王維夫，錢亞光,2，盧 萍*，何 珊,3*，杜 玲，李玉玲，高 峰

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022；2. 喀喇沁旗農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)能源站，赤峰 024400；3. 包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與麻醉學(xué)院，包頭 014040)

小花棘豆(Oxytropisglabra)為豆科棘豆屬多年生草本植物，主要生長在草原、荒漠草原以及荒漠區(qū)的低濕地[1]。國際上將含苦馬豆素(swainsonine, SW)的黃芪屬和棘豆屬植物統(tǒng)稱為瘋草，小花棘豆是內(nèi)蒙古最重要的瘋草，其生長周期均有毒，以漸進(jìn)形式引起牲畜慢性中毒，對草原畜牧業(yè)造成重大損失。SW陽離子構(gòu)型與甘露糖苷陽離子結(jié)構(gòu)十分相似，與甘露糖有高度親和性，在動物細(xì)胞中會競爭性抑制溶酶體酸性α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性，導(dǎo)致甘露糖積累，使蛋白質(zhì)合成、加工以及轉(zhuǎn)運(yùn)受到一系列影響，細(xì)胞內(nèi)部分低聚糖無法正常代謝而聚積，由此導(dǎo)致細(xì)胞變性空泡化，失去正常功能，嚴(yán)重時(shí)造成死亡。牲畜采食小花棘豆初期體重稍增加，繼續(xù)采食后出現(xiàn)身體消瘦，精神沉郁、易受驚嚇、四肢無力、反應(yīng)遲鈍、內(nèi)臟空泡化以及生殖機(jī)能嚴(yán)重受損等癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡[2-4]。

SW是一種次級代謝產(chǎn)物，最早由Colegate從灰苦馬豆(Sphaerophysasalsula)中分離純化。SW的分子式為C8H15NO3，相對分子質(zhì)量為173，熔點(diǎn)為144～145 ℃，純品呈白色針狀晶體，屬于吲哚里西啶類生物堿，在吲哚里西啶環(huán)1，2，8位3個(gè)C原子上各連1個(gè)羥基，化學(xué)名為1，2，8-三羥基吲哚里西啶[5]。SW在醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)可作為一種有潛力的抗腫瘤藥物，能抑制高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ，從而阻斷癌細(xì)胞的N-連接寡糖合成，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，增加癌細(xì)胞對天然免疫的敏感性[6]。

盧萍等[7-8]進(jìn)行了內(nèi)蒙古3種棘豆屬植物(O.glabra、O.aciphylla和O.racemusa)中SW相關(guān)因子的研究，發(fā)現(xiàn)僅小花棘豆(采自鄂爾多斯、巴彥淖爾和阿拉善地區(qū)的6個(gè)種群167株)含SW，檢測了單株植物SW水平，在植物總DNA中擴(kuò)增出真菌5.8S rDNA/ITS序列，部分植株分離出內(nèi)生真菌，擴(kuò)增了5.8S rDNA/ITS序列，經(jīng)微生物學(xué)研究和序列比對分析，在屬水平上鑒定該真菌為Embellisia，后修訂為Alternaria，有該內(nèi)生真菌的小花棘豆都含SW。后盧萍課題組繼續(xù)在內(nèi)蒙古西部采集8個(gè)種群135株小花棘豆，進(jìn)行相關(guān)研究，得到相同結(jié)論，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌產(chǎn)生了SW，提出小花棘豆SW毒性可能由Alternaria引起[9-11]。余永濤等[12-13]從甘肅棘豆、毛瓣棘豆、冰川棘豆中分離到Embellisia內(nèi)生真菌(修訂為Alternaria)，該真菌檢測到SW，在莖直黃芪分離了Alternaria內(nèi)生真菌，真菌中也檢測到SW。Martinez等[14]采集了不同地區(qū)的黃芪種群，提取單株SW，擴(kuò)增出AlternariasectionUndifilum內(nèi)生真菌并檢測到SW。

本研究在前期基礎(chǔ)上擴(kuò)大采樣量，從內(nèi)蒙古鄂爾多斯鄂托克前旗和烏審旗8個(gè)不同地理種群采集120株小花棘豆，測定單株植物SW水平，從單株植物中分離培養(yǎng)內(nèi)生真菌，進(jìn)一步深入研究小花棘豆SW毒性與內(nèi)生真菌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克前旗和烏審旗8個(gè)小花棘豆地理種群，進(jìn)行單株植物隨機(jī)采樣，采樣地概況見表1。每個(gè)地理種群采集15株左右小花棘豆健康個(gè)體，株間距50 m以上。將新鮮葉片置變色硅膠中迅速干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室以備DNA提取，將整株植株帶回烘干后，用于SW的提取、測定及內(nèi)生真菌分析。

表1 小花棘豆采樣地

1.2 儀器與試劑

儀器設(shè)備：Varian 450GC氣相色譜儀(美國瓦里安公司)、Hettic MIKRO22R臺式低溫高速離心機(jī)(北奧企業(yè)集團(tuán)有限公司)、WD-9405B水平搖床(北京六一儀器廠)、FZ102植物試樣粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、ZHJH-1109超凈工作臺(上海智誠分析儀器有限公司)、Tanon GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)(上海天能儀器廠)、050-810Tgradient48 PCR 擴(kuò)增儀(德國 Biometra-grandient 公司)、DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

試劑：甲基化-α-D-甘露糖苷(Sigma公司)、硅烷化試劑(三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷) (Sigma公司)、SW標(biāo)準(zhǔn)品(西北農(nóng)林科技大學(xué))、Dowex 50 WX8 50-100(H)陽離子交換樹脂(阿法埃莎天津化學(xué)有限公司)、2×TaqMaster Mix(南京博爾迪生物科技有限公司)、1 kb Plus DNA ladder(天根生化科技北京有限公司)，均為色譜純或分析純。

1.3 單株小花棘豆總DNA提取及其內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴(kuò)增

單株小花棘豆總DNA提?。篊TAB 法提取總DNA[15]，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)檢測。內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴(kuò)增：用真菌特異性引物P1/P2對其5.8S rDNA/ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P1為正向引物，序列為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；P2為反向引物，序列為5′- GTTCAGCGGGTATCCCTA-3′。

10 μL PCR反應(yīng)體系：3.5 μL 2×PCR master mix，總DNA模板10 ng，100 μmol·L-1引物各0.25 μL，用超純水補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，48 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，Tanon GIS-2010型凝膠成像系統(tǒng)檢測。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，所得結(jié)果序列進(jìn)行同源比對。

1.4 單株小花棘豆SW水平檢測SW提取

用電動粉碎機(jī)將已烘干的120株單株小花棘豆植物分別粉碎，使其通過直徑0.5 mm篩。準(zhǔn)確稱取0.2 g過篩單株植物粉末，利用乙酸-氯仿浸提，用Dowex 50 WX8 50-100(H)陽離子交換樹脂柱層析純化[7,9-11]。

SW的GC檢測：樣品中加50 μL吡啶溶液，加16 μL甲基化-α-D-甘露糖苷(100 μg·mL-1)作內(nèi)標(biāo)物，再加入50 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99∶1)混勻，置于干燥器中進(jìn)行30 min衍生化反應(yīng)后進(jìn)樣。用吡啶配制SW標(biāo)準(zhǔn)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值作橫坐標(biāo)，SW標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg·mL-1)作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算植株SW水平。氣相色譜條件：石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫210 ℃， 進(jìn)樣口溫度300 ℃，氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為280 ℃，高純氮載氣。測樣進(jìn)樣量1 μL， 流速1 mL·min-1，分流比50∶1。

1.5 小花棘豆內(nèi)生真菌的培養(yǎng)及其SW水平檢測

內(nèi)生真菌的培養(yǎng)：用60 ℃烘干的單株小花棘豆莖切段做外植體，在超凈工作臺內(nèi)將約1 cm外植體用70%乙醇浸泡30 s、20%次氯酸鈉溶液浸泡3 min， 用無菌雙蒸水清洗2次，后置滅菌濾紙上吸干，接種到1.5%水瓊脂培養(yǎng)基上，于25 ℃下培養(yǎng)。待外植體長出真菌菌絲體后，用接種環(huán)刮取菌絲體轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上分離單菌落。觀察菌落和菌絲體形態(tài)。

小花棘豆內(nèi)生真菌SW水平檢測：在超凈工作臺內(nèi)刮取培養(yǎng)45 d的真菌單菌落菌絲體，置于干燥器中干燥后，用研缽充分研磨至粉末狀，從中提取SW，水平檢測方法同“1.4”。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

SW水平兩種群間差異性比較采用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)；SW水平多種群間差異性比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用Bonferroni校正法。以P<0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 單株小花棘豆總DNA提取

部分小花棘豆單株植物總DNA提取電泳結(jié)果見圖1，DNA質(zhì)量較好，無降解。

2.2 內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴(kuò)增

110株小花棘豆均擴(kuò)增出真菌5.8S rDNA/ITS序列，部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。經(jīng)PCR產(chǎn)物測序分析，序列全長為517 bp，其中ITS1區(qū)1—199 bp、5.8S rDNA區(qū)200—369 bp、3 ITS2區(qū)370—517 bp，與課題組前期發(fā)表的結(jié)果相同，屬于Alternaria。

M. 1 kb plus DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～17. 小花棘豆DNA提取結(jié)果M. 1 kb plus DNA ladder；1-17. Results of DNA extraction from Oxytropis glabra圖1 部分小花棘豆總DNA提取結(jié)果Fig.1 The extraction results of total DNA from Oxytropis glabra

M. 1 kb plus DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7. 擴(kuò)增結(jié)果M. 1 kb plus DNA ladder；1-7. Amplification results圖2 部分小花棘豆植物中內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of 5.8S rDNA/ITS of endophytic fungi from Oxytropis glabra

2.3 單株小花棘豆SW水平檢測

SW標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，其中R2=0.999 7，方程線性良好。

圖3 SW標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of SW

2.4 單株小花棘豆SW水平

各樣品進(jìn)樣后均出現(xiàn)與SW標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時(shí)間的色譜峰，保留時(shí)間為4.4 min左右；內(nèi)標(biāo)物色譜峰保留時(shí)間為4.2 min左右，結(jié)果見圖4、5。

圖4 SW標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.4 GC map of standard SW

圖5 植株樣品SW氣相色譜測定圖Fig.5 GC map of SW from plant samples

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出小花棘豆待測植株樣品的SW水平和PCR擴(kuò)增結(jié)果見表2。120株小花棘豆中有111株測出SW，最高水平為369.05 μg·g-1，平均水平32.78 μg·g-1，未測出SW的9株擴(kuò)增出了真菌條帶，經(jīng)測序分析不屬于Alternaria。

鄂托克前旗有2個(gè)種群OTQ1和OTQ2，OTQ1的15株均測出SW，最低水平為OTQ1.13(0.10 μg·g-1)，最高水平為OTQ1.1(16.00 μg·g-1)，均值為4.15 μg·g-1；OTQ2的15株有13株測出SW，最高水平為OTQ2.6(21.80 μg·g-1)，均值為3.65 μg·g-1。獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)顯示，鄂托克前旗OTQ1和OTQ2種群SW水平種群間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.033，P=0.973)。

烏審旗有6個(gè)種群OW3至OW8。OW3的15株有8株測出SW，最高水平為OW3.14(92.40 μg·g-1)，均值為9.53 μg·g-1；OW4的15株均測出SW，最低水平為OW4.7(2.46 μg·g-1)，最高水平為OW4.2(139.12 μg·g-1)，均值為54.31 μg·g-1；OW5的15株均測出SW，其最低水平為OW5.1(0.50 μg·g-1)，最高水平為OW5.2(65.30 μg·g-1)，均值為14.51 μg·g-1； OW6的15株均測出SW，最低水平為OW6.1(5.54 μg·g-1)，最高水平為OW6.6(369.05 μg·g-1)，均值為80.94 μg·g-1；OW7的15株均測出SW，其中OW7.14為痕量，最高水平為OW7.9(89.57 μg·g-1)，均值為17.57 μg·g-1；OW8的15株均測出SW，最低水平為OW8.5(1.59 μg·g-1)， 最高水平為OW8.10(243.56 μg·g-1)，均值為77.57 μg·g-1。烏審旗6個(gè)種群檢測出SW的樣本進(jìn)行單因素方差分析顯示，SW水平與種群存在一定相關(guān)性(F=4.286，P=0.002)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Bonferroni校正的事后兩兩比較顯示，OW6與OW5、OW6與OW7、OW8與OW5各組間SW水平存在差異，前者分別高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示某些種群間SW水平可能存在一定差異性。

表2 小花棘豆單株SW水平及Alternaria真菌序列擴(kuò)增結(jié)果

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

2.5 小花棘豆內(nèi)生真菌

小花棘豆外植體于水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2周，周圍長出松散白色絨毛狀真菌菌絲體(圖6)，劃線培養(yǎng)得單株，真菌生長緩慢，呈現(xiàn)白色、圓形、隆起、邊緣整齊、輻射狀生長菌落，后來菌體分泌色素，菌落顏色逐漸加深，呈現(xiàn)灰色、深灰色或褐色至深褐色，有些菌落變?yōu)楹谏浔趁骖伾兓黠@(圖7)。

2.6 小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌SW水平

38株小花棘豆分離培養(yǎng)出Alternaria內(nèi)生真菌，分離純化其菌絲體中的SW，經(jīng)GC檢測結(jié)果顯示，各樣品均出現(xiàn)與SW標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時(shí)間色譜峰(圖8)，保留時(shí)間為4.4 min左右，內(nèi)標(biāo)色譜峰保留時(shí)間為4.2 min左右。

不同內(nèi)生真菌樣品SW水平在0.83～2 573.24 μg·g-1變化，見表3。其中A-OTQ1.2～ A-OTQ2.13 的14個(gè)樣品的SW水平均值為33.93 μg·g-1，最低水平為A-OTQ1.9(0.83 μg·g-1)，最高水平為A-OTQ1.10(287.09 μg·g-1)；A-OW3.2～A-OW8.14的24個(gè)樣品的SW水平均值為492.28 μg·g-1，最低水平為A-OW3.13(2.05 μg·g-1)，最高水平為A-OW7.8(2 573.24 μg·g-1)。

3 討 論

本研究在中國內(nèi)蒙古西部8個(gè)不同種群采集120株小花棘豆，單株SW水平為0.10～369.05 μg·g-1，均值為32.78 μg·g-1，分離培養(yǎng)出38株Alternaria內(nèi)生真菌，均檢測到SW，SW水平的均值為323.3 μg·g-1，范圍在0.83～2 573.24 μg·g-1，在種群內(nèi)和種群間有變化，與前期在其他種群中所得結(jié)論一致[7-11]，與Gardener等[16]、Braun等[17]A.mollisimus、O.lambertii和O.sericae的研究結(jié)果相似；內(nèi)生真菌菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、隆起，輻射狀生長，后菌體分泌黑褐色色素，菌落顏色變化由白色至淺灰色直至黑褐色，與盧萍等[7-11]、Simmons[18]、陳偉群[19]、Pryor等[20]、Braun等[17]對瘋草內(nèi)生真菌Embellisia(后修訂為Alternaria)的研究結(jié)果相同，測序所得內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列與Braun等[17]提交的相比有1個(gè)變異位點(diǎn)，位于5.8S rDNA區(qū)第227位(T→A)，一致度為99.8%，二者高度同源。

圖6 水瓊脂培養(yǎng)基上小花棘豆內(nèi)生真菌Fig.6 Endophytic fungi of Oxytropis glabra on the agar media

圖7 PDA培養(yǎng)基上的小花棘豆內(nèi)生真菌菌落Fig.7 Colonies of endophytic fungi from Oxytropis glabra on PDA media

圖8 Alternaria真菌SW標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.8 GC map of SW from Alternaria

Ralphs等[21]從黃芪屬(Astragalus)和棘豆屬(Oxytropis)中分離到內(nèi)生真菌Embellisia(后修訂為Alternaria)，檢測植株和內(nèi)生真菌SW水平，發(fā)現(xiàn)含SW植株與內(nèi)生真菌有相關(guān)性，認(rèn)為內(nèi)生真菌定殖宿主植株以及環(huán)境會影響宿主植株合成SW。在植物Astragalusoxyphysus和真菌Rhizotonialeguminicola的SW生物合成途徑中，哌啶酸是一種前體物[22-23]，深入研究內(nèi)生真菌如何在瘋草中合成SW及環(huán)境的影響很有必要。瘋草內(nèi)生真菌SW合成途徑處于賴氨酸代謝途徑的一個(gè)分支，尚有許多未解之謎，其合成途徑：α-氨基已二酸→α-氨基已二酸半醛→P6C→哌啶酸→SW或賴氨酸→酵母氨酸→P6C→哌啶酸→SW，酵母氨酸還原酶(Sac)是合成SW的關(guān)鍵酶之一[24-25](P6C途徑)，近年推測瘋草內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis中SW生物合成可能還有P2C途徑，其生物合成機(jī)制及代謝途徑尚不清楚，故對其進(jìn)行深入研究有重要理論意義，同時(shí)在控制宿主小花棘豆SW含量、保護(hù)草原生態(tài)環(huán)境等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[26]。課題組前期也克隆了A.oxytropisOW7.8的sac，構(gòu)建了sac敲除株M1，發(fā)現(xiàn)其SW水平低于野生株OW7.8，而賴氨酸的水平變化很小，OW7.8中sac表達(dá)量越高、SW水平也越高[27-30]；構(gòu)建了sac互補(bǔ)株 C1，其SW水平高于M1和W7.8，推測表達(dá)載體上的強(qiáng)啟動子驅(qū)動sac高表達(dá)，促進(jìn)了SW的合成[31]；探索了光照和培養(yǎng)基對A.oxytropis生長和苦馬豆素含量的影響[32]，綜述了真菌中苦馬豆素生物合成途徑的研究進(jìn)展[33]，進(jìn)行了OW7.8和 M1的轉(zhuǎn)錄組測序分析，注釋到45 634個(gè)差異表達(dá)基因，從中初步鑒定出41個(gè)可能與SW生物合成相關(guān)，推測SW合成涉及P6C和P2C兩條途徑[34]。

表3 體外培養(yǎng)的小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌SW水平

本研究通過比較分析不同小花棘豆種群SW及其內(nèi)生真菌關(guān)系，可為深入研究內(nèi)生真菌SW生物合成途徑與調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，另外，也可篩選高水平SW菌株應(yīng)用于醫(yī)藥和化工領(lǐng)域。將來課題組將繼續(xù)深入研究小花棘豆基因組中關(guān)鍵基因?qū)ζ浜铣蒘W及其前體物質(zhì)積累的作用，探究植物與內(nèi)生真菌如何互作合成SW，以及A.oxytropis的SW合成相關(guān)基因的克隆與功能研究。

4 結(jié) 論

內(nèi)蒙古8個(gè)種群120小花棘豆株中111株測出含SW。從38株小花棘豆分離培養(yǎng)出了內(nèi)生真菌，經(jīng)微生物學(xué)研究及5.8S rDNA/ITS序列比對分析，在屬水平上鑒定為Alternaria，該內(nèi)生真菌均合成了SW，含Alternaria內(nèi)生真菌的小花棘豆植株都檢測出了苦馬豆素。