林 焱，羅潤波，劉燕坤，朱偉云*

(1.國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室，南京農業(yè)大學消化道微生物研究室，南京 210095； 2.西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000)

仔豬腹瀉可導致仔豬發(fā)病率、死亡率提高，生長速度減緩等，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失。細菌感染，尤其是致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)感染，是引起仔豬腹瀉的主要原因之一[1]。我國已于2020年7月正式實施飼料禁抗，細菌性的腹瀉成為禁抗后最核心的問題，開發(fā)新型高效綠色的“替抗產品”成為畜牧業(yè)關注焦點。噬菌體作為一種可殺死細菌卻對真核細胞無害的病毒，被認為是具有較好前景的抗生素替代品[2-4]。根據(jù)噬菌體對宿主菌的裂解效應不同，將噬菌體分為烈性噬菌體和溶原性噬菌體[5]。烈性噬菌體可直接裂解宿主菌導致其死亡，而溶原性噬菌體大多數(shù)情況下會將其基因組整合到宿主菌的染色體上,并隨著宿主基因組的復制而復制，通常情況下并不裂解宿主菌[6]，因此臨床上僅用烈性噬菌體治療細菌性感染。噬菌體的宿主譜是決定其治療效果的重要因素[7]，然而1株噬菌體在感染不同細菌時感染能力可能存在差異[8-9]，僅測定宿主譜并不能全面說明噬菌體的應用潛力，需明確噬菌體在各株菌上的感染特性，才能更好地將噬菌體應用于治療。本研究測定了此前從斷奶前仔豬糞樣中分離得到的1株大腸桿菌噬菌體C6在致病性大腸桿菌上的宿主譜，并比較了該噬菌體在不同致病菌上的感染特性，為進一步開發(fā)噬菌體作為新型抗菌劑提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 噬菌體及菌株來源

試驗所用噬菌體為本實驗室此前在1頭健康仔豬斷奶前期的糞樣中分離得到的1株大腸桿菌噬菌體C6。

用于噬菌體宿主譜測定和感染特性分析的大腸桿菌菌株均為本實驗室此前從豬糞中分離得到的90株大腸桿菌(限于篇幅，請到OSID開放科學數(shù)據(jù)與內容查看詳細信息)，其中包括1株非致病性大腸桿菌(E.coli22)，6株產腸毒素大腸桿菌(ETEC 101、ETEC 102、ETEC 103、ETEC 104、ETEC 105和ETEC 106)，1株大腸桿菌O157(E.coliW1)，和2株 血清型為O157:H7的產志賀毒素大腸桿菌(STEC W3、STEC W5)，2株腸道致病性大腸桿菌(EPEC 143、EPEC 162)。菌株具體信息見表1。噬菌體C6是以E.coli22為宿主菌分離得到。

1.2 噬菌體電鏡形態(tài)觀察

雙層平板法擴增噬菌體后用10 mL SM液將平板上的噬菌體洗脫下，用0.22 μm濾器過濾除菌后，加入100 ku超濾管中,4 ℃，4 800g離心20 min，濃縮噬菌體液至500 μL，滴度為1010～1011pfu·mL-1。將噬菌體濃縮液滴在銅網上，作用15 min，從側面用濾紙吸干多余液體，加1滴2%磷鎢酸(PTA，pH7.2)于銅網，然后置于干燥濾紙上，自然干燥后，進行透射電鏡觀察。

1.3 基因組提取、全基因組測序和分析

首先按“1.2”介紹方法濃縮噬菌體至500 μL，加入DNase I 和RNaseA(購自TaKaRa，大連寶生物)至終濃度為1 μg·mL-1，37 ℃作用1 h。接著加入EDTA 至終濃度為20 mol·L-1，80 ℃作用8 min。然后參照《分子克隆實驗指南》提取噬菌體基因組[10]，最后將基因組送至上海凌恩生物科技有限公司進行全基因組測序，測序結果上傳至GenBank。

1.4 噬菌體熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性測定

取1 mL的效價為107pfu·mL-1的噬菌體，分別放置在30～70 ℃的水浴鍋中恒溫作用1 h，樣品水浴完成后迅速取出放置在冰塊中冷卻，使用雙層平板法測定不同溫度處理后的樣品中噬菌體效價。

取100 μL效價為108pfu·mL-1的噬菌體分別與900 μL的pH為2～13的SM緩沖液均勻混合，后置于37 ℃ 中恒溫水浴2 h，使用雙層平板法測定不同pH處理后的樣品中噬菌體效價。

1.5 噬菌體宿主譜測定

結合點滴法和雙層平板法測定噬菌體C6在90株 大腸桿菌上的宿主譜。點滴法：用無菌棉簽沾取處在對數(shù)生長期的細菌后均勻涂布于LB平板上，待干后，取5 μL噬菌體液滴在平板上，37 ℃孵育6 h后，若菌苔上出現(xiàn)透亮的空斑則判定噬菌體可裂解該菌。雙層平板法：以點滴檢測結果為陽性的菌作為宿主菌，用雙層平板法觀察成斑情況，出現(xiàn)噬菌斑的菌即視為可被裂解感染的細菌。同時觀察噬菌體C6在不同株菌上噬菌斑的形態(tài)。

1.6 噬菌體最佳感染復數(shù)測定

將噬菌體以感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)102∶1、10∶1、1、1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、 1∶105分別接種至處于對數(shù)期的各株大腸桿菌中，37 ℃培養(yǎng)4.5 h，得到噬菌體效價最高的MOI即為最佳MOI。

1.7 噬菌體成斑率測定

參照文獻[11]介紹的方法，以相同量噬菌體分別與各株大腸桿菌鋪雙層平板后統(tǒng)計噬菌斑數(shù)量，以在E.coli22上出現(xiàn)斑的數(shù)量為1，計算噬菌體在各株致病性大腸桿菌上的成斑率(efficiency of plating, EOP)。

1.8 噬菌體吸附率測定

將噬菌體分別與各株大腸桿菌以MOI=10-1接種于液體LB中，37 ℃孵育10 min后，4 000g離心5 min，棄上清，用液體LB重懸菌體后，測噬菌體數(shù)量。重懸后測得的噬菌體數(shù)量/初始接進去的噬菌體數(shù)量即為噬菌體吸附率。

1.9 噬菌體生長曲線測定

將噬菌體分別與各株大腸桿菌以MOI=1或MOI=10-2接種于液體LB中，其中菌的接種量均為107cfu·mL-1，噬菌體的接種量為107或105pfu·mL-1。 37 ℃孵育15 min后，4 000g離心5 min， 棄上清，用液體LB重懸菌體后置于37 ℃震蕩培養(yǎng)5 h，每小時取樣檢測噬菌體滴度，以感染時間為橫坐標，以噬菌體滴度的對數(shù)為縱坐標，繪制噬菌體的一步生長曲線。

1.10 噬菌體抑菌曲線測定

將噬菌體分別與各株致病性大腸桿菌以MOI= 10-4～102接種于液體LB后置于37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h，每小時檢測共孵育液在600 nm處的吸光值(OD600 nm)。同時設立陽性對照組，僅接種致病菌菌，每小時檢測OD600 nm。以時間為橫坐標，OD600 nm為縱坐標，繪制噬菌體在各株致病性大腸桿菌上的抑菌曲線。

2 結 果

2.1 噬菌體C6分類鑒定

電鏡結果(圖1A)顯示噬菌體C6為肌尾噬菌體，由頭部、頸部和尾部3部分組成，其頭部呈正二十面體形，長約95 nm，具有T4樣噬菌體形態(tài)特征。測序結果顯示噬菌體C6基因組全長169 529 bp，測序結果上傳至NCBI，登錄號為MW679410。比對結果顯示，與C6同源性高的噬菌體均為T4樣噬菌體?；蚪M上無基因比對到細菌基因組上，且其基因組注釋顯示無整合酶基因，故判定為烈性噬菌體。根據(jù)形態(tài)觀察并結合基因測序結果可推斷噬菌體C6屬于T4樣噬菌體屬。

2.2 噬菌體C6熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性結果顯示噬菌體C6在溫度為30～50 ℃時相對穩(wěn)定；60 ℃時噬菌體開始出現(xiàn)死亡，70 ℃時噬 菌體無法存活(圖1B)。

pH穩(wěn)定性結果顯示噬菌體C6在pH為4～11時相對穩(wěn)定，在pH為3的酸環(huán)境或pH為12的堿性環(huán)境開始出現(xiàn)死亡，到pH為2或pH為13的條件時，噬菌體無法存活(圖1C)。

2.3 噬菌體C6宿主譜

作者選取實驗室此前保存的90株大腸桿菌用于噬菌體C6宿主譜檢測。試驗結果表明，點滴法得到的宿主譜要廣于平板法(表1)。噬菌體C6可感染1株非致病性大腸桿菌(E.coli22)和4株致病性大腸桿菌，包括大腸桿菌O157(E.coliW1)、2株產志賀毒素大腸桿菌(STEC W3、STEC W5)和1株腸致病性大腸桿菌(EPEC 143)。

A.電鏡形態(tài)；B.熱穩(wěn)定性；C.酸堿穩(wěn)定性A. Electronmicrograph; B. Thermal stability; C. pH stability圖1 噬菌體C6的電鏡形態(tài)和穩(wěn)定性Fig.1 Electronmicrograph and stability of phage C6

2.4 噬菌體C6感染特性

噬菌斑結果(圖2A～E)顯示,噬菌體C6在E.coli22和E.coliW1上的噬菌斑均透亮，直徑為0.5～1.0 mm；在EPEC 143上的噬菌斑也較透亮，但直徑≤0.5 mm；在STEC W3和STEC W5上的噬菌斑則較淡，且均為針尖般大小，比較二者，C6在STEC W3上的噬菌斑更清晰一些。

最佳MOI結果顯示(表2)，噬菌體C6在E.coli22上的最佳MOI為10-3，在EPEC143、STEC W3 和STEC W5上的最佳MOI均需≥100。

成斑率EOP結果顯示(表2)，噬菌體C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143 3株菌間的成斑率均存在顯著差異(P<0.05)，且均顯著低于在E.coli22和E.coliW1上的成斑率(P<0.05)。C6在STEC W5上的成斑率最低，低至10-7。成斑率結果與噬菌斑大小呈顯著正相關關系。

吸附率結果顯示(表2)，噬菌體C6在E.coli22和E.coliW1兩株菌間的吸附率存在顯著差異，且均顯著高于在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143 3株菌上的吸附率。吸附率結果與最佳MOI呈負相關關系。

表2 大腸桿菌噬菌體C6在各株菌上的感染特性

根據(jù)最佳MOI的結果，作者選擇了在MOI=10-2(噬菌體接種量為105pfu·mL-1)時測噬菌體C6在E.coli22和E.coliW1上的生長曲線(圖3A)，以及在MOI=1(噬菌體接種量為107pfu·mL-1)時測C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的生長曲線(圖2B)。比較生長曲線上0時的噬菌體滴度可以發(fā)現(xiàn)雖然噬菌體初始接種量在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143比在E.coli22和E.coliW1上高了兩個數(shù)量級，但所測得的滴度仍較低，說明噬菌體吸附到E.coli22和E.coliW1的能力更強，這與吸附率結果一致。比較5 h后的噬菌體最終滴度，噬菌體在E.coli22和E.coliW1復制得到的子代滴度可達到109～1011pfu·mL-1，顯著高于在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的子代滴度(107～109pfu·mL-1)。進一步比較噬菌體在E.coli22和E.coliW1上的生長曲線，發(fā)現(xiàn)雖然噬菌體在E.coliW1上初始吸附的噬菌體少，但是5 h后，噬菌體在E.coliW1復制得到的子代噬菌體數(shù)量更多。比較噬菌體在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的生長曲線，發(fā)現(xiàn)C6在STEC W3產生最終子代噬菌體的滴度最高，在STEC W5上的生長速度最慢。

根據(jù)以上各項感染特性指標的結果，選擇MOI= 10-1～10-5測定了噬菌體C6在E.coliW1上的抑菌效力，選擇MOI=1～102測定了噬菌體C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的抑菌效力。

所標字母相異代表各處理組差異顯著(P<0.05)，字母相同代表各處理組差異不顯著(P≥0.05)Different letters denotes significant difference between the treatments(P<0.05), same letter denotes not significant difference between treatments(P≥0.05)圖3 噬菌體C6在各株菌上的生長曲線Fig.3 One-step growth curve of phage C6

結果顯示(圖4)，在各株菌上均是MOI越大抑菌效果越好，在E.coliW1上，MOI越小，噬菌體C6需要越長的時間發(fā)揮抑菌效力。即使在MOI=10-5時，C6在5 h后也能發(fā)揮顯著的抑制E.coliW1的生長。比較噬菌體C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的抑菌效力，C6在STEC W3上的抑菌效果最好。在STEC W5上，噬菌體C6在3 h后出現(xiàn)抑菌效果減弱的現(xiàn)象，細菌的數(shù)量開始逐漸增加。

A.W1;B.143;C.W3;D.W5。所標字母相異代表各處理組差異顯著(P<0.05)，字母相同代表各處理組差異不顯著(P≥0.05)A.W1;B.143;C.W3;D.W5.Different letters denotes significant difference between the treatments(P<0.05), same letter denotes not significant difference between treatments(P≥0.05)圖4 噬菌體C6在各株致病菌上的抑菌曲線Fig.4 Bacteriostatic curves of phage C6

3 討 論

本研究測定了實驗室此前分離得到的1株大腸桿菌噬菌體C6的生物學特性，發(fā)現(xiàn)噬菌體C6有較廣的致病菌宿主譜。試驗用了點滴法和雙層平板法檢測了噬菌體C6的宿主譜，發(fā)現(xiàn)點滴法得到的宿主譜廣于雙層平板法。為了排除是由于擴增噬菌體的細菌所分泌的大腸桿菌素導致被測細菌裂解而形成空斑，作者將用于擴增噬菌體的菌株單獨培養(yǎng)后，取菌液上清重復點滴試驗，并未觀測到空斑，說明點滴裂解效應確實由噬菌體產生。這與之前Khan Mirzaei和Nilsson[12]的研究結果一致。革蘭陰性菌的噬菌體通過點滴法可裂解細菌卻在雙層平板上無法形成空斑的主要原因有兩種：“l(fā)ysis from without”或者“abortive infection”[11,13]。噬菌體的宿主譜是決定其治療效果的重要因素[7]，而點滴法和雙層平板法是最常見的兩種檢測噬菌體宿主譜的方法，但是兩者結果的差異說明點滴法得到的宿主譜并不能完全表明噬菌體的感染譜。此外，本試驗結果表明即使噬菌體能感染裂解某些細菌，其抑菌能力也存在顯著差異，所以評價1株噬菌體是否具有應用潛力，不能簡單地看它是否具有較廣的宿主譜。

本研究測定了噬菌體C6在多株致病菌上的感染特性，綜合噬菌斑形態(tài)、最佳MOI、成斑率、吸附率、生長曲線和抑菌曲線，發(fā)現(xiàn)它們之間并不完全呈正相關關系。噬菌斑大小與成斑率呈顯著正相關，噬菌體的抑菌效果與噬菌體在該菌上的生長能力呈正相關，吸附率與最佳MOI呈顯著的負相關關系，吸附率與成斑率之間也無相關性，噬菌體的抑菌效果與噬菌斑大小無相關性。噬菌體C6在5株菌上的噬菌斑大小和成斑率大小均為E.coli22、E.coliW1>EPEC 143>STEC W3>STEC W5。

噬菌體C6在STEC W5在噬菌體與細菌共培養(yǎng)后期，細菌出現(xiàn)增殖的情況，推測是產生了耐受的突變菌，導致噬菌體C6抑菌效力減弱。這也是目前噬菌體治療細菌感染時最常見的問題[14]。細菌耐受噬菌體可以通過阻止細菌吸附[15]、感染流產[16]和CRISPR-Cas系統(tǒng)等多種途徑[17], STEC W5是通過哪種途徑產生了耐受還需后續(xù)進行更深入地研究確認。但是噬菌體通常也會產生新的突變來應對對細菌的耐受，噬菌體與細菌之間一直存在這種此消彼長，互相抵抗的共同進化的過程[18]。本試驗由于僅檢測了6 h的抑菌效果，未能觀察到噬菌體是否能針對耐受菌產生突變進而產生新一輪的抑菌效果。

細菌表面存在的噬菌體受體是影響噬菌體吸附的最關鍵因素[19]，從吸附率的結果可以看出，E.coli22、E.coliW1 以及 EPEC 143 3個菌株上的噬菌體受體結構可能有所不同。抑菌試驗結果表明，噬菌體C6在5株菌上均是MOI越大時抑菌效果越好，并非在最佳MOI時抑菌效果最好，這與此前其他學者的試驗結果一致[20-21]。

噬菌體C6是從健康斷奶前仔豬中分離得到，說明在豬腸道中天然存在著可裂解感染多株致病菌的噬菌體，這些噬菌體可能具有保護仔豬腸道抵抗致病菌侵襲的潛在作用，這對預防仔豬腹瀉的發(fā)生有著極其重要的意義。此前也有研究表明，內源性的噬菌體可為機體提供潛在的保護作用[22-23]。此外，噬菌體C6可以感染多株致病性大腸桿菌，且在各株致病菌上的感染特性存在差異，可作為較好的模型研究噬菌體與細菌間的互作關系，為進一步開發(fā)噬菌體作為新型抗菌劑提供研究基礎。

4 結 論

噬菌體C6為T4樣噬菌體，可感染多株致病性大腸桿菌，在不同致病菌上的感染特性存在差異，均能顯著抑制致病菌的生長。