席 靜，王月麗，鄧肖玉，楊 琴，李培東，張江偉，孫天浩，朱良全，易繼海*，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000； 2.人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，石河子 832000； 3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

布魯氏菌(Brucella)是引起布魯氏菌病的革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，分為光滑型和粗糙型[1-2]。布魯氏菌感染的靶細胞主要有巨噬細胞、樹突狀細胞與胎盤滋養(yǎng)層細胞等。雖然吞噬細胞能夠殺滅大部分病原菌，但仍有少量布魯氏菌具備逃避宿主免疫系統(tǒng)殺傷的長效機制，能夠在宿主免疫細胞內(nèi)長期生存，造成持續(xù)性感染[3-4]。在其感染機體過程中，誘導(dǎo)產(chǎn)生一些細胞因子，如TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12等，調(diào)節(jié)布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)的增殖[5]。巨噬細胞在各種因素誘導(dǎo)下出現(xiàn)表型、功能及形態(tài)的不同分化，即巨噬細胞的“極化”現(xiàn)象[6]。有研究表明未極化狀態(tài)的M0型巨噬細胞在IFN-γ的刺激下極化為具有促炎殺菌功能的M1型巨噬細胞(M1型)，促進TNF-α、IL-1β、IL-12等炎癥因子的產(chǎn)生，抑制細胞增殖同時伴隨抗原遞呈能力，細胞表面標(biāo)志因子有NOS2、CD86等；而M2型巨噬細胞(M2型)主要由細胞因子IL-4、IL-13誘導(dǎo)極化，介導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)等，細胞表面標(biāo)志因子有Arg1、CD206等[7-8]。M2型與胞內(nèi)病原體引起的持續(xù)感染密切相關(guān)[9-10]，通過釋放IL-10等抑炎因子，防止過度炎癥反應(yīng)損傷，有利于胞內(nèi)病原體的持續(xù)性感染[11]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞極化與臨床上很多相關(guān)疾病密切相關(guān)。研究表明在布魯氏菌急性和炎癥感染期間，INF-γ水平升高，布魯氏菌誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化[12]，相反，在慢性感染期間，布魯氏菌則誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化，從而延長布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)的存活。M2型的激活途徑主要由STAT6信號通路介導(dǎo)與控制[13-14]，STAT6是JAK-STAT信號通路的成員，位于細胞質(zhì)中的信號蛋白，參與調(diào)控多種因子誘導(dǎo)的細胞活化[15]。當(dāng)STAT6發(fā)生磷酸化，形成二聚體并轉(zhuǎn)移到細胞核，誘導(dǎo)其下游靶基因的Arg1、CD206表達[16-17]，從而調(diào)控巨噬細胞活化和代謝。然而布魯氏菌在胞內(nèi)長期存活機制和巨噬細胞對布魯氏菌的吞噬殺傷機制是否與巨噬細胞的極化有關(guān)現(xiàn)在仍不清楚，本研究采用布魯氏菌S2308和RB51株侵染小鼠巨噬細胞誘導(dǎo)其極化，檢測相關(guān)因子的表達和胞內(nèi)荷菌量，探討布魯氏菌感染巨噬細胞后對其極化的影響，揭示STAT6信號通路對布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)生存的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞 布魯氏菌光滑株S2308由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存，布魯氏菌粗糙型疫苗株RB51由石河子大學(xué)人畜共患病重點實驗室保存；小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 主要試劑 PE-CD206抗體(Biolegend)，PE-CD86抗體(Biolegend)；破膜劑(BD公司)，STAT6(EL900280-50)和p-STAT6(No.EL903063-100)抗體購自EterLife公司；STAT6抑制劑AS1517499(MCE公司)。IL-10、IL-12、IL-4、TNF-α ELISA 試劑盒(美國RD公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 提供的基因序列號：Omp22(AY484565.1)、STAT6 (U66575.1)、P65(NM_00904)、ARG1(NM_000045.2)、NOS2(MP201463)、IL-10(NM _010548)、IL-1β(NM_008361.4)、GAPDH(NM_001289726.1)。用Primer 5 軟件設(shè)計引物并送上海生工公司合成，引物序列如表1。

1.2.2 小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞的培養(yǎng) 將小鼠巨噬細胞RAW264.7復(fù)蘇，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱。隔天傳代繼續(xù)培養(yǎng)24 h，傳代至六孔板內(nèi)，次日侵染。

1.2.3 布魯氏菌侵染RAW264.7細胞 將活化的菌株根據(jù)細胞量和感染復(fù)數(shù)(MOI 100∶1)計算每孔所需菌量，進行比濁。將菌量稀釋至1×108鋪入六孔板內(nèi)，對照組加入PBS，孵育1 h。加入硫酸慶大霉素培養(yǎng)45 min。PBS洗絳后加入培養(yǎng)液，分別在4、8、12、24、48、72 h收取不同時間點上清液用于ELISA，每孔細胞使用Trizol裂解用于qRT-PCR。

表1 引物序列

1.2.4 qRT-PCR檢測M1/M2型巨噬細胞標(biāo)志因子mRNA的表達水平 布魯氏菌侵染細胞后4、8、12、24、48、72 h分別收集樣品，提取細胞總RNA及反轉(zhuǎn)錄，做實時熒光定量PCR，再采用相對定量2-ΔΔCt進行統(tǒng)計分析，檢測M1型因子p65、NOS2、IL-1β和M2型因子STAT6、ARG1、IL-10相對于GAPDH基因mRNA表達量。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測布魯氏菌感染下M1/M2細胞標(biāo)記分子 菌株侵染細胞分別在12和72 h 收集細胞，進行流式細胞術(shù)檢測M1型標(biāo)記分子CD86和M2型標(biāo)記分子CD206的表達變化。設(shè)置S2308-CD86、S2308-CD206、RB51-CD86、RB51-CD206、IgG2a不同的管，在每管加入相應(yīng)抗體，上機檢測。

1.2.6 MTT法檢測STAT6抑制劑AS1517499(AS)對巨噬細胞毒性的影響 使用對數(shù)生長期細胞并計數(shù)調(diào)整濃度，加入不同濃度STAT6抑制劑AS(1、2、4、8 μmol·L-1)與RAW164.7細胞共同孵育24 h，0.1% DMSO處理的細胞作為對照，經(jīng)MTT方法檢測細胞活性。

1.2.7 Western blot檢測STAT6的激活狀態(tài) 用布魯氏菌S2308、RB51分別侵染正常細胞和用AS預(yù)處理細胞，PBS作對照，提取細胞總蛋白，用BCA法檢測定濃度。將蛋白按4∶1加入蛋白上樣液，100 ℃ 10 min。然后進行SDS-PAGE電泳，再進行Western blot試驗，用凝膠成像儀拍照保存，檢測p-STAT6信號蛋白表達水平。

1.2.8 ELISA檢測布魯氏菌介導(dǎo)的M1/M2型細胞因子 將布魯氏菌S2308、RB51分別侵染正常細胞和AS預(yù)處理過的細胞，PBS處理作為對照組，分別在侵染8、24、48、72 h時吸取上清液，用TNF-α、IL-12、IL-4和IL-10的ELISA試劑盒檢測相應(yīng)細胞因子表達量變化。

1.2.9 CFU計數(shù)檢測STAT6對布魯氏菌胞內(nèi)生存的影響 M0細胞、IL-4誘導(dǎo)的M2型細胞和AS預(yù)處理后細胞，用布魯氏菌S2308、RB51按照感染復(fù)數(shù)(MOI 100:1)進行侵染，PBS作對照。分別在4、8、24、48、72 h時，裂解菌體，進行梯度稀釋。每管吸取100 μL，加入TSA內(nèi)，倒置孵育3 d，菌落計數(shù)并進行統(tǒng)計分析。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPASS.20分析數(shù)據(jù)顯著性差異，多組樣本間均數(shù)用方差分析，并用Graphpad Prism 5作圖。

2 結(jié) 果

2.1 布魯氏菌感染對M1/M2型巨噬細胞標(biāo)志因子mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果(圖1)顯示，相對于對照組，S2308在感染巨噬細胞8、12 h處顯著誘導(dǎo)p65、NOS2和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄表達(P<0.05)，72 h時表達下調(diào)；而STAT6、ARG1、IL-10在感染4、8、12 h處表達下調(diào)，72 h處顯著上調(diào)(P<0.05)。RB51在感染8、48 h處顯著誘導(dǎo)p65、NOS2和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄表達(P<0.05)，到72 h處表達下調(diào)；而STAT6、ARG1在感染4、8、12 h時與對照組差異較小，72 h時上調(diào)。

A～F. M1型因子mRNA相對表達量； G～L. M2型因子mRNA相對表達量。A～C、G～I.S2308；D～F，J～L.RB51。與對照組相比，*.P<0.05; **.P<0.01。下同A-F. mRNA relative expression level of M1 type factor; G-F. mRNA relative expression level of M2 type factor.A-C，G-I.S2308；D-F，J-L.RB51. Compared with control group, *.P<0.05; **.P<0.01.The same as below圖1 M1型巨噬細胞因子和M2型巨噬細胞因子mRNA相對表達量Fig.1 Relative mRNA expression levels of M1 type and M2 type macrophage cytokines

綜上所述，用S2308和RB51侵染細胞可不同程度誘導(dǎo)巨噬細胞M1型因子(P65、NOS2和IL-1β)與M2型因子(STAT6、ARG1、IL-10)的mRNA轉(zhuǎn)錄表達，且具有時間依賴性(圖1)。

2.2 流式檢測布魯氏菌介導(dǎo)的CD86和CD206分子表達

CD86：在感染12 h時顯著高于對照組，差異極顯著(P<0.01)，且S2308組熒光率最高，達到了83%。72 h時與對照組無顯著差異，但低于12 h時，差異極顯著(P<0.01)。

CD206：在感染12 h時，與對照無顯著差異，72 h 時，其熒光強度上升，S2308組熒光率最高，達到了47.7%(圖2、3)。

圖2 流式檢測布魯氏菌感染后CD86(A)和CD206(B)的表達Fig.2 The expression of CD86(A) and CD206(B) after Brucella infection

試驗組與對照組相比，**.P<0.01;12與72 h相比，##.P<0.01Compared with the control group, ** .P<0.01. Between 12 and 72 h, ##.P<0.01圖3 布魯氏菌感染細胞后CD86(A)和CD206(B)表達的柱狀圖Fig.3 Columnar images of CD86(A)and CD206(B)expression after Brucella infection

2.3 AS對巨噬細胞活性的影響

為了驗證STAT6抑制劑AS是否具有細胞毒性作用。加入不同濃度AS，使用MTT法檢測細胞存活率。當(dāng)AS濃度達到4 μmol·L-1時，細胞存活率下降到75%，而AS濃度達到8 μmol·L-1時，細胞存活率僅達52%，說明AS對細胞活性的抑制作用具有濃度依賴性，后續(xù)試驗加入抑制劑濃度采用1和2 μmol·L-1(圖4)。

2.4 AS對布魯氏菌介導(dǎo)的STAT6信號通路的阻斷

為了驗證布魯氏菌感染過程中AS對STAT6信號的阻斷效果，Western blot檢測P-STAT6的蛋白表達。結(jié)果顯示,相對于對照組，S2308菌株可激活STAT6，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；RB51菌株幾乎不能激活STAT6。加入AS后，可顯著抑制p-STAT6的表達，且在濃度為2 μmol·L-1時，極顯著抑制(P<0.01，圖5)。

試驗組與對照組相比，*. P<0.05Experimental group compared with control group,*.P<0.05圖4 抑制劑AS對細胞活性的抑制作用具有濃度依賴性Fig.4 The cell viability was inhibited by AS in a concentration-dependent manner in cells

A、B.Western blot檢測p-STAT6的表達情況；C、D.根據(jù)Western blot各條帶的灰度值制作的柱形圖；A、C.S2308；B、D.RB51。試驗組與對照組相比，**.P<0.01The expression of p-STAT6 was detected by Western blot; C，D.Histogram made based on the grayscale value of the strip in A，B.Western blot figure；A，C.S2308；B，D.RB51.Experimental group compared with control group,**.P<0.01圖5 AS對布魯氏菌介導(dǎo)的STAT6信號通路的影響Fig.5 Effect of AS on Brucella mediated STAT6 signaling pathway

2.5 AS阻斷STAT6對布魯氏菌介導(dǎo)的細胞因子的影響

M2型細胞因子IL-4和IL-10 在感染72 h時，S2308菌株極顯著(P<0.01)，而AS對布魯氏菌介導(dǎo)的IL-4和IL-10有抑制表達作用。M1型細胞因子TNF-α和IL-12的誘導(dǎo)在感染前期8和24 h 較為顯著，RB51菌株差異顯著(P<0.05)，S2308在8 h 差異極顯著(P<0.01)，而AS對布魯氏菌介導(dǎo)的TNF-α和IL-12具有促進表達作用(圖6)。

與對照組比較, *. P<0.05； **. P<0.01；各菌株處理組比較, #.P<0.05； ##.P<0.01The expression was compared with the control group, *. P<0.05； **. P<0.01；A comparison between the treatment groups of each strain, #.P<0.05； ##.P<0.01圖6 M1/M2型細胞因子表達量柱狀圖Fig.6 The histograms of expressions of M1/M2 cytokines

2.6 STAT6對布魯氏菌胞內(nèi)生存的影響

S2308感染后其胞內(nèi)菌存活也呈先降低后上升趨勢。下降至8 h達到最低值，回升至72 h達到最高值。S2308+IL-4組在感染8和72 h時高于S2308組。S2308+AS組在感染72 h時低于S2308組。RB51感染后細胞載菌量呈逐漸降低輕微回升趨勢，12 h降到最低。而RB51+IL-4組和RB51+AS組與RB51組無顯著差異(圖7)。

A. S2308；B. RB51；C. S2308和RB51的CFU比較。S2308+AS組和RB51+AS組分別與S2308和RB51差異顯著，*. P<0.05；S2308+AS組和RB51+AS組分別與S2308和RB51差異極顯著，**.P<0.01A. S2308; B. RB51; C. CFU comparison between S2308 and RB51. The S2308+AS group and RB51+AS group were significantly different from S2308 and RB51, *. P<0.05; The S2308+AS group and RB51+AS group were significantly different from S2308 and RB51, **.P<0.01圖7 布魯氏菌S2308、RB51在細胞中的存活能力(CFU計數(shù))Fig.7 The viability of Brucella S2308 and RB51 in cells (CFU counts)

3 討 論

布魯氏菌屬于兼性胞內(nèi)致病寄生菌，人與動物感染后引起免疫器官和生殖器官損傷，甚至引起機體慢性感染。而慢性感染機制主要是體現(xiàn)在它能隱匿于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來逃逸宿主免疫殺傷[18]。然而，布魯氏菌免疫逃逸機制至今仍然不清楚。巨噬細胞是布魯氏菌重要的宿主細胞，也是調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)的重要免疫細胞。巨噬細胞在受到病原入侵后可釋放Th1型和/或Th2型細胞因子，Th1型細胞因子(TNF-α、IL-12、INF-γ)主要介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，對消除宿主病原微生物起關(guān)鍵作用[19]。Th2型細胞因子(IL-4和IL-10)主要介導(dǎo)體液免疫，但也有利于一些細胞內(nèi)病原微生物的持續(xù)性感染[20]。

有研究表明，布魯氏菌感染可能通過巨噬細胞表面受體與其結(jié)合[21]，促使細胞極化為M1型來控制病原菌的入侵，而為了防止炎癥反應(yīng)過度，巨噬細胞通過機體內(nèi)誘導(dǎo)的細胞因子的不同，將其表型發(fā)生改變，促使M2型巨噬細胞的轉(zhuǎn)化來減輕炎癥[11，22]。巨噬細胞極化是微環(huán)境的改變或異物的侵入引起的宿主保護“現(xiàn)象”，而不同的極化狀態(tài)則是其參與疾病進展、調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)的重要機制[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌能夠直接影響巨噬細胞的極化狀態(tài)，在感染早期可促進巨噬細胞向M1型分化，后期則由M1型、M0型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，這與王月麗等[25-26]在巨噬細胞中報道的結(jié)果相似，但布魯氏菌是如何影響巨噬細胞極化需要進一步探究。

STAT6信號通路是影響M2型相關(guān)因子表達的重要轉(zhuǎn)錄分子，STAT6磷酸化的增強是促進M2型極化的重要因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2308能顯著激活STAT6信號通路，而RB51幾乎不激活該通路，這可能由于巨噬細胞的極化受病原菌不同毒力影響[27]。為了進一步探索布魯氏菌是否能夠通過STAT6介導(dǎo)的M2型極化來影響Th2型細胞因子的釋放與細菌胞內(nèi)生存。后續(xù)通過ELISA試驗發(fā)現(xiàn)加入AS在布魯氏菌感染后期可抑制M2型因子IL-4和IL-10的釋放，并促進M1型因子TNF-α和IL-12的釋放。IL-10是調(diào)節(jié)巨噬細胞功能的關(guān)鍵分子，缺失IL-10的小鼠，其脾和肝內(nèi)存活的細菌數(shù)會顯著下降，促炎細胞因子增加，器官病變嚴重[12]。IL-4是STAT6激活分子，參與組織修復(fù)，抑制炎癥反應(yīng)[28]，是胞內(nèi)致病菌建立慢性持續(xù)性感染的重要分子。為了進一步探究STAT6介導(dǎo)的M2型細胞因子是否可影響布魯氏菌胞內(nèi)繁殖，CFU試驗發(fā)現(xiàn)STAT6對布魯氏菌胞內(nèi)生存起促進作用，加入抑制劑可降低布魯氏菌的胞內(nèi)存活。結(jié)合以上結(jié)果和分析，本研究證實了布魯氏菌在感染后期可能通過STAT6促進M2型抑炎因子的釋放來抵抗宿主細胞的免疫殺傷。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)相對于S2308，RB51作為粗糙型菌株并不能有效通過STAT6信號通路介導(dǎo)的巨噬細胞激活來影響胞內(nèi)菌的存活，這可能由于RB51菌株LPS缺乏O鏈的緣故[1,29-30]，具體原因和機制未見報道，尚需進一步研究證實。

4 結(jié) 論

本研究證實布魯氏菌感染巨噬細胞前期能夠誘導(dǎo)M1型極化，而在感染后期誘導(dǎo)M2型極化并激活STAT6信號通路，從而促進布魯氏菌的胞內(nèi)生存。這將為闡述布魯氏菌胞內(nèi)存活機制提供新的研究方向和理論基礎(chǔ)。