韓雪姣，李 亮，占松鶴，段倩倩，崔麗榮，劉雪蘭，孫 裴，魏建忠，李 郁*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036； 2. 安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，合肥 230091)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病最主要的病原，同時(shí)也可造成人類感染并發(fā)病，給食品安全和公共衛(wèi)生帶來(lái)威脅。SS的致病機(jī)制復(fù)雜，眾多毒力因子在SS不同的致病階段發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。發(fā)病豬臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎或急性死亡等[1]。SS抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，臨床上使用的疫苗交叉保護(hù)力較弱。因此在實(shí)際生產(chǎn)中使用抗生素是對(duì)豬鏈球菌病進(jìn)行防控的主要手段，這也造成了SS對(duì)抗生素的耐藥性日趨增強(qiáng)。此外，形成生物被膜(bacterial biofilms，BF)是細(xì)菌或真菌為了適應(yīng)自然環(huán)境而采取的一種生存方式。相對(duì)于BF外的細(xì)菌，BF內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性要低很多，對(duì)于酸有更強(qiáng)的抵抗力且具有更強(qiáng)的抗饑餓能力[2]。已知SS也具有形成BF的能力，BF的形成不可避免地增強(qiáng)了SS對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性。

噬菌體是能夠感染細(xì)菌、放線菌、螺旋體、霉形體以及藍(lán)細(xì)菌等微生物的病毒，也稱為細(xì)菌病毒[3]。整合到細(xì)菌DNA上或以質(zhì)粒形式存在的噬菌體基因叫前噬菌體，含有前噬菌體的細(xì)菌稱為溶原菌。前噬菌體與細(xì)菌性病原的毒力關(guān)系緊密，其編碼多種毒力因子，并對(duì)溶原菌的環(huán)境適應(yīng)性和耐藥性具有一定影響。大腸桿菌O157：H7中由于存在兩個(gè)編碼志賀毒素的前噬菌體，而具備了產(chǎn)生志賀毒素的能力[4]。SS分離株SsUD由于整合了攜帶有四環(huán)素耐藥基因的前噬菌體，從而產(chǎn)生了對(duì)四環(huán)素的耐藥性[5]。此外，前噬菌體還具有調(diào)節(jié)BF形成的能力。在放線桿菌和糞腸球菌中，相比不含前噬菌體的菌株，前噬菌體存在的菌株具有更強(qiáng)的BF形成能力[6-7]。

本研究前期對(duì)199株分離自臨床發(fā)病豬的SS進(jìn)行了前噬菌體解旋酶基因和末端酶基因的鑒定，鑒定結(jié)果顯示199株SS分離株中前噬菌體陽(yáng)性菌有39株(解旋酶基因和末端酶基因均為陽(yáng)性的有31株，解旋酶基因陰性末端酶基因陽(yáng)性的有7株，解旋酶基因陽(yáng)性末端酶基因陰性的有1株)，其余160株為前噬菌體陰性菌。為了探究前噬菌體與SS毒力、環(huán)境適應(yīng)性、耐藥性及代謝活動(dòng)之間的關(guān)系，本研究以39株前噬菌體陽(yáng)性菌為試驗(yàn)菌株，依照單一變量原則，根據(jù)前噬菌體陽(yáng)性菌的血清型、毒力基因型、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)結(jié)果和溶血性等背景信息選取7株前噬菌體陰性菌為對(duì)照菌株，共計(jì)46株SS進(jìn)行研究。以期為SS 致病機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)，為探究前噬菌體對(duì)SS生理活動(dòng)及遺傳進(jìn)化的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 受試菌株

39株前噬菌體陽(yáng)性菌及7株前噬菌體陰性菌均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存，具體信息見表1。

1.2 質(zhì)控菌株

肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49619，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重18～22 g，6～8周齡清潔級(jí)雌性昆明小鼠購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.4 主要試劑

含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)、含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MHA)、MH肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自紹興天恒生物科技有限公司；小牛血清購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)和FastKing RT Kit(With gDNase)購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.5 藥敏紙片和抗生素粉劑

17種抗生素的藥敏紙片和10種抗生素粉劑購(gòu)于紹興天恒生物科技有限公司。

1.6 致病性試驗(yàn)

將39株前噬菌體陽(yáng)性菌和7株前噬菌體陰性菌進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)并調(diào)整菌液濃度為6.3×109CFU·mL-1。 試驗(yàn)組小鼠腹腔注射菌液(每組5只)， 0.3 mL·只-1。對(duì)照組小鼠注射等體積生理鹽水。觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

根據(jù)致病性試驗(yàn)結(jié)果，篩選出使小鼠死亡率≥80%的菌株，每株菌設(shè)置5個(gè)劑量組(108～1010CFU·mL-1)， 各劑量組配置10只小鼠，腹腔注射菌液，0.3 mL·只-1。另取10只小鼠注射等體積生理鹽水，作為陰性對(duì)照。攻毒后觀察7 d，采用累積法(Reed-Muench)計(jì)算菌株對(duì)小鼠的LD50。

1.7 組織荷菌數(shù)測(cè)定和組織病理學(xué)觀察

根據(jù)LD50測(cè)定結(jié)果，結(jié)合分離株的背景信息，選擇4株前噬菌體陽(yáng)性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21和BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)進(jìn)行組織荷菌數(shù)測(cè)定和組織病理學(xué)觀察。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射SS菌液，濃度為1/5LD50[8-10]，0.3 mL·只-1；陰性對(duì)照組注射等體積生理鹽水。攻毒36 h后每組取3只小鼠，采集不同臟器(肺、肝、脾、腎、心和腦)測(cè)定組織荷菌數(shù)。操作如下：將臟器置于1.5 mL研磨管中，稱重并記錄，按照一定比例加入滅菌PBS和磁珠，使用全自動(dòng)研磨儀進(jìn)行研磨。研磨液10倍遞增稀釋后取稀釋度為100、10-1、10-2的組織懸液均勻涂布于含5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)；每組另取2只小鼠，采集上述不同臟器常規(guī)制作組織切片，經(jīng)HE染色后觀察病理變化。

1.8 BF形成能力的測(cè)定

利用結(jié)晶紫染色法[11-12]測(cè)定39株前噬菌體陽(yáng)性菌和7株前噬菌體陰性菌的BF形成能力。判斷標(biāo)準(zhǔn)：將空白對(duì)照組平均OD600 nm值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差(s)，作為細(xì)菌BF形成的臨界值(ODc)，OD600 nm≤ODc判為無(wú)BF形成能力(-)，ODc4ODc判為BF形成能力強(qiáng)(3+)。最后根據(jù)測(cè)定結(jié)果挑選菌株通過(guò)掃描電鏡進(jìn)行BF形態(tài)觀察。

1.9 藥敏試驗(yàn)

1.9.1 紙片擴(kuò)散法(K-B法) 以肺炎鏈球菌ATCC49619為質(zhì)控菌株，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的K-B紙片法測(cè)定39株前噬菌體陽(yáng)性菌和7株前噬菌體陰性菌對(duì)9類17種常見抗生素的敏感性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照CLSI(2020)標(biāo)準(zhǔn)和藥敏紙片說(shuō)明書進(jìn)行判定。

1.9.2 微量肉湯稀釋法 參照CLSI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定4株前噬菌體陽(yáng)性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21和BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)對(duì)抗菌藥物的MIC并判斷菌株對(duì)各種藥物的敏感程度。

1.10 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證

對(duì)4株前噬菌體陽(yáng)性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21和BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)進(jìn)行培養(yǎng)，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行菌體采集，采集的菌體送至基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,并隨機(jī)選取部分差異表達(dá)基因設(shè)計(jì)引物，見表2。以16S rRNA為內(nèi)參基因，采用SYBR Green I法進(jìn)行mRNA表達(dá)量分析，每個(gè)基因做3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct處理。

表2 qPCR引物序列

1.11 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)的差異性統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)繪圖均使采用Graphpad.7.0軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié) 果

2.1 致病性試驗(yàn)

前噬菌體陽(yáng)性菌和陰性菌攻毒后，發(fā)病小鼠均表現(xiàn)出食欲不振、扎堆聚集、被毛粗亂、眼分泌物增多的癥狀，部分發(fā)病小鼠除出現(xiàn)上述臨床癥狀外，還在攻毒3 d左右出現(xiàn)神經(jīng)癥狀(轉(zhuǎn)圈，共濟(jì)失調(diào))。對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，可見大腦充血；肺出現(xiàn)出血點(diǎn)，腫大；肝明顯淤血，質(zhì)地易碎；脾腫大，邊緣鈍圓，有明顯淤血；腎充血腫大。空白對(duì)照組小鼠剖檢無(wú)異常變化。39株前噬菌體陽(yáng)性菌中對(duì)小鼠致死率為100%的有4株，占比10.2%；致死率為80%的有7株，占比17.9%；致死率≤60%的有28株，占比71.9%。7株前噬菌體陰性菌中對(duì)小鼠致死率為100%的有1株，占比14.3%；致死率為80%的有1株， 占比14.3%；致死率≤60%的有5株，占比71.4%。

選取使小鼠死亡率≥80%的11株前噬菌體陽(yáng)性菌和2株前噬菌體陰性菌測(cè)定LD50。前噬菌體陽(yáng)性菌BB15-4、HF10-1、HF13-24、FY13-4、HF13-32、LA16-2、HF09-2、HF13-21、BZ17-2、XC14-1和BZ10-3的LD50分別為8.4×108、1.07×109、1.53×109、1.56×109、1.66×109、1.76×109、1.81×109、1.84×109、2.09×109、2.24×109、和2.36×109CFU·只-1。前噬菌體陰性菌HF13-16和BB14-5的LD50分別為1.88×109和2.72×109CFU·只-1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，前噬菌體陽(yáng)性菌和陰性菌之間LD50差異不顯著(P>0.05)。

2.2 組織荷菌數(shù)測(cè)定及病理切片觀察

2.2.1 組織荷菌數(shù)測(cè)定 結(jié)果見表3。BB15-4(LD50為8.4×108CFU·只-1)攻毒組小鼠肺、肝、心中的載菌量顯著高于其余4株攻毒組(P<0.05)；BB15-4和FY13-4(LD50為1.56×109CFU·只-1)攻毒組小鼠腦組織中的載菌量均顯著高于其余3株攻毒組(P<0.05)；雖然BB15-4、FY13-4和HF13-21(LD50為1.84×109CFU·只-1)攻毒組在小鼠脾中的載菌量差異不顯著(P>0.05)，但BB15-4攻毒組的載菌量顯著高于BZ17-2(LD50為2.09×109CFU·只-1)和BB14-5(LD50為2.72×109CFU·只-1)攻毒組(P<0.05)。

表3 組織荷菌數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.2.2 病理變化 BB15-4攻毒后小鼠心肌纖維壞死，空泡變性；肝細(xì)胞固縮壞死；脾組織白髓區(qū)淋巴細(xì)胞稀疏，脾小結(jié)萎縮；肺泡壁增厚，輕微實(shí)質(zhì)化；腎間質(zhì)血管充血擴(kuò)張；腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列稀疏紊亂；心、肝、脾、腎和腦組織均可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見圖1。FY13-4攻毒后小鼠心肌纖維間隙增寬；脾組織白髓區(qū)淋巴細(xì)胞稀疏；肺組織可見支氣管淋巴結(jié)細(xì)胞；腎小球明顯萎縮，腎小管上皮細(xì)胞輕微疏松水腫；心、肝、脾和腦組織均可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見圖2。HF13-21攻毒后小鼠肝細(xì)胞水腫；少量腎小球明顯萎縮；心、肝、脾和腎組織均可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肺和腦組織基本正常。詳見圖3。BZ17-2攻毒后小鼠心肌纖維間質(zhì)充血擴(kuò)張；肝細(xì)胞輕微水腫；脾小結(jié)萎縮；腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列稀疏；肝、脾和腎組織均可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肺組織基本正常。詳見圖4。BB14-5攻毒后小鼠心肌組織僅心肌纖維間隙增寬；肝細(xì)胞輕微水腫；腦組織血管輕微充血擴(kuò)張；脾和腎組織少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肺組織基本正常。詳見圖5。陰性對(duì)照組小鼠各臟器結(jié)構(gòu)正常，詳見圖6。

A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.腎；F.腦。下同A. Heart; B. Liver; C. Spleen; D. Lung; E. Kidney; F. Brain. The same as below圖1 BB15-4組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.1 Histopathological changes of mice in BB15-4 group (HE staining, 200×)

圖2 FY13-4組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.2 Histopathological changes of mice in FY13-4 group (HE staining, 200×)

圖3 HF13-21組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.3 Histopathological changes of mice in HF13-21 group (HE staining, 200×)

圖4 BZ17-2組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.4 Histopathological changes of mice in BZ17-2 group (HE staining, 200×)

圖5 BB14-5組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.5 Histopathological changes of mice in BB14-5 group (HE staining, 200×)

圖6 陰性對(duì)照組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.6 Histopathological changes of mice in negative control group (HE staining, 200×)

2.3 BF形成能力的測(cè)定結(jié)果

39株前噬菌體陽(yáng)性菌BF形成陽(yáng)性率為97.4%(38/39)，其中，成膜力強(qiáng)(3+)的15株，占比38.4%；成膜力中等(2+)的14株，占比35.8%；成膜力弱(1+)的9株，占比23.0%；陰性(-)的1株，占比2.5%。7株前噬菌體陰性菌BF形成陽(yáng)性率為100%，其中成膜力強(qiáng)(3+)的5株，占比71.4%；成膜力中等(2+)的株2株，占比28.5%。選取成膜力強(qiáng)(3+)的HF13-11和陰性(-)的HN16-1，通過(guò)掃描電鏡進(jìn)行BF形態(tài)觀察，見圖7。HF13-11(3+)為球型，菌體周圍充滿黏液等分泌物并將其相互粘連，形成致密的立體結(jié)構(gòu)，幾乎覆蓋整個(gè)爬片。HN16-1(-)呈橢圓形，菌體周圍無(wú)黏液等分泌物存在，密度小，在爬片上呈短鏈或散在分布。

A. HF13-11 (3+); B. HN16-1 (-)圖7 掃描電鏡下SS的BF(6 000×)Fig.7 SS biofilm under scanning electron microscope(6 000×)

2.4 藥敏試驗(yàn)

K-B法結(jié)果顯示，39株前噬菌體陽(yáng)性菌和7株前噬菌體陰性菌對(duì)萬(wàn)古霉素、頭孢吡肟、氨芐西林的敏感率均高，其次為氧氟沙星；對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、阿奇霉素的耐藥率均高，其次為頭孢曲松和多西環(huán)素，見表4。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果(K-B法)

微量肉湯稀釋法測(cè)定10種抗生素對(duì)前噬菌體陽(yáng)性菌BB15-4、FY13-4、HF13-21、BZ17-2和前噬菌體陰性菌BB14-5的MIC，與K-B法的結(jié)果整體一致?？咕幬锏腗IC值及菌株的敏感性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。

表5 抗菌藥物的MIC值及菌株敏感性統(tǒng)計(jì)表

前噬菌體陽(yáng)性菌和陰性菌的多重耐藥情況統(tǒng)計(jì)見表6。39株前噬菌體陽(yáng)性菌中92.3%呈現(xiàn)多重耐藥，其中3重耐藥13株，占比33.3%；4重耐藥4株，占比10.3%；5重耐藥8株，占比20.5%；6重耐藥7株，占比17.9%；7重耐藥4株，占比10.3%。7株前噬菌體陰性菌均為多重耐藥，其中3、4、6和8重耐藥各1株，均占比14.3%；5重耐藥3株，占比42.8%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，前噬菌體陽(yáng)性菌與陰性菌之間在耐藥性方面無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 前噬菌體陽(yáng)性菌和前噬菌體陰性菌耐藥情況統(tǒng)計(jì)表

2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證

2.5.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果 將5株SS株(BB15-4、FY13-4、HF13-21、BZ17-2、BB14-5)分為3個(gè)比較組進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。比較組AvsC中，A組為前噬菌體陽(yáng)性組，由前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陽(yáng)性的BB15-4、FY13-4、BZ17-2和僅前噬菌體末端酶基因?yàn)殛?yáng)性的HF13-21組成；C組為前噬菌體陰性組，由前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陰性的BB14-5組成。比較組A1vsC1中，A1組由前噬菌體解旋酶基因和末端酶基因均為陽(yáng)性的BB15-4、FY13-4和BZ17-2組成；C1組由前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陰性的BB14-5組成。比較組HF13-21vsBB14-5中，HF13-21為前噬菌體解旋酶基因陰性末端酶基因陽(yáng)性的SS分離株，BB14-5為前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陰性的SS分離株。

比較組AvsC中共有930個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，見圖8。從中篩選出18個(gè)毒力相關(guān)基因、4個(gè)BF形成相關(guān)基因、5個(gè)耐藥基因。相較于A組，C組中毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、cpsE、cpsB、msmK和gtfA為上調(diào)表達(dá)，divIVA、ppc、ldh、nox、sodA、oatA和tig為下調(diào)表達(dá)；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_1279和SSUBM407_1791為上調(diào)表達(dá)，SSUBM407_0297 和SSUBM407_0343為下調(diào)表達(dá)；耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293 均為上調(diào)表達(dá)。

比較組A1vsC1中共有951個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，見圖8。從中篩選出19個(gè)毒力相關(guān)基因、5個(gè)BF形成相關(guān)基因、5個(gè)耐藥基因。相較于A1組，C1組中毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、cpsE、cpsB、msmK和gtfA為上調(diào)表達(dá)，divIVA、ldh、nox、sodA、tig、spxA2、fba和codY為下調(diào)表達(dá)；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_1279、SSUBM407_1342和SSUBM407_1791為上調(diào)表達(dá)，SSUBM407_0297和SSUBM407_0343為下調(diào)表達(dá)；耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293均為上調(diào)表達(dá)。

比較組HF13-21vsBB14-5中共有1 151個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，見圖8。從中篩選出19個(gè)毒力相關(guān)基因、5個(gè)BF形成相關(guān)基因、6個(gè)耐藥基因。相較于HF13-21，BB14-5中毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、codY、cpsE、cpsB、msmK、tig和gtfA為上調(diào)表達(dá)，ldh、ppc、nox、fba、feoB和gdh為下調(diào)表達(dá)；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_0908、SSUBM407_1279和SSUBM407_1791為上調(diào)表達(dá)，SSUBM407_1342和SSUBM407_1520為下調(diào)表達(dá)；耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293為上調(diào)表達(dá)，pmrA為下調(diào)表達(dá)。

圖8 差異基因統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig.8 Statistical histogram of differential genes

此外，3個(gè)比較組的測(cè)序結(jié)果均顯示相較于前噬菌體陽(yáng)性菌，脂肪酸生物合成通路中所涉及到的相關(guān)基因SSUBM407_1477、SSUBM407_1676、SSUBM407_1680、SSUBM407_1672、SSUBM407_1670、SSUBM407_1671、SSUBM407_1674、SSUBM407以及精氨酸和脯氨酸代謝通路中所涉及到的相關(guān)基因SSUBM407_1304、SSUBM407_1303、SSUBM407_0427、SSUBM407_0274在前噬菌體陰性菌中均為上調(diào)表達(dá)。

2.5.2 qPCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，本研究以16S rRNA為內(nèi)參基因，隨機(jī)選取差異表達(dá)基因，進(jìn)行qPCR檢測(cè),見圖9。試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨機(jī)篩選出的差異表達(dá)基因在qPCR和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中變化趨勢(shì)基本一致，表明測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠。

3 討 論

前噬菌體與細(xì)菌病原體的毒力關(guān)系緊密，許多病原菌的毒力因子都是由前噬菌體編碼的。在霍亂弧菌中引起嚴(yán)重腹瀉的霍亂毒素即由前噬菌體中的ctxAB基因編碼[13]。本研究針對(duì)39株SS前噬菌體陽(yáng)性菌及7株前噬菌體陰性菌，通過(guò)致病性試驗(yàn)篩選出11株前噬菌體陽(yáng)性菌和2株前噬菌體陰性菌，對(duì)小鼠的LD50測(cè)定結(jié)果之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。以此為基礎(chǔ)，選擇4株前噬菌體陽(yáng)性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21、BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)進(jìn)行組織荷菌數(shù)測(cè)定及病理組織學(xué)觀察，其LD50值由小到大依次為BB15-4

細(xì)菌為了適應(yīng)周圍環(huán)境會(huì)吸附于異物或組織表面，分泌大量的胞外聚合物形成BF，從而具有抵御不良環(huán)境和抗菌藥物的能力。在放線桿菌和糞腸球菌中前噬菌體可以通過(guò)調(diào)節(jié)BF的形成，來(lái)增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)不良環(huán)境的抵抗力[6-7]。Wang等[14]對(duì)大腸桿菌K-12的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，前噬菌體e14可以促進(jìn)宿主菌早期BF的形成。而杜寶中等[15]的研究結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌中的前噬菌體可通過(guò)降低該菌中藻酸鹽合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響B(tài)F的形成。本研究結(jié)果表明，39株前噬菌體陽(yáng)性菌BF形成陽(yáng)性率為97.4%，7株前噬菌體陰性菌BF形成陽(yáng)性率為100.0%。39株前噬菌體陽(yáng)性菌中23.0%的成膜力弱(1+)，而7株前噬菌體陰性菌均具備強(qiáng)(3+) 或中等(2+)的成膜能力。結(jié)果表明前噬菌體的存在與否與SS能否形成BF以及成膜能力之間沒(méi)有呈現(xiàn)出相關(guān)性。

前噬菌體是細(xì)菌間基因水平轉(zhuǎn)移的重要載體，Matos等[16]的研究表明,前噬菌體誘導(dǎo)的基因整合事件使白喉棒狀桿菌獲得對(duì)自身進(jìn)化有用的DNA序列，增強(qiáng)了白喉棒狀桿菌的致病性和耐藥性；糞腸球菌致病株V583基因組中的多個(gè)前噬菌體對(duì)該菌的致病性和耐藥性有重要貢獻(xiàn)，促進(jìn)了V583對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性并導(dǎo)致了人類心內(nèi)膜炎。彭子欣等[17]的研究表明前噬菌體Prophage-p存在于希拉腸球菌R17的質(zhì)粒中，并攜帶有紅霉素和桿菌肽耐藥基因，對(duì)R17向耐藥菌的進(jìn)化發(fā)揮了重要作用。本研究的39株前噬菌體陽(yáng)性菌中92.3%呈現(xiàn)多重耐藥，而7株前噬菌體陰性菌均為多重耐藥。前噬菌體陰性菌均可耐受3種及以上的抗生素，而前噬菌體陽(yáng)性菌中存在僅耐受1種和2種抗生素的菌株。從表型上看，前噬菌體陰性菌比前噬菌體陽(yáng)性菌更具有耐藥性，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，兩者之間在耐藥性方面沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

為進(jìn)一步了解前噬菌體陽(yáng)性菌和陰性菌間相關(guān)基因的表達(dá)差異，本研究對(duì)4株前噬菌體陽(yáng)性菌和1株前噬菌體陰性菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。3個(gè)比較組的測(cè)序結(jié)果均表明，相較于前噬菌體陽(yáng)性菌，毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、cpsE、cpsB、msmK和gtfA在前噬菌體陰性菌中均為上調(diào)表達(dá)；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_1279和SSUBM407_1791、耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293在前噬菌體陰性菌中均為上調(diào)表達(dá)。此外，脂肪酸生物合成通路中所涉及到的相關(guān)基因以及精氨酸和脯氨酸代謝通路中所涉及到的相關(guān)基因在前噬菌體陰性菌中同樣均為上調(diào)表達(dá)，這表明前噬菌體陰性菌具有更高的脂肪酸和氨基酸代謝水平。脂肪酸的生物合成是生命體重要的基礎(chǔ)代謝途徑，對(duì)于磷脂合成、細(xì)胞膜組裝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量?jī)?chǔ)存和基因表達(dá)調(diào)控必不可少，抑制脂肪酸的生物合成將導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)及繁殖的停滯。氨基酸作為微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)和許多生物活性分子的合成，調(diào)節(jié)體內(nèi)信號(hào)通路和機(jī)體代謝。由此可見，前噬菌體的存在會(huì)影響SS的生理代謝，具體表現(xiàn)為脂肪酸和氨基酸代謝水平的下降。關(guān)于前噬菌體的存在對(duì)宿主菌相關(guān)基因及其代謝的影響研究報(bào)道有限，Veses-Garcia等[18]在大腸桿菌研究中通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，stx前噬菌體使宿主菌中與三羧酸循環(huán)和細(xì)菌有氧呼吸過(guò)程相關(guān)的基因下調(diào)表達(dá)，從而使宿主菌丙酮酸和能量代謝受到抑制。目前針對(duì)SS的研究則側(cè)重于噬菌體對(duì)細(xì)菌的裂解作用，而基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究前噬菌體與SS毒力、環(huán)境適應(yīng)性、耐藥性以及代謝活動(dòng)之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。

作為外源DNA，前噬菌體的插入給細(xì)菌帶來(lái)了額外的代謝負(fù)擔(dān)；同時(shí)功能性前噬菌體一旦受到特定因素的誘導(dǎo)，就會(huì)使細(xì)菌面臨被裂解死亡的危險(xiǎn)。因此，前噬菌體需要具有一些選擇價(jià)值，才能在細(xì)菌基因組中被更好的保留下來(lái)，這些選擇價(jià)值包括細(xì)菌基因組中前噬菌體的存在，可以阻礙其他噬菌體對(duì)細(xì)菌的感染，使細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)噬菌體的免疫；提高細(xì)菌對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性或增強(qiáng)其毒力。本研究試驗(yàn)結(jié)果表明，前噬菌體的存在并沒(méi)有給SS提供毒力、耐藥性和形成BF等方面的優(yōu)勢(shì)，這并不能說(shuō)明在SS中，前噬菌體只具有阻礙其他噬菌體感染，使SS產(chǎn)生對(duì)噬菌體的免疫這一個(gè)選擇優(yōu)勢(shì)。因?yàn)楸狙芯渴菍?duì)前噬菌體陽(yáng)性菌株及前噬菌體陰性菌株進(jìn)行分析，并不針對(duì)某一株SS或某一個(gè)SS前噬菌體。在對(duì)SS前噬菌體進(jìn)行研究的過(guò)程中，Harel等[19]發(fā)現(xiàn)許多SS強(qiáng)毒株特有的基因與前噬菌體中的一些基因存在同源性；Palmieri等[5]發(fā)現(xiàn)一個(gè)攜帶有四環(huán)素耐藥基因的前噬菌體樣元件，導(dǎo)致了SS分離株SsUD對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性；杜德超[20]發(fā)現(xiàn)SS弱毒株中擁有更多的前噬菌體序列，并提出前噬菌體序列的插入將會(huì)阻礙SS原有致病性元件發(fā)揮正常功能；虞莉等[21]通過(guò)檢測(cè)前噬菌體在101株SS2中的分布，發(fā)現(xiàn)前噬菌體與SS代表性毒力因子的分布沒(méi)有明顯相關(guān)性?；诒狙芯康慕Y(jié)果結(jié)合SS中有關(guān)前噬菌體的報(bào)道，作者發(fā)現(xiàn)在SS中，前噬菌體的存在不是判斷菌株毒力強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)，那些序列中存在毒力基因或耐藥基因的前噬菌體整合到SS基因組后可以增強(qiáng)SS的毒力或耐藥性，但并非所有的前噬菌體序列中都存在這些毒力相關(guān)基因或耐藥基因，所以并非所有的前噬菌體都可以增強(qiáng)SS的毒力或耐藥性。在環(huán)境適應(yīng)性方面，本研究結(jié)果僅表明前噬菌體不通過(guò)促進(jìn)SS形成BF這種方式提高SS對(duì)不良環(huán)境的抵抗力。至于前噬菌體是否可以通過(guò)提高SS對(duì)酸、堿和低溫等不良因素的抗性，進(jìn)而促進(jìn)SS對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

前噬菌體存在與否與SS的毒力增強(qiáng)或減弱、耐藥性的高或低以及BF的形成能力之間未有明顯相關(guān)性；前噬菌體的存在會(huì)引致與SS脂肪酸生物合成以及精氨酸和脯氨酸代謝過(guò)程中相關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)下調(diào)，從而造成脂肪酸和氨基酸代謝水平降低。