌的物種多樣性分布。劉玉軍等[22]報道安徽歙縣油茶林蟲生真菌的個體數(shù)量較豐富，但物種多樣性指數(shù)較低。李巧等[20]研究紫膠林—農(nóng)田復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)中甲蟲的多樣性，發(fā)現(xiàn)天然紫膠林的生物多樣性最高，人工紫膠林其次，兩種農(nóng)田(稻田和旱田)的生物多樣性最低。

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的不同作物系統(tǒng)存在特異性，其間害蟲具有空間異質(zhì)性[23]，那么其蟲生真菌也應(yīng)該存在空間異質(zhì)性。保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，同一地理分布的不同作物農(nóng)田中蟲生真菌的種類和數(shù)量有較大差異。茶和烤煙兩種作物的農(nóng)田調(diào)查樣地都分布在騰沖地區(qū)，氣候條件(亞熱帶季風(fēng)氣候)和地質(zhì)土壤構(gòu)造(火山灰土)比較一致，但茶園蟲生真菌物種(18種)和菌株數(shù)最多(1087株)，煙田最少(12種，621株)；而分布于不同地理區(qū)域的茶園(騰沖)和咖啡(潞江壩)蟲生真菌的物種豐富度又較接近(分別為18種和17種)。較多種類(11種)的蟲生真菌在4種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中都有分布，而只在某些類型農(nóng)田中分布的蟲生真菌(9種)也沒有顯示出地理區(qū)域特異性(如：高黎貢綠僵菌等4種真菌分布于潞江壩的咖啡田與騰沖的茶園中，靛青綠僵菌和萊氏綠僵菌分布于潞江壩的玉米田和騰沖的茶園中，紅蟻線蟲草分布于潞江壩的咖啡田和騰沖的煙田中)。Wakil等[24]調(diào)查了旁遮普和巴基斯坦不同地理區(qū)域中蟲生真菌的分布，認(rèn)為地理屬性對儲糧害蟲蟲生真菌的發(fā)生狀況影響較大。保山市蟲生真菌的分布受地理區(qū)域的影響小，究其原因，調(diào)查地(潞江壩和騰沖)同在一個區(qū)域，雖然兩地年積溫有所差異，但整體上地理環(huán)境條件差異不夠大，對蟲生真菌分布的影響不明顯。

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中生物的種類和數(shù)量受農(nóng)作物品種、栽培模式、施肥、農(nóng)藥施用等耕種措施的影響[1]。保山多年生作物農(nóng)田(茶園和咖啡田)中蟲生真菌的種類和數(shù)量都高于一年生作物(玉米田和煙田)。Hummel等[25]對北卡羅來納州西部蔬菜地土壤蟲生真菌的研究認(rèn)為，耕作模式是影響蟲生真菌生存和繁衍的主要因素。保山農(nóng)田蟲生真菌的發(fā)生也主要與栽培的作物種類和作物栽培模式有關(guān)。不同栽培模式，農(nóng)田受人為擾動程度不同。茶園和咖啡田為多年生作物，涉及農(nóng)事活動主要為除草、施肥等處理，受人為擾動較少。玉米田和煙田為一年生輪作種植，涉及除草、施肥、深耕、曬地等農(nóng)事活動，受人為擾動大。王品等[18]認(rèn)為，適當(dāng)?shù)娜斯じ深A(yù)能改善茶園的生態(tài)環(huán)境，提高蟲生真菌多樣性。但從研究結(jié)果看，人工擾動過多，勢必降低蟲生真菌的多樣性和種群數(shù)量。劉玉軍等[22]認(rèn)為，粗放管理的油茶林比精細(xì)管理的油茶林中植物多樣性較高，蟲生真菌也有相似的規(guī)律。

保山4種作物農(nóng)田蟲生真菌都具有相似的季節(jié)分布規(guī)律，夏季菌株數(shù)量最多，王品[18]、郭先見等[19]，及劉玉軍等[22]的研究有相似結(jié)果。茶園在各個月份蟲生真菌的數(shù)量都最高，尤其是春秋冬季遠(yuǎn)高于其它3種類型作物的農(nóng)田，說明茶園生態(tài)系統(tǒng)更利于蟲生真菌的大量繁衍。關(guān)于茶園蟲生真菌有不少研究報道[18-19,22]，都認(rèn)為茶園蟲生真菌種群數(shù)量豐富。煙田中蟲生真菌在各個月份都較低，在溫度最高的7月份也未見大的增幅。不同作物農(nóng)田蟲生真菌在不同月份的波動幅度略有不同，可能受溫濕度變化等因素的影響。

筆者前期對高黎貢山蟲生真菌的研究[26]發(fā)現(xiàn)，森林生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌多數(shù)優(yōu)勢種具有生境類型偏好性。保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌優(yōu)勢種的生境偏好性較弱，幾個優(yōu)勢種在4種作物農(nóng)田中都處于優(yōu)勢地位。分析原因?yàn)?，與森林生態(tài)系統(tǒng)相比，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的不同生境因素差異相對較小，適宜生長的蟲生真菌在不同類型農(nóng)田中都能大量繁衍形成優(yōu)勢地位。

農(nóng)向群[27]認(rèn)為，在農(nóng)田耕地和鄰近草地中綠僵菌比白僵菌更常見，從農(nóng)田中分離到綠僵菌的幾率比林地的要高得多。本研究結(jié)果也顯示，與同地區(qū)的森林生態(tài)系統(tǒng)(太保山)相比，保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中綠僵菌更占優(yōu)勢地位。太保山森林生態(tài)系統(tǒng)中，優(yōu)勢屬為蟲草屬(7種273株)和白僵菌屬(5種80株)，綠僵菌的種類和數(shù)量都較少(3種11株)[21]。保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中第一優(yōu)勢屬為綠僵菌屬，其種類和數(shù)量(8種，菌株數(shù)占總數(shù)的64.76%)遠(yuǎn)超過第二優(yōu)勢屬白僵菌屬(4種，菌株數(shù)占13.32%)和蟲草屬(5種，菌株數(shù)占6.02%)。郭先見等[19]對茶園蟲生真菌的研究中，淡紫紫孢菌、球孢白僵菌和金龜子綠僵菌為優(yōu)勢種群。淡紫紫孢菌和球孢白僵菌在保山4種類型農(nóng)田中也屬于優(yōu)勢種，但保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中最占優(yōu)勢的物種是棕色綠僵菌，這可能是不同的地理環(huán)境造成的。

4 結(jié) 論

保山市4種類型農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)(騰沖火山區(qū)的茶園和煙田，潞江壩熱作區(qū)的咖啡田和玉米田)中蟲生真菌菌株數(shù)量豐富、物種多樣性較高，共獲得3科6屬20種共計(jì)3340株菌株。蟲生真菌的分布受地理區(qū)域的影響較小，受作物種類和栽培模式的影響較大，蟲生真菌的數(shù)量和豐富度均為茶園和咖啡田2種多年生作物農(nóng)田較高，而玉米田和煙田2種1年生作物農(nóng)田較低。保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌優(yōu)勢種屬現(xiàn)象明顯，且4種農(nóng)田中的優(yōu)勢屬和優(yōu)勢種比較一致，第一優(yōu)勢屬為綠僵菌屬(Metarhizium)，第二優(yōu)勢屬為白僵菌屬(Beauveria)和蟲草屬(Cordyceps)；第一優(yōu)勢種為棕色綠僵菌(M.brunneum)，第二優(yōu)勢種為保山綠僵菌(M.baoshanense)，其次為淡紫紫孢菌(P.lilacinum)和球孢白僵菌(B.bassiana)。保山4種類型農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中一年12個月均有蟲生真菌的分布，夏季(6—8月)菌株數(shù)量最多，春秋季菌株數(shù)量較少，冬季菌株數(shù)量最少。茶園和咖啡田各月的菌株檢出數(shù)高于玉米田和煙田；茶園夏季的菌株數(shù)量與咖啡田和玉米田差距不大，主要是春秋冬季的菌株數(shù)量拉開差距，使其菌株總數(shù)為最高(1087株)。