徐祥，徐建彬，梁斌，徐俊

河南省白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（信陽 464400）

白酒是我國特有的民族傳統(tǒng)產(chǎn)品，有著上千年的歷史，與伏特加、白蘭地、朗姆酒、威士忌、金酒并列為世界六大蒸餾酒[1]。中國白酒主要是以糧谷為主要原料，用大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的[2]。白酒中除乙醇和水以外，還含有1%左右的有機物，如有機酸（醋酸，乳酸，蘋果酸，酒石酸和亞油酸等）、酯類（乙酸乙酯，乳酸乙酯和己酸乙酯等）、內(nèi)酯、酚類、醇類、雜環(huán)、萜烯和芳香族化合物等。這些有機物對白酒的風味起到及其重要的作用[3]。

甜味劑是一類重要的賦予食品以甜味，可提高食品品質(zhì)的食品添加劑。在現(xiàn)代食品工業(yè)中廣泛應用的甜味劑主要包括乙?；前匪徕洠ò操惷郏?、鄰苯甲?；酋０封c（糖精鈉）、環(huán)己基氨基磺酸鈉（甜蜜素）、三氯蔗糖（蔗糖素）等[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，攝入高劑量的甜味劑會對人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害，甚至引發(fā)癌癥。因此，甜味劑在生產(chǎn)中合理的使用，不僅關(guān)系到產(chǎn)品的品質(zhì)，更關(guān)系到消費者的安全與健康[7]。針對白酒來說，一些生產(chǎn)企業(yè)在白酒生產(chǎn)過程中從自身利益出發(fā)，為掩蓋白酒的苦澀和保持酒體干冽、醇厚、綿軟的口感，違法添加甜味劑如安賽蜜、糖精鈉等來改善白酒的口感。也有企業(yè)因原材料進貨把關(guān)不嚴，使用含有甜味劑的酒用香精香料，造成白酒產(chǎn)品中甜味劑超標。但GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[8]中明確規(guī)定，白酒在生產(chǎn)過程中不允許添加人工甜味劑。

目前關(guān)于食品中甜味劑的檢測方法較多，如高效液相色譜-紫外檢測法[9-13]、超高壓液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[14-15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測甜味劑的報道[16-18]。液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法雖是檢測白酒中甜味劑的最佳方法，但其設備比較昂貴，難以普及，應用范圍受限。試驗結(jié)合國家標準中安賽蜜、糖精鈉的測定方法[19-20]，優(yōu)化白酒中安賽蜜、糖精鈉的樣品前處理步驟，探索各因素對試驗結(jié)果的影響。該試驗方法操作簡單，對基層檢測機構(gòu)和白酒企業(yè)中安賽蜜、糖精鈉的日常檢測具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機濾膜（孔徑0.22 μm，津?。?；水（娃哈哈純凈水）；甲醇、乙酸銨[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；食品甜味劑乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜）溶液標準物質(zhì)[1.00 mg·mL-1，GBW（E）100171]、食品甜味劑糖精鈉溶液標準物質(zhì)[1.00 mg·mL-1，GBW（E）100166）：北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司。

乙酸銨溶液（20 mmol·L-1）：稱取1.54 g乙酸銨，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

白酒樣品由河南五谷春酒業(yè)股份有限公司提供。

1.2 儀器與設備

Agilent1260高效液相色譜儀（配有紫外檢測器、自動進樣器、OpenLabChemStation工作站，安捷倫科技有限公司）；1 000 mL全玻璃微孔過濾器（津?。籑L204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18，柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm。柱溫：40 ℃；流動相：甲醇-乙酸銨溶液=20∶80（V/V）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：230 nm；進樣體積：10 μL。

1.3.2 標準曲線

分別準確移取安賽蜜、糖精鈉標準儲備液，用純凈水稀釋成1，5，10，20和30 μg·mL-1標準系列質(zhì)量濃度。在最佳的色譜條件下，分別取10 μL進行色譜分析，以標準系列溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 樣品測定

樣品前處理：準確量取25 mL酒樣于50 mL玻璃燒杯中，水浴加熱至酒樣近干，用娃哈哈純凈水定容至25 mL，過0.22 μm有機濾膜，待上機分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的優(yōu)化2.1.1 柱溫的影響

通過多次試驗，詳細考察了不同柱溫對安賽蜜和糖精鈉的保留時間、樣品峰的對稱性及樣品的響應值等影響。將柱溫分別設定10，20，30，40和50 ℃進行試驗，如圖1所示。溫度較低時，糖精鈉的色譜峰較寬，響應值較低。隨著溫度的升高，安賽蜜和糖精鈉保留時間逐漸縮短，樣品峰的對稱性逐漸增高，樣品的響應值逐漸增強。但是考慮到溫度過高，對色譜柱的使用壽命有重大影響，所以將柱溫的優(yōu)化溫度選擇為40 ℃。

圖1 不同柱溫條件下安賽蜜和糖精鈉的色譜圖

2.1.2 流動相的影響

試驗以GB 5009.28—2016《食品安全國家標準食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》和GB/T 5009.140—2003《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定》為依據(jù)。由于GB/T 5009.140—2003中流動相配制過程繁瑣，且乙腈毒性相對較大，對操作者有潛在的危害，所以選擇GB 5009.28—2016中流動相（甲醇-乙酸銨溶）液。如圖2所示，甲醇與乙酸銨溶液比例少量變化就會對安賽蜜與糖精鈉的保留時間有較大影響。隨著甲醇比例的增加，安賽蜜與糖精鈉的保留時間逐漸縮短，樣品的響應值逐漸增強。但是當甲醇比例超過20%時，樣品保留時間縮短變化不明顯，且兩峰距離較近，不利于準確定量。綜合靈敏度和分離度等因素考慮，將流動相甲醇與乙酸銨溶液比例設置為20∶80（V/V）。

圖2 流動相甲醇與乙酸銨溶液不同比例條件下安賽蜜和糖精鈉的色譜圖

2.2 樣品前處理條件的選擇

由于白酒中乙醇質(zhì)量分數(shù)較高，在進行液相色譜分離時，容易對甜味劑在色譜柱的保留性能產(chǎn)生影響[21]。通過圖3中（a）與（b）對比發(fā)現(xiàn)，樣品未經(jīng)前處理直接進樣后，譜圖較復雜，對糖精鈉的響應吸收有重要影響，且樣品中的某種物質(zhì)與安賽蜜的色譜峰有部分重疊，影響安賽蜜的準確定量。因此，樣品必須經(jīng)過前處理，減少乙醇等其他物質(zhì)的影響。樣品在GB/T 5009.140—2003中經(jīng)過前處理約稀釋了10倍，在GB 5009.28—2016中約稀釋了25倍。用稀釋的辦法確實可以解決酒樣基質(zhì)效應問題，減少乙醇等其他物質(zhì)的影響。但因方法的定量限較高，不符合實際樣品的檢測，因此稀釋方法不適合所有白酒中痕量甜味劑的檢測[18]。試驗采用水浴加熱的方法降低白酒中乙醇等其他物質(zhì)的含量，減小其對色譜峰的影響，減弱基質(zhì)效應。通過圖3（c）與（d）對比發(fā)現(xiàn)，通過水浴加熱的方式進行前處理，樣品的色譜峰與安賽蜜和糖精鈉標準溶液混合液的色譜峰的保留時間，響應值基本保持一致，排除了乙醇等物質(zhì)的影響。

圖3 色譜圖

2.3 線性范圍和檢出限

配制安賽蜜、糖精鈉質(zhì)量濃度范圍在1～30 μg·mL-1的系列標樣溶液，按試驗確定的最佳色譜條件下進行測定，獲得不同質(zhì)量濃度下各組分的峰面積。將組分峰面積相對應的質(zhì)量濃度繪制工作曲線，各組分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)如表1所示。樣品中甜味劑的定量范圍為1～30 μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)r＞0.999 9，可以滿足日常檢測的要求。在記錄的色譜圖中，以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）分別計算對應目標化合物的質(zhì)量分數(shù)，得出目標化合物的檢出限和定量限。安賽蜜的檢出限為0.15 mg·kg-1，定量限為0.35 mg·kg-1；糖精鈉的檢出限為0.75 mg·kg-1，定量限為1.7 mg·kg-1，遠低于國標方法的規(guī)定。

表1 兩種甜味劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 方法的回收率和精密度

試驗采用空白基質(zhì)添加不同濃度的目標化合物的混合標準溶液，在已優(yōu)化的色譜條件下，對目標化合物進行定量。分別移取質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的安賽蜜、糖精鈉標準儲備液，制成質(zhì)量濃度為2，4和20 μg·mL-1的加標溶液，按1.5小節(jié)進行樣品處理，按照最佳優(yōu)化條件下進行色譜分析，平行測定6次，具體情況見表2。由表2可以看出，安賽蜜的加標回收率在92.81%～100.58%之間，相對標準偏差在1.23%～4.46%之間；糖精鈉的加標回收率在95.34%～101.93%之間，相對標準偏差在2.41%～6.64%之間，測定結(jié)果準確可靠。

表2 兩種甜味劑的相對標準偏差和回收率

2.5 樣品檢測結(jié)果

在上述建立的色譜條件基礎上，對河南五谷春酒業(yè)股份有限公司提供的酒樣1#，2#，3#，4#，5#和6#進行色譜檢測，測定結(jié)果如表3所示。所檢測酒樣中均未檢出安賽蜜、糖精鈉，所測結(jié)果符合國家標準對蒸餾酒中甜味劑含量的要求。

表3 酒樣中兩種甜味劑的測定結(jié)果

3 結(jié)論

通過以上試驗，建立了一種采用高效液相色譜同時檢測白酒中安賽蜜與糖精鈉兩種甜味劑的方法。該方法快速、高效、準確，能夠在3 min內(nèi)完成樣品的分析，大大節(jié)省了單次單個檢測耗費的試劑和時間，提高了工作效率。白酒樣品只需進行水浴加熱后定容，即可進樣檢測，彌補了國家標準方法的前處理復雜，不適合所有白酒中痕量甜味劑的檢測不足之處，對保護白酒生產(chǎn)企業(yè)和消費者的利益起到了很大的作用。該方法的精密度和精確性均較好，可望在基層檢測機構(gòu)的市場監(jiān)測過程中發(fā)揮重要的作用。