楊彩瑜 李熒 齊越 明彩榮 董笑博 賈冬

[摘要] 目的 研究癲癇清顆粒是否通過調(diào)控Sigma 1受體的表達，抑制阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠炎癥小體的活性。 方法 將小鼠隨機分為假手術組、模型組、鹽酸多奈哌齊組、癲癇清顆粒組、Sigma 1受體拮抗劑（BD1047）組和BD1047+癲癇清顆粒組。除假手術組外，其余各組小鼠的左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射淀粉樣蛋白（Aβ25-35）制作AD小鼠模型，連續(xù)給藥21 d，每日1次。第16天至第21天，Morris水迷宮試驗檢測小鼠的學習記憶能力，第22天，各組小鼠取材，HE染色觀察腦組織病理學變化，免疫組化法及免疫印跡法檢測核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1（NLRP1）、胱冬肽酶-1（caspase-1）的表達，免疫熒光法檢測Sigma 1受體的表達。 結果 與模型組相比，癲癇清顆粒組可減少AD模型小鼠的游泳總路程，降低海馬中NLRP1的表達，抑制caspase-1活性，增加Sigma 1受體表達。BD1047組與BD1047+癲癇清顆粒組小鼠中的游泳總路程與模型組小鼠相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），NLRP1和caspase-1的蛋白表達水平升高，Sigma 1受體的表達降低。 結論 癲癇清顆?？赏ㄟ^激活Sigma 1受體減少NLRP1表達，并抑制caspase-1活性，從而提高AD模型小鼠學習記憶功能。

[關鍵詞] 癲癇清顆粒;阿爾茨海默病;炎癥小體;Sigma1受體

[中圖分類號] R749.16? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）02-0029-05

Inhibitory effect of Dianxianqing Granule on inflammasome of Alzheimer's disease model mice by regulating Sigma 1 receptor

YANG Caiyu1? ?LI Ying1? ?QI Yue1， 2? ?MING Cairong1? ?DONG Xiaobo1? ?JIA Dong2

1.Graduate School of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang? ?110847， China; 2.The Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang? ?110034， China

[Abstract] Objective To study whether Dianxianqing Granule inhibit the activity of inflammasome in Alzheimer's disease （AD） model mice by regulating the expression of Sigma 1 receptor. Methods The mice were randomly divided into sham operation group， model group， donepezil hydrochloride group， Dianxianqing Granule group， Sigma1 receptor antagonist （BD1047） group， BD1047+Dianxianqing Granule group. Excepted for the sham group， the AD mouse model was made by injecting amyloid （Aβ25-35） into the left lateral ventricle of mice in the other groups once daily for 21 consecutive days. From Day 16 to Day 21， the learning and memory ability of the mice was detected by the Morris water maze. On Day 22， the mice in each group were sampled. The histopathological changes were observed by HE staining. The expression of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 （NLRP1） and caspase-1 was detected by immunohistochemistry and immunoblotting. The expression of the Sigma 1 receptor was detected by immunofluorescence assay. Results Compared with the model group， the Dianxianqing Granule group could reduce the total swimming distance， decrease the expression of NLRP1， inhibit caspase-1 activity and increase Sigma 1 receptor expression in the hippocampus of AD model mice. There were no statistically significant differences in the total swimming distance among the BD1047 group， the BD1047+Dianxianqing Granule group， and the model group（P>0.05）. The protein expression levels of NLRP1 and caspase-1 in the BD1047 group and the BD1047+Dianxianqing Granule group were increased， and the expression of the Sigma 1 receptor was decreased. Conclusion Dianxianqing Granule can reduce NLRP1 expression and inhibit caspase-1 activity by activating the Sigma 1 receptor， thereby improving learning and memory function in AD model mice.

[Key words] Dianxianqing Granule; Alzheimer's disease; Inflammasome; Sigma 1 receptor

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，具體表現(xiàn)在學習記憶力的減退及認知功能損害等，除了β淀粉樣蛋白（amyloid，Aβ）作為AD的主要病理特征外，近些年，學者們在研究AD發(fā)病機制的過程中普遍關注到，炎癥小體產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥反應是AD較為主要的病理變化特征[1]。大量研究可以發(fā)現(xiàn)，抑制炎癥小體的活化可減輕AD小鼠腦組織中β淀粉樣蛋白的沉積[2]，改善學習記憶能力[3]。

Sigma 1受體（σ1R）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在廣泛，多位于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)，是一種具有配體選擇性分子伴侶。AD患者σ1R表達減少，炎癥小體激活，并與學習記憶障礙密切相關。癲癇清顆粒為一種專利藥（專利號：ZL 2011 1 0069494），具有熄風豁痰、通暢血脈、消散瘀滯、改善智力等療效。前期研究表明，癲癇清顆粒可通過σ1R改善學習記憶能力，但是否與炎癥小體有關，則尚不清楚。因此，本研究利用Aβ25-35誘導AD小鼠模型，并使用癲癇清顆粒和σ1R拮抗劑進行干預，觀察癲癇清顆粒是否通過抑制炎癥小體的活性改善AD，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 動物? 選用SPF級ICR雄性小鼠[1]（動物倫理審批號：SYYXY2020082702），共96只，體重為25～30 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證號為SYXK（遼）2013-0009。

1.1.2 藥物和試劑? ①癲癇清顆粒：由遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院提供，藥品批號為20140110，規(guī)格：每克顆粒含有生藥含量為5.31 g，劑型：顆粒劑，劑量：24 g/d、療程：3個月;②鹽酸多奈哌齊片：由衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司提供，藥品批號140 606 A，規(guī)格：5 mg/片，劑型：片劑，劑量：10 mg/d，療程：1個月;③Aβ25-35：來源于美國Sigma公司，貨號;A4559;④核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1（NLRP1）抗體：由proteintech公司提供，貨號：00065275;⑤胱冬肽酶-1（caspase-1）抗體：由北京Bioss生物技術有限公司提供，貨號：AH11274428;⑥小鼠/兔IgG-免疫組化試劑盒：由BOSTER生物工程有限公司提供，貨號：15I11BD22;⑦BD1047：由TOCRIS公司提供，貨號：138356-21-5;⑧山羊抗兔IgG/辣根酶標記：由北京ZSGB-BIO生物技術有限公司提供，貨號：ZB-2301，批號：141987;⑨Sigma受體蛋白抗體（Anti-OPRS1）：由北京Bioss生物技術有限公司提供，貨號：bs-5111R;⑩Cy3標記的羊抗兔IgG：由北京Bioss生物技術有限公司提供，貨號：bs-0295G-Cy3。

1.1.3 儀器? DW-200型號腦立體定位儀（成都泰盟科技公司）;10 μl微量進樣器（上海高鴿微量進樣器廠）;MT-200型號Morris水迷宮（成都泰盟科技公司）;Y迷宮（遼寧中醫(yī)康復中心自制）。

1.2 方法

1.2.1 分組? 96只小鼠于沈陽醫(yī)學院適應性飼養(yǎng)5 d后，按照隨機體重對照表將小鼠隨機分成假手術組、模型組、BD1047組、鹽酸多奈哌齊組、癲癇清顆粒組、BD1047+癲癇清顆粒組，每組小鼠各16只。

1.2.2 造模? 350 mg/kg的水合氯醛麻醉小鼠后，固定，消毒。手術刀切開頭部皮膚，快速找到囟門位置，以囟門為零點，向右移動1 mm，后移動0.5 mm，垂直深度為3 mm。于5 min內(nèi)緩慢注入3 μl老化的Aβ25-35（1 mg Aβ25-35溶解到940 μl生理鹽水中，37℃孵育120 h）。取適量青霉素鈉粉末涂抹于傷口，小鼠放回籠中。

1.2.3 給藥? AD模型制備后的第2天，各組小鼠按照組別分別灌胃給予相應的藥物，癲癇清顆粒組（12.48 g/kg，按生藥量計，每克顆粒含有5.31 g生藥），鹽酸多奈哌齊組（1.3 mg/kg），小鼠的給藥劑量為20 ml/kg，同時，BD1047組腹腔注射給藥，劑量為1 mg/kg。灌胃及腹腔注射給藥均為21 d，每天1次。各組小鼠均無死亡且狀態(tài)良好。假手術組和模型組同時給予等體積蒸餾水進行灌胃，BD1047組和BD1047+癲癇清顆粒組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3觀察指標及評價標準

1.3.1 Morris水迷宮定位航行實驗? 灌胃給藥第16天，各組小鼠開始Morris 水迷宮行為學考察實驗。Morris 水迷宮為圓筒狀，底部直徑80 mm左右、高 33 cm左右，頂部開口，將圓筒劃分為4個象限中，并在桶壁上對4個象限區(qū)域進行標記。把平臺放置在第一象限固定的位置。圓筒內(nèi)水溫保持在24～27℃，平臺放置的位置應在水面1 cm以下。在實驗過程中，記錄小鼠從進入水中到成功登臺的總距離。每只小鼠每天需要進行兩次測試，每兩次中間間隔的時間 3～4 h，不間斷進行 5 d。

1.3.2 HE染色? 第22天，每組取6只小鼠，用4%的多聚甲醛將其腦組織固定，脫蠟脫水，將切片厚度切至為4～5 μm，用常規(guī)方法對切片進行HE染色。

1.3.3 免疫組化檢測NLRP1、caspase-1及免疫熒光檢測σ1R表達? 第22天，每組隨機選6只小鼠進行免疫組化檢測。5 μm的石蠟切片逐步進行脫蠟直至水化，經(jīng)過3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化酶后，高壓方式進行抗原決定簇的暴露，封閉液封閉，加入適當濃度的一抗，4℃孵育過夜。PBS沖洗，免疫熒光實驗加入相應的熒光二抗;免疫組化實驗加入生物素化二抗后，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進行染色，陽性結果表現(xiàn)為沉淀于細胞內(nèi)棕黃色的顆粒，各組陽性細胞平均光密度值采用JEOA801D形態(tài)學分析系統(tǒng)進行分析。

1.3.4 Western blot檢測NLRP1 及caspase-1表達? 第22天，每組取 4只小鼠快速斷頭，冰上分離出海馬，稱定質(zhì)量。海馬經(jīng)蛋白裂解液裂取后提取出總蛋白，BSA法測定出小鼠海馬組織中的蛋白濃度，灌制10%的凝膠進行電泳，100 mA，轉(zhuǎn)膜時間為2 h，5%的脫脂牛奶封閉，相應濃度的一抗孵育后，4℃放置過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBST）洗滌后加入對應的二抗孵育，再次洗滌后加入特超敏 ECL化學發(fā)光試劑盒，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察相關蛋白的表達。Imaje J圖像分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。水迷宮定位航行實驗的組內(nèi)不同時間比較，采用單因素重復測量方差分析;不同時間的組間比較采用多變量方差分析;組間指標變化趨勢比較及組別與時間交互作用分析采用雙因素重復測量方差分析。其余實驗指標均采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮定位航行實驗結果

水迷宮定位航行實驗雙因素重復測量方差分析結果顯示，組間F組別=98.613，P<0.001;時間F時間=96.522，P<0.001;交互作用F組別×時間=13.466，P<0.001，時間和組別有交互作用。見表1。

2.2 HE染色結果

與假手術組相比，模型組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列紊亂，可見細胞水腫，細胞核淡染，核固縮。與模型組相比，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列有序，錐體細胞排列緊密，神經(jīng)元細胞層數(shù)增加，部分神經(jīng)元細胞的神經(jīng)突觸出現(xiàn)恢復。BD1047組及BD1047+癲癇清顆粒12.48 mg/kg組可見神經(jīng)元細胞數(shù)目減少，排列疏松，核固縮較明顯。見封三圖1。

2.3 NLRP1和caspase-1免疫組化染色結果

與假手術組相比，模型組小鼠海馬區(qū)域NLRP1和caspase-1表達明顯增多;與模型組相比，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組海馬區(qū)域NLRP1和caspase-1陽性表達顯著降低;BD1047組和BD1047+癲癇清顆粒組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見封三圖2～3、表2。

2.4 σ1R表達結果

模型組小鼠海馬區(qū)σ1R表達下降;與模型組相比，癲癇清顆粒組小鼠海馬區(qū)域σ1R表達明顯增加，BD1047組明顯降低，BD1047+癲癇清顆粒組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見封三圖4。

2.5 Western blot實驗結果

與假手術組相比，模型組小鼠海馬NLRP1與caspase-1的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組相比，鹽酸多奈哌齊（1.3 mg/kg）組和癲癇清顆粒組小鼠腦內(nèi)NLRP1與caspase-1表達明顯降低，BD1047組明顯升高，BD1047+癲癇清顆粒組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1、表3。

3 討論

AD是一種破壞性神經(jīng)退行性疾病，其特征在于神經(jīng)元細胞的死亡和進行性癡呆的發(fā)生。目前的研究普遍認為，神經(jīng)元細胞外Aβ的沉積和細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結的形成是AD發(fā)病的主要機制，但導致神經(jīng)元功能異常的具體機制則尚不清楚。Martinon等[6]于2002年首次報道炎癥小體后，炎癥小體在AD中的作用引起學者們的廣泛關注。組成炎癥小體的受體蛋白大部分來自Nod樣受體家族，包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP7和NLRP12。其中NLRP1是首個報道的炎癥小體。NLRP1在機體內(nèi)的功能主要涉及細胞程序性死亡、慢性炎癥和免疫應答反應等多方面，是機體內(nèi)慢性炎癥的主要參與者[7-10]，并與AD神經(jīng)元功能異常密切相關。NLRP1為在細胞中表達的多蛋白復合物，由細胞內(nèi)模式識別受體及caspase-1前體蛋白組裝而成，受外源物質(zhì)刺激后，組裝后的炎癥小體可促使NLRP1發(fā)生自身寡聚化，激活 caspase-1，引發(fā)炎癥反應[4];因此，抑制炎癥小體的活化可改善AD神經(jīng)元細胞的功能異常，進而改善學習記憶障礙。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，NLRP1活化后，可形成NLRP1-caspase-1級聯(lián)反應通路，加速學習記憶損害[11-12]，使用NLRP1炎癥小體抑制劑則具有增強學習記憶能力的作用[2，3，13]。本研究結果表明，癲癇清顆?？山档秃ｑR中NLRP1的表達，抑制caspase-1活性，增加神經(jīng)元細胞數(shù)量，減少AD模型小鼠的游泳總路程，具有改善學習記憶障礙的作用。

σR最初歸類于阿片類受體的亞型，因其不能與阿片受體拮抗劑（如納洛酮）結合，這種觀點隨后得到了修正。隨著科學家們對σR受體的深入研究，人們對σR受體有了全新的認識和理解。σR存在兩種亞型：σ1R和σ2R。其中，σ1R有223個氨基酸，分子量為25.3 kDa，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個區(qū)域的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中均有表達，在細胞中分布于核膜、線粒體膜和質(zhì)膜區(qū)域，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)富集。σ1R參與調(diào)節(jié)與神經(jīng)退行性疾病相關的生物學機制，具有延緩記憶減退、神經(jīng)保護與再生的作用，近年來得到了廣泛關注。研究人員使用SA4503正電子發(fā)射斷層掃描技術對AD患者腦中的σ1R定位發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，AD患者腦內(nèi)σ1R密度顯著降低，激活σ1R則可改善學習記憶障礙[3]。

動物實驗表明，轉(zhuǎn)基因AD模型鼠腦中σ1R表達下降[16-17]，神經(jīng)元損傷，學習記憶功能障礙。σ1R作為一種具有配體選擇性的分子伴侶，可通過NF-κB途徑，誘導NLRP1活化[15]。由此可推測，增加σ1R的表達，可抑制NLRP1活化，保護神經(jīng)元，改善學習記憶能力。在本研究給予AD模型小鼠σ1R拮抗劑BD1047后發(fā)現(xiàn)，BD1047組中NLRP1與caspase-1表達增強，說明σ1R與AD模型中NLRP1炎癥小體活性有關。給予癲癇清顆粒后，σ1R表達增加，NLRP1與caspase-1活性降低，說明癲癇清顆?？赏ㄟ^σ1R抑制AD模型小鼠中的炎癥小體的活性，保護神經(jīng)元，改善其學習記憶能力，發(fā)揮抗AD作用。

[參考文獻]

[1] Baban S. Thawkar，Ginpreet Kaur.Inhibitors of NF-κB and P2X7/NLRP3/Caspase 1 pathway in microglia：Novel therapeutic opportunities in neuroinflammation induced early-stage Alzheimer′s disease[J].Journal of Neuroimmunology，2019，326（2018）：62-74.

[2] D'Angelo C，Costantini E，Salvador N，et al. nAChRs gene expression and neuroinflammation in APPswe/PS1dE9 transgenic mouse[J]. Scientific Reports，2021，11（1）：9711.

[3] Thiyagarajah MT，Herrmann N，Ruthirakuhan M，et al. Novel pharmacologic strategies for treating behavioral disturbances in Alzheimer's disease[J]. Current Behavioral Neuroence Reports，2019，6（4）：72-87.

[4] Lv YC，Gao AB，Yang J，et al. Long-term adenosine A1 receptor activation-induced sortilin expression promotes α-synuclein upregulation in dopaminergic neurons[J]. Neural Regeneration Research，2020，15（4）：712-723.

[5] Wang H，Wei GD，Cheng S，et al. Circulatory CD4-positive T-lymphocyte imbalance mediated by homocysteine-induced AIM2 and NLRP1 inflammasome upregulation and activation is associated with human abdominal aortic aneurysm[J]. Journal of Vascular Research，2020，57（5）：276-290.

[6] Martinon F，Burns K，Tschopp J. The inflammasome：A molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processingof proIL-beta[J]. Mol Cell，2002， 10（2）：417-426.

[7] Kim YK，Shin JS，Nahm MH. NOD-Like receptors in infection，immunity，and diseases[J]. Yonsei Med J，2016，57（1）：5-14.

[8] 李慶菊，潘韻錚，張琦，等.丹酚酸B調(diào)節(jié)SIRT1信號途徑抑制H2O2誘導的NLRP3炎癥小體激活[J].中藥新藥與臨床藥理，2021，32（5）：604-611.

[9] Yu CH，Moecking J，Geyer M，et al. Mechanisms of NLRP1-mediated autoinflammatory disease in humans and mice[J]. J Mol Biol，2017，430（2）：142-152.

[10] Feria MG，Andrea TN，Hernandez JC，et al. HIV replication is associated to inflammasomes activation，IL-1β，IL-18 and caspase-1 expression in GALT and peripheral blood[J]. PLoS One，2018，13（4）： e0192 845.

[11] Heneka MT，Kummer MP，Stutz A，et al.NLRP3 is activated in Alzheimer's disease and contributes to pathology in APP/PS1 mice[J]. Nature，2013，493（7434）：674-678.

[12] Zhang S，Huang SY，An XB，et al. Medical histories of control subjects influence the biomarker potential of plasma Aβ in Alzheimer's disease：A meta-analysis[J]. Journal of Molecular Neuroscience：MN，2020，70（6）：861-870.

[13] Heneka MT，Kummer MP，Latz E. Innate immune activation in neurodegenerative disease[J].Nat Rev Immunol，2014，14（7）：463-477.

[14] Ye JZ，Zeng B，Zhong M，et al.Scutellarin inhibits caspase-11 activation and pyroptosis in macrophages via regulating PKA signaling[J].Acta Pharmaceutica Sinica B，2021，11（1）：112-126.

[15] Wang L，Zhang Y，Wang CR，et al. A natural product with high affinity to sigma and 5-HT 7 receptors as novel therapeutic drug for negative and cognitive symptoms of schizophrenia[J]. Neurochemical Research，2019，44（11）：2536-2545.

[16] Plácido AI，Pereira CMF，Correira SC，et al. Phosphatase 2A inhibition affects endoplasmic reticulum and mitochondria homeostasis via cytoskeletal alterations in brain endothelial cells[J]. Molecular Neurobiology，2017，54（1）：154-168.

[17] 許方方，蔣淼.Cdk5/p25在APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬內(nèi)表達與認知功能障礙的關系[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2020，36（20）：3248-3251.

（收稿日期：2021-05-25）

3068501908211