付 強，岳巧嫻，錫建中，宋鵬琰，陳曉勇，周榮艷

(河北農業(yè)大學動物科技學院，保定 071001)

綿羊產羔數的遺傳力較低[1]，易受環(huán)境、季節(jié)、營養(yǎng)等條件影響[2]。卵泡的生長、發(fā)育與綿羊產羔數密切相關，即當綿羊排卵率上升時產羔數增加[3]。顆粒細胞為哺乳動物卵泡的發(fā)育、成熟提供物質保障[4]。miRNA是由18～24個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA分子，通過堿基互補配對的方式作用于靶基因，進而降解mRNA或阻礙其翻譯，在調控卵泡發(fā)育、閉鎖和顆粒細胞凋亡過程中發(fā)揮作用[5]。

FOXO4屬于FOXO家族成員，此家族成員在生物體中參與的調節(jié)通路基本相同，F(xiàn)OXO4參與了機體的糖脂代謝過程，體內高表達FOXO4的小鼠，糖異生受到抑制[6]，細胞中膽固醇的合成量減少、葡萄糖的攝入量增加[7]，經營養(yǎng)物質和胰島素等多因素刺激后，誘導FOXO4乙?；蛊浠罨? 促進細胞凋亡[8-9]。FOXO4參與了能量代謝過程，在生物體代謝穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用，調節(jié)細胞周期，廣泛影響細胞的生理過程[10]。

顆粒細胞凋亡作為細胞自主發(fā)生的模式[11-12]，在卵泡發(fā)育過程中扮演著重要角色。卵泡發(fā)育、成熟過程中，顆粒細胞凋亡則通常被認為是引起卵泡閉鎖的“誘因”[13]。miRNA調控動物卵泡顆粒細胞凋亡[14]。綿羊miR-150通過靶向STAR基因，抑制孕酮合成相關基因表達減少孕酮合成，促進體外顆粒細胞的凋亡，抑制其增殖[15]。miR-26b通過靶向SMAD4基因促進卵泡顆粒細胞凋亡[16]。miR-181a-5p通過靶向SIRT1抑制鵝顆粒細胞凋亡[17]。近年來研究表明，miRNAs在動物卵泡顆粒細胞凋亡過程中發(fā)揮著非常重要的調控作用。

本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH顯著降低了綿羊卵泡顆粒細胞oar-miR-127和FOXO4的表達水平，細胞凋亡相關基因表達水平上升。根據生物信息學分析結果，推測oar-miR-127可能靶向FOXO4基因，且在細胞凋亡調控過程中發(fā)揮作用，目前oar-miR-127在綿羊顆粒細胞中的研究未見報道，本研究擬明確oar-miR-127對綿羊顆粒細胞凋亡的影響及其與靶基因FOXO4之間的互作關系，為闡明其在綿羊卵泡發(fā)育過程中的調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 綿羊卵泡顆粒細胞分離培養(yǎng)及293T細胞培養(yǎng)

將復蘇后的293T細胞(購自中國醫(yī)學科學院)，轉移到含有2 mL DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗)的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。

采集綿羊卵巢，去除卵巢周圍多余的脂肪，割開卵泡皮質層后將液體收集于離心管中，1 000 r·min-1離心10 min，去上清，重復3次。加入適量DMEM/F12完全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.1%丙酮酸鈉+1%雙抗)，吹打混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 引物設計

以綿羊FOXO4、Casp3和Bax基因為模板設計qRT-PCR引物，以oar-miR-127成熟體序列為模板設計莖環(huán)引物；利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預測綿羊miR-127基因啟動子，設計啟動子擴增引物(Primer 3, https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，測序引物由擎科生物公司合成(表1)。

表1 引物信息表

1.3 綿羊卵泡顆粒細胞總RNA提取與反轉錄

利用TRIzol試劑對收集的細胞進行總RNA提取。采用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific, 美國)進行濃度測定。將RNA稀釋至200 ng·μL-1，按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, Code No.RR047A)說明書進行cDNA合成。反轉錄體系包含10.0 μL去除基因組DNA的反應液，1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0 μL RT Primer Mix(反轉錄oar-miR-127時，換成oar-miR-127反轉錄引物)，4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2，4.0 μL RNase Free Water，反轉錄條件為42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4 miR-127啟動子區(qū)轉錄因子FOXO4結合位點預測和重組質粒的構建

1.4.1 miR-127啟動子區(qū)轉錄因子FOXO4結合位點預測 利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預測綿羊miR-127啟動子(NCBI，Gene ID: 102466274)，并利用JASPAR在線數據庫 (http://jaspar.genereg.net/) 預測oar-miR-127和轉錄因子FOXO4的結合位點，以分數為評判依據進行結合位點的篩選。

1.4.2FOXO4過表達載體構建 在Ensembl中下載綿羊FOXO4的CDS區(qū)序列，利用重組臂技術將目的片段(完整編碼區(qū))連接至pcDNA3.1(+)質粒。利用限制性內切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)過表達載體，膠回收純化，使用T4連接酶(北京全式金生物技術有限公司)在4 ℃條件下將目的條帶與酶切產物連接10 min，目的片段與酶切產物質量比為1∶6，連接產物轉化至感受態(tài)細胞Trans5α，過夜培養(yǎng)，利用SalⅠ酶切和測序篩選陽性克隆。

1.4.3 miR-127啟動子區(qū)熒光素酶報告載體構建 選取miR-127啟動子區(qū)包含轉錄因子FOXO4結合位點長度為600 bp的目的片段(-1 401～-2 000 bp)。 利用MluⅠ和Hind Ⅲ酶切pGL3-basic載體，膠回收純化，將目的條帶與酶切產物用T4連接酶在4 ℃條件下連接10 min，轉化至感受態(tài)細胞Trans5α，過夜培養(yǎng)，利用酶切(HpaⅠ、HindⅢ)和測序篩選陽性克隆。

1.5 靶基因FOXO4的3′-UTR miR-127結合位點預測與熒光素酶報告載體構建

利用TargetScan在線預測靶基因結合位點，選取包含miR-127結合位點長度為70 bp的FOXO4基因序列，在序列兩端添加SacⅠ、XbaⅠ酶切位點(表2)。將兩條鏈按照如下體系進行退火：FOXO4 3′-UTR正義鏈、反義鏈各10 μL，反應條件為95～25 ℃溫度梯度，每個梯度相差5 ℃，反應時間為2 min。利用SacⅠ酶和XbaⅠ酶對pmir-GLO質粒進行雙酶切，利用膠回收試劑盒回收純化酶切產物。利用T4連接酶在4 ℃條件下連接10 min， 轉化至感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后挑選菌落，利用PCR擴增和測序篩選陽性克隆。

1.6 293T和綿羊卵泡顆粒細胞轉染及雙熒光素酶活性檢測

1.6.1 293T細胞轉染 選取對數期的293T細胞，按1.6×105個·孔-1接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，待細胞匯合度達80%～90%時進行轉染。共轉染miR-127 mimic、mimicNC和FOXO4野生型質粒、突變型質粒、缺失型質粒(0.5 μg DNA，1.0 μL P3000TM，1.5 μL LipofectamineTM 3000)，每組設3個重復孔，轉染48 h后收集細胞進行熒光素酶的活性檢測。pcDNA3.1-FOXO4重組質粒與pGL3-basic(miR-127)的共轉染方法同上。

1.6.2 綿羊卵泡顆粒細胞轉染 將在體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細胞按1.6×105個·孔-1接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)。細胞匯合度達80%～90%時，利用HiPerFect Transfection Reagent將miR-127 mimic(50 nmol·L-1)、mimic NC(50 nmol·L-1) 轉染綿羊顆粒細胞(30 μL Optim-MEM，1.25 μL mimic/2.5 μLmimic NC，3 μL HiPer- Fect Transfection Reagent)，每組設3個重復孔，處理48 h后收集細胞進行RNA提取和反轉錄。轉錄因子FOXO4 過表達載體轉染綿羊卵泡顆粒細胞步驟同“1.6.1”。

1.6.3 熒光素酶活性檢測 轉染48 h后，將細胞收集于EP管中，用GloMax Multi Jr單管多功能檢測儀(Promega，美國)檢測熒光素酶活性，每管添加100 μL Stop & Glo Reagent，檢測海腎熒光素酶活性，重復檢測3次，計算螢光蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性比值。

1.7 qPCR檢測miR-127及相關基因表達

miR-127及mRNAs均按以下反應體系和條件進行設置，每個樣品設3個技術重復。qRT-PCR擴增體系為：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL (10 pmol·L-1)， Super Evagreen?qPCR Master Mix(Biotium，美國) 10 μL，ROX(100×) 3 μL，水5.2 μL。擴增條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。利用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量，miRNA表達量計算以U6為內參，mRNAs表達量計算以GAPDH為內參。

1.8 統(tǒng)計分析

數據使用GraphPad Prism8軟件進行作圖分析，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間基因表達量的差異，利用單因素方差分析相對熒光素酶活性，使用Duncan’s多重極差檢驗法進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 載體的構建

2.1.1 轉錄因子FOXO4過表達載體的酶切驗證 利用SalⅠ酶對轉錄因子FOXO4與過表達載體(pcDNA3.1+)的重組質粒進行單酶切，如圖1所示，酶切片段大小均符合目的片段的長度；將測序結果與目的片段序列進行比對，發(fā)現(xiàn)序列一致并無突變，說明質?？蛇M行下一步試驗。

2.1.2 miR-127啟動子區(qū)熒光素酶報告載體酶切驗證 利用HpaⅠ和Hind Ⅲ酶對miR-127啟動子區(qū)片段與pGL3-basic的重組質粒進行雙酶切，酶切片段大小與目的片段長度相符(圖2)，將測序結果與目的片段序列比對發(fā)現(xiàn)序列完全一致，說明重組質粒構建成功。

2.1.3FOXO4基因3′-UTR區(qū)結合位點熒光素酶報告載體構建 在線預測的綿羊miR-127與FOXO4基因3′-UTR二者的結合位點見圖3。依據該結合位點利用pmir-GLO載體構建FOXO4基因3′-UTR野生型、突變型和缺失型重組質粒。分別培養(yǎng)其單克隆菌，利用PCR鑒定陽性菌落，挑選符合目的片段大小的菌落擴增后進行序列測定。測序結果與原序列進行比對(圖4)，序列無突變，表明載體構建成功。

1.未酶切的pGL3-basic質粒；2.使用Hpa Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切重組質粒1. Undigested pGL3-basic plasmid; 2. Double digested recombinant plasmid with Hpa Ⅰand Hind III圖2 miR-127啟動子區(qū)熒光素酶報告載體重組質粒酶切電泳圖Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis diagram of the recombinant plasmid of the luciferase reporter vector in the promoter region of miR-127

2.2 綿羊miR-127與FOXO4基因的相互作用

2.2.1 轉錄因子FOXO4對miR-127啟動子轉錄活性及其表達水平的影響 利用JASPAR軟件預測并通過評分篩選，miR-127啟動子區(qū)與轉錄因子FOXO4的結合位點為GTGAACA，詳見表3。轉錄因子FOXO4過表達載體pcDNA3.1(+)和miR-127啟動子區(qū)重組質粒pGL3-miR-127共轉染293T細胞。如圖5所示，pGL3-miR-127+pcDNA3.1-FOXO4組熒光素酶活性值顯著低于pGL3-miR-127+ pcDNA3.1組(P<0.05，圖5A)，表明轉錄因子FOXO4負調控miR-127的表達。將FOXO4過表達載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1質粒分別轉染顆粒細胞，pcDNA3.1-FOXO4組 miR-127的表達水平顯著低于pcDNA3.1組(P<0.05，圖5B)，表明轉錄因子FOXO4抑制了miR-127的表達。

圖3 miR-127與FOXO4基因3′-UTR的結合位點Fig.3 The binding sites of miR-127 and FOXO4 3′-UTR

圖4 FOXO4重組質粒序列比對圖Fig.4 Alignment of recombinant plasmid sequence of FOXO4

表3 miR-127啟動子區(qū)與轉錄因子FOXO4預測結合位點

A.FOXO4過表達載體轉染293T細胞后熒光素酶活性值；B.FOXO4過表達載體轉染綿羊卵泡顆粒細后miR-127的相對表達量。*. P<0.05，下同A. Luciferase activity value after FOXO4 overexpression vector transfected into 293T cells; B. Relative expression level of miR-127 after FOXO4 overexpression vector transfected into ovine follicular granulosa cells. *. P<0.05, the same as below圖5 相對熒光素酶活性和miR-127的相對表達量Fig.5 Relative luciferase activity and relative expression of miR-127

2.2.2 綿羊miR-127與基因FOXO4間的靶向關系驗證 綿羊卵泡顆粒細胞中過表達miR-127后，F(xiàn)OXO4的表達量極顯著降低(P<0.01，圖6A)。為進一步驗證FOXO4與miR-127的靶向關系，進行了雙熒光素酶報告試驗。結果顯示，與共轉染mimic NC+FOXO4-WT野生型載體組相比，共轉染miR-127 mimic+FOXO4-WT野生型載體組的293T細胞中熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，圖6B)，表明miR-127可以靶向結合FOXO4 3′-UTR序列，抑制FOXO4基因的表達；分別與共轉染mimic NC+FOXO4-MUT突變型和共轉染mimic NC+FOXO4-DEL缺失型載體組相比，共轉染miR-127 mimic+FOXO4-MUT突變型和共轉染miR-127 mimic+FOXO4-DEL缺失型載體組的熒光素酶活性均無顯著差異(P>0.05，圖6B)，表明FOXO4 3′-UTR序列的突變和缺失均能消除miR-127對FOXO4基因的抑制作用，進一步表明miR-127可以靶向結合FOXO4基因3′-UTR序列，并抑制FOXO4基因的表達。

A. miR-127 mimic 或mimic NC轉染綿羊卵泡顆粒細胞后FOXO4基因的相對表達量；B. miR-127 mimic、mimic NC分別與FOXO4野生、突變、缺失型質粒共轉染293T細胞后相對熒光素酶活性A. Relative expression of FOXO4 gene after miR-127 mimic or mimic NC transfected into sheep follicular granulosa cells; B. The relative luciferase activity of miR-127 mimic, mimic NC and FOXO4 wild, mutant, and deletion plasmids transfected into 293T cells圖6 相對熒光素酶活性和FOXO4基因的相對表達量Fig.6 Relative luciferase activity and relative expression of FOXO4 gene

2.3 oar-miR-127對凋亡基因Casp3和Bax表達水平的影響

為探究miR-127對綿羊卵泡顆粒細胞凋亡的影響，轉染miR-127后檢測凋亡基因Casp3和Bax的mRNA表達變化。結果如圖7所示，與mimic NC組相比，miR-127 mimic能極顯著上調Casp3和Bax基因的表達(P<0.001)。

2.4 過表達轉錄因子FOXO4對細胞凋亡基因表達水平的影響

實時熒光定量PCR檢測過表達轉錄因子FOXO4的綿羊卵泡顆粒細胞中凋亡基因Casp3、Bax和BCL2的mRNA表達水平(圖8)。結果顯示，轉染過表達轉錄因子FOXO4后，Casp3和Bax基因相對表達量與轉染pcDNA3.1相比沒有顯著差異(P>0.05)，但BCL2基因相對表達量與轉染pcDNA3.1相比顯著降低0.4倍(P<0.05)。

A. 凋亡基因Casp3相對表達量；B. 凋亡基因Bax相對表達量。***.P<0.001A. Relative expression of apoptosis gene Casp3; B. Relative expression of apoptosis gene Bax. ***.P<0.001圖7 轉染miR-127顆粒細胞凋亡基因Casp3和Bax的表達水平Fig.7 Relative expression level of apoptosis genes Casp3 and Bax in granulosa cells

3 討 論

綿羊卵泡的發(fā)育與顆粒細胞增殖、凋亡密切相關[18]。卵泡的成熟過程中，大約99%的卵泡被淘汰而產生閉鎖，卵巢顆粒細胞是影響卵泡發(fā)育的重要“中介”，顆粒細胞凋亡會直接導致卵泡閉鎖，進而影響生殖功能[19]。miRNA在調節(jié)顆粒細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[15]。對oar-miR-127進行研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子FOXO4與miR-127的啟動子區(qū)結合，抑制了miR-127的表達；miR-127與靶基因FOXO4的3′-UTR區(qū)結合，抑制綿羊卵泡顆粒細胞中FOXO4基因的表達，并促進了細胞凋亡，明確了miR-127在卵泡顆粒細胞中的作用，間接表明miR-127通過靶向FOXO4可能促進卵泡顆粒細胞的凋亡，為闡明miR-127和FOXO4調控卵泡閉鎖機理提供了一定的理論依據。miR-127是內源性具有調控功能的非編碼RNA[20]，不同組織中miR-127的表達量不同，其在骨關節(jié)炎軟骨細胞中的表達顯著低于正常軟骨細胞，miR-127靶向下調adipoR1基因的表達，促進了軟骨細胞的增殖[21]。miR-127-3p可直接靶向于Ddit3基因的CDS區(qū)域，調控靶基因表達，顯著促進葡萄膜黑色素瘤細胞分化[22]；miR-127-5p特異性結合IRAK4，負調控其表達，誘導了肺炎鏈球菌肺泡上皮細胞凋亡[23]，miR-127-3p靶向下調MAPK4基因表達來抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡[24]。miR-96-5p通過靶向FOXO4抑制高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞凋亡并促進細胞增殖[10]，表明了miRNA可以通過靶向FOXO4調控細胞的增殖和凋亡。FOXO4是叉頭框轉錄因子家族成員之一[25-26]，能夠加速細胞集落的衰老，通過抑制細胞的凋亡進而維持人臍帶間充質干細胞的活力和功能[27]。miR-421通過抑制FOXO4基因的表達進而抑制致鼻咽癌細胞的增殖和凋亡[28]；FOXO4在人黃素化的壁顆粒細胞中表達[29]，表明其參與卵泡發(fā)育和黃體生成過程，在卵泡顆粒細胞凋亡過程中起著重要的調控作用，但有關FOXO4在卵泡顆粒細胞中作用的相關報道較少，其對綿羊卵泡顆粒細胞的作用機理和卵泡閉鎖的影響還需要深入研究。miR-128-3p通過抑制FOXO4和MMP9的表達來抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[30]。

A、B、C.表示過表達轉錄因子FOXO4后凋亡基因Casp3、Bax和BCL2相對表達量A, B, C. Represent the relative expression levels of apoptosis genes Casp3, Bax and BCL2 after overexpression of transcription factor FOXO4, respectively圖8 過表達轉錄因子FOXO4顆粒細胞中凋亡基因的表達水平Fig.8 The expression level of apoptotic genes in granulosa cells with overexpressed transcription factor FOXO4

4 結 論

本試驗證實了綿羊miR-127與轉錄因子FOXO4之間存在反饋抑制環(huán)路。此外，F(xiàn)OXO4通過下調抑凋亡基因BCL2的表達，miR-127通過上調促凋亡基因Casp3和Bax的表達，促進綿羊卵泡顆粒細胞的凋亡。