肖勇生，包珍，張良，黃安全，王訓(xùn)斌

1. 江西省食品發(fā)酵研究所（宜春 336000）；2. 宜春市米粉制品工程技術(shù)研究中心（宜春 336000）；

近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)實(shí)力的不斷提升和國(guó)內(nèi)物質(zhì)生活的極大豐富，人口老齡化、亞健康和慢性疾病成為危害健康的主要因素。健康中國(guó)概念開(kāi)始引導(dǎo)居民形成更好的生活習(xí)慣和攝入更健康的食品，植物基食品成為新熱點(diǎn)[1]，一些植物基食品形成較好的市場(chǎng)效益。蛋白質(zhì)是人類(lèi)第一營(yíng)養(yǎng)素，植物蛋白是目前最受關(guān)注的植物基組分之一，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，以米糠蛋白為原料，經(jīng)蛋白酶酶解或微生物發(fā)酵等方法可制得具有生物活性的蛋白肽，其具有抗氧化（清除自由基等）、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、低致敏等作用。我國(guó)是稻谷種植大國(guó)，稻谷經(jīng)加工后產(chǎn)生約10%的米糠副產(chǎn)物，是一種量大面廣的可再生資源[2]。米糠中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，全脂米糠一般含有12%～18%蛋白質(zhì)、16%～20%脂肪、12%左右灰分和14%膳食纖維，具有較高利用價(jià)值[3]。米糠作為一種廉價(jià)易得、營(yíng)養(yǎng)豐富的稻米加工副產(chǎn)品，從米糠中尋求新的植物蛋白資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。鑒于此，介紹米糠蛋白肽的制備及其生物活性研究進(jìn)展，以期為大米加工副產(chǎn)物的綜合利用提供一條切實(shí)可行的解決方案。

1 米糠蛋白肽提取方法

肽的提取方法大致分可為理化方法、酶法和生物發(fā)酵法。理化方法工藝最為簡(jiǎn)單，但其工藝難以完全控制氨基酸缺損、水解程度及產(chǎn)物肽的氨基酸序列等問(wèn)題，存在制備的米糠蛋白肽提取率低且易變性等缺點(diǎn)[4]。相對(duì)而言，酶水解法和微生物發(fā)酵法的工藝條件較為溫和，且能有效避免有害化學(xué)物質(zhì)的帶入，制得蛋白肽營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，但相對(duì)于理化方法來(lái)說(shuō)工藝成本較高[5]。此外，利用超聲波輔助等輔助方法也能夠提升蛋白肽的提取效率[6]。

1.1 理化方法

1.1.1 物理法

物理法是指完全通過(guò)設(shè)備進(jìn)行物理工藝處理的一種方法，如將全脂或脫脂米糠通過(guò)膠體磨均質(zhì)破碎米糠的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使米糠蛋白肽溶出后通過(guò)膜過(guò)濾等方式提取米糠蛋白肽[7]。據(jù)報(bào)道，經(jīng)膠體磨研磨，全脂米糠漿料上清液中蛋白質(zhì)提取率可從20%增加到30%左右，進(jìn)一步均質(zhì)增加到40%左右，但蛋白肽有效提取較低，實(shí)際操作時(shí)可以考慮將物理法與其他方法聯(lián)合使用。

1.1.2 化學(xué)法

化學(xué)法又叫酸堿水解法，是提取米糠蛋白最常采用的方法，通過(guò)調(diào)節(jié)酸堿度使米糠緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，并對(duì)蛋白質(zhì)分子次級(jí)鍵特別是氫鍵進(jìn)行破壞，使蛋白質(zhì)分子表面具有相同電荷，促進(jìn)結(jié)合物與蛋白質(zhì)分離，提高蛋白質(zhì)分子溶解率。酸堿水解法提取米糠蛋白雖然簡(jiǎn)單易行，但在堿液濃度過(guò)高的情況下，不僅使蛋白提取物的顏色深暗，影響產(chǎn)品風(fēng)味和色澤，而且還可能產(chǎn)生不利反應(yīng)，改變蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)特性[8]。有報(bào)道稱(chēng)，在堿性條件下蛋白質(zhì)的半胱氨酸和絲氨酸殘基會(huì)轉(zhuǎn)變成脫水的丙氨酸，與賴(lài)氨酸的ε-氨基結(jié)合形成賴(lài)氨酰胺丙氨酸。另外，高堿條件下還會(huì)產(chǎn)生諸如蛋白質(zhì)變性和水解，加速美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)，提取物中非蛋白質(zhì)含量增加，分離效果降低等不利現(xiàn)象。

1.2 酶水解法

酶法提取米糠蛋白的反應(yīng)條件溫和，蛋白質(zhì)提取率較高，且能更多地保留蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也避免傳統(tǒng)理化方法提取米糠蛋白所帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)。因此，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于酶法提取米糠蛋白的報(bào)道較多[9]。用于提取米糠蛋白的酶主要有蛋白酶、糖酶和植酸酶等，作用機(jī)制主要是將米糠蛋白分子降解為可溶性物質(zhì)，或?qū)⑵鋸呐c半纖維素、植酸等形成的復(fù)合物中解聚后抽提出來(lái)。Ansharullah等[10]提出采用糖酶，破壞植物細(xì)胞壁來(lái)改善植物蛋白的提取率；也有研究表明蛋白質(zhì)經(jīng)不同的蛋白酶水解后，會(huì)產(chǎn)生不同氨基酸序列和不同分子量的多肽，表現(xiàn)出不同的生物活性[11]；此外，蛋白酶水解制備多肽時(shí)，還會(huì)因?yàn)槟承┲参锏鞍字锌赡芎忻敢种苿┒l(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，酶促反應(yīng)速度不僅不會(huì)提高，反而會(huì)迅速下降[12]。因此酶法制備多肽時(shí)，酶的種類(lèi)、用量、底物濃度、溫度、pH、時(shí)間等參數(shù)都是酶法制備活性肽工藝的研究重點(diǎn)。Wang等[13]采用半纖維素酶和植酸酶聯(lián)合使用，提取米糠蛋白，蛋白提取率可達(dá)92%，采用木聚糖酶和植酸酶降解米糠中的木聚糖和植酸，解除它們與蛋白質(zhì)的相互作用，增加和改善米糠蛋白的可溶性，通過(guò)酶法處理，使米糠蛋白的提取率從34%提高到76%；王立等[14]分別采用蛋白酶、糖酶提取米糠蛋白，其蛋白提取率在60%左右。

酶具有反應(yīng)的專(zhuān)一性，如果采用單酶作用范圍局限，水解效率較低，實(shí)際操作中一般采用多酶進(jìn)行水解，利用不同酶對(duì)蛋白質(zhì)的酶解特異性起到協(xié)同增效作用。有研究表明[15-17]，蛋白質(zhì)經(jīng)多酶復(fù)合水解的產(chǎn)物活性明顯高于相對(duì)應(yīng)的單酶水解產(chǎn)物，而國(guó)內(nèi)外多以單酶水解小米蛋白進(jìn)行研究，關(guān)于復(fù)合酶水解小米蛋白制備活性肽還有待進(jìn)一步研究。

1.3 生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法制備生物活性肽，是指某些能夠代謝產(chǎn)生特定目標(biāo)酶的微生物來(lái)生產(chǎn)活性肽，微生物在發(fā)酵階段將這些肽持續(xù)排放到體系中，具有此功效的微生物主要有枯草芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等，微生物高效的蛋白質(zhì)水解體系有助于生物活性肽的釋放，所生產(chǎn)的活性肽能夠直接進(jìn)入人體內(nèi)消化系統(tǒng)，更容易被人體吸收，因此更加安全，應(yīng)用潛力巨大[18]。郭麗娜等[19]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵小米糠，成功制備抗氧化活性肽；李慧娟等[20]以枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌組成混合菌株固態(tài)發(fā)酵豆粕制備具有ABTS自由基較強(qiáng)清除活性的大豆肽。但是微生物發(fā)酵法也存在某些不足之處，如微生物發(fā)酵及代謝過(guò)程復(fù)雜，產(chǎn)物難以控制。另外，發(fā)酵體系中為微生物提供氮源、碳源等的原輔料成分較多，造成產(chǎn)物的分離純化較為困難等，通過(guò)研發(fā)精確發(fā)酵控制技術(shù)、精簡(jiǎn)發(fā)酵過(guò)程是未來(lái)發(fā)展的重要方向，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)肽的高效、精確制備。

此外也有報(bào)道采用物理方法結(jié)合酶水解技術(shù)提取蛋白質(zhì)，效果明顯[21]，單獨(dú)采用反復(fù)凍融、超聲波、高速剪切和高壓等工藝時(shí)米糠蛋白提取率分別為12%，15%，16%和11%，而經(jīng)超聲波處理和淀粉酶水解，蛋白提取率提取為33.9%，若采用蛋白酶處理則提取率可達(dá)57.8%，經(jīng)高壓處理同時(shí)使用淀粉酶和蛋白酶處理后提取率可達(dá)66.6%，應(yīng)用效果高于纖維素酶，所以采用物理方法解除米糠蛋白的束縛對(duì)蛋白的提取也是一種很好的輔助手段。

2 米糠蛋白肽的生物活性

2.1 抗氧化

眾多研究發(fā)現(xiàn)[22-23]，活性氧自由基造成的氧化損傷是造成機(jī)體衰老、細(xì)胞及組織損傷和細(xì)胞發(fā)生癌變的一個(gè)重要起因，因此清除超氧陰離子和羥自由基等的能力是評(píng)估肽的抗氧化值的重要指標(biāo)。米糠的酶水解提取物中具有豐富的供氫體，通過(guò)對(duì)高度氧化性的自由基的還原反應(yīng)可以使其連鎖反應(yīng)得到有效抑制，進(jìn)而對(duì)自由基發(fā)揮清除或抑制作用。有研究報(bào)道表明米糠蛋白肽具有較強(qiáng)的自由基清除能力。周梅等[24]研究表明，隨著米糠蛋白和米糠蛋白肽濃度增加，清除率增高，米糠蛋白肽在最高濃度9.6 mg/mL下DPPH清除率最大，結(jié)果為71.77%。米糠蛋白的DPPH清除率隨濃度變化不大，高濃度下DPPH清除率最大為29.91%，進(jìn)一步證實(shí)DPPH清除率可能與特定時(shí)間水解產(chǎn)生的活性片段的多少、長(zhǎng)度和序列等有關(guān)。于國(guó)萍等[25]利用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解制備米糠蛋白肽，以DPPH，·OH清除率為主要指標(biāo)，采用不同截留分子量（1.0×104Da和3×103Da）的超濾膜對(duì)米糠蛋白肽進(jìn)行初步分離，超濾法處理得到不同分子質(zhì)量的多肽，其抗氧化能力隨分子質(zhì)量的增大而呈現(xiàn)出逐漸減弱的趨勢(shì)，分子質(zhì)量小于3 000 Da的多肽組分RBP-Ⅲ對(duì)DPPH清除率最強(qiáng)。由此可知不同制備方法及分離純化條件所得到米糠蛋白肽的抗氧化活性差別較大。

2.2 ACE抑制活性

ACE又叫高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，主要用于保健食品的生產(chǎn)，對(duì)于高血壓有很好的治療作用。眾所周知，人體內(nèi)的血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用下生成血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ是己知的最高內(nèi)源升壓肽，ACE抑制劑能阻止血管緊張素Ⅱ的生成，因此，ACE抑制劑可作為降血壓輔助劑。鄒智鵬等[26]采用堿性蛋白酶水解小米米糠蛋白，并經(jīng)膜分離法制備4種不同分子質(zhì)量的多肽組分，研究小米米糠蛋白水解物及其膜分離組分的降血壓及抗氧化等相關(guān)活性發(fā)現(xiàn)，小米米糠蛋白水解物的降血壓活性與其分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)，研究認(rèn)為＜1 kU肽組分可能作為功能性成分用于降血壓相關(guān)的功能食品和保健品的開(kāi)發(fā)，小米米糠蛋白水解物是降血壓功能食品開(kāi)發(fā)的優(yōu)良原料。Chen等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，利用根霉菌oryzae發(fā)酵制備的小米肽具有降低大鼠血壓等功效。

2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

研究表明，某些生物活性肽或蛋白酶解物能夠起到免疫調(diào)節(jié)作用（細(xì)胞免疫為主），包括淋巴細(xì)胞增殖、抗體合成及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用。這些免疫調(diào)節(jié)肽具有調(diào)節(jié)人類(lèi)淋巴細(xì)胞的增殖、刺激巨噬細(xì)胞的吞噬活性、抑制某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生的作用[28-29]。在人體中，細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫是機(jī)體的3個(gè)主要免疫功能，其免疫能力主要是通過(guò)血清溶血值、免疫器官增重、脾淋巴細(xì)胞增殖、單向免疫擴(kuò)散以及單核吞噬細(xì)胞吞噬能力等來(lái)反映的。何曙劍[30]研究顯示，如果T淋巴細(xì)胞受到ConA的刺激，會(huì)出現(xiàn)母細(xì)胞增殖現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)光密度值的測(cè)定可以看出，在經(jīng)過(guò)為期20 d的腹腔注射和灌胃之后，米糠肽對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖能力會(huì)得到顯著提升。張亞輝[31]通過(guò)在胰蛋白酶加酶量90 U/g、底物濃度5%、水解時(shí)間2.5 h條件下酶解米糠蛋白，其水解度達(dá)21.51%，米糠蛋白肽主要組分為分子量介于390～14 300 Da之間的5種短肽，灌胃給予高劑量米糠短肽能顯著提高正常小鼠脾臟、胸腺指數(shù)及脾淋巴細(xì)胞增殖能力等免疫活性指標(biāo)，呈現(xiàn)較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。

2.4 低致敏

由于米糠蛋白非常容易被消化吸收，極少引發(fā)過(guò)敏，因此可將其作為特殊群體食品的添加蛋白。如市面上出售的母乳化奶粉中大多都是通過(guò)添加乳鐵蛋白和免疫球蛋白來(lái)增強(qiáng)嬰幼兒的免疫力，而此類(lèi)蛋白中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，容易引發(fā)過(guò)敏現(xiàn)象，嬰幼兒自身機(jī)體發(fā)育還不夠成熟，因此更容易發(fā)生過(guò)敏。米糠蛋白則不含類(lèi)似致敏因子，以往的報(bào)道中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嬰幼兒對(duì)稻米出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，因此可將其作為增強(qiáng)免疫力的蛋白資源。王文高等[32]發(fā)現(xiàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)大豆分離蛋白和米糠蛋白進(jìn)行抗原性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白具有更強(qiáng)的抗原性，而米糠蛋白表現(xiàn)出很低的抗原性；利用大米蛋白過(guò)敏患者血清中特異性IgE與過(guò)敏原相結(jié)合的特點(diǎn)，檢測(cè)大米蛋白中各組分的抗原性，從鹽溶性的蛋白中分離出分子質(zhì)量為16 000，15 500和14 000 U的過(guò)敏性蛋白，其等電點(diǎn)分別為pH 6.3，6.5和7.9，并指出過(guò)敏成分主要為清蛋白。Izumi等[33]推斷出16 000 U過(guò)敏蛋白的二硫鍵連接方式為5個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的存在使該蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)保持相對(duì)的穩(wěn)定，具有很高的耐熱性，不易被蛋白酶分解[31]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

動(dòng)物蛋白因含有易導(dǎo)致心血管疾病的飽和脂肪酸和膽固醇，而使其攝入量受到限制。相對(duì)于動(dòng)物蛋白來(lái)說(shuō)，植物蛋白不僅資源豐富、廉價(jià)，尤其是某些植物蛋白肽還具有獨(dú)特的生理功能，可以被用作某些藥物替代品或者食品添加劑[34]，因此得到營(yíng)養(yǎng)學(xué)界的極大關(guān)注。米糠蛋白作為一種兼顧環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益的植物性副產(chǎn)資源，具有其他植物蛋白無(wú)法比擬的低過(guò)敏性和高蛋白質(zhì)生物價(jià)特性。米糠蛋白肽已知的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽[35]有低過(guò)敏源、素食、高BCAA、非轉(zhuǎn)基因、無(wú)激素、無(wú)溶劑殘留、低嘌呤。我國(guó)關(guān)于提取米糠蛋白肽的研究和報(bào)道很多，但是距離成熟的工業(yè)化生產(chǎn)還有一段距離，因此，對(duì)于像我國(guó)這樣米糠資源豐富的國(guó)家來(lái)說(shuō)，米糠蛋白的開(kāi)發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義與廣闊的應(yīng)用前景，充分利用該蛋白資源，開(kāi)發(fā)制備具有特定生理活性的米糠蛋白肽，對(duì)于提升大米精深加工利用水平和功能食品開(kāi)發(fā)等具有重要意義。