劉彥君 潘 麗 常振剛 孟豪杰 張國治

(1. 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2. 河南金谷實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，河南 鄭州 450003)

蝦青素廣泛存在于自然界中，是一種酮式類胡蘿卜素，具有抗癌、抗炎[1]、抗氧化[2]、保護(hù)皮膚[3]等多種生理功能。然而，蝦青素水溶性差，易受到光、氧、熱等外界條件的影響，容易被氧化、異構(gòu)化和降解，從而導(dǎo)致生物利用度低[4]。

脂質(zhì)體是由兩親性的磷脂分子組成的球狀小囊泡，能夠包埋親水性、親脂性或兩親性分子，具有緩釋調(diào)控作用[5]。將蝦青素包埋在脂質(zhì)體中，可以提高蝦青素的穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度[6]。但脂質(zhì)體在存放過程中容易發(fā)生聚集和融合等問題，傳統(tǒng)脂質(zhì)體中通常會添加膽固醇，因?yàn)槟懝檀伎梢哉{(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜的流動性、通透性，具有提高脂質(zhì)體膜穩(wěn)定性的作用[7-9]。然而，膽固醇含量過高會引發(fā)一些健康問題。植物甾醇與膽固醇具有相似的結(jié)構(gòu)，也能調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜的性質(zhì)，如酰鏈順序、彈性和側(cè)向組織[10]，并且可以降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白水平，具有良好的抗炎、抗氧化及抗癌等生理作用[11-13]。然而，植物甾醇具有高熔點(diǎn)(135 ℃)，并且在水相和油相中的溶解度極低，這導(dǎo)致其難以被直接應(yīng)用[14-15]。

將植物甾醇和脂肪酸進(jìn)行酯化反應(yīng)是提高植物甾醇脂溶性的有效方法之一。α-亞麻酸是一種人體必需脂肪酸，具有降血脂、抗癌和抗過敏等生理作用，但是由于含有3個不飽和雙鍵，穩(wěn)定性較差[16]。以植物甾醇和α-亞麻酸為原料制備植物甾醇α-亞麻酸酯，用于負(fù)載蝦青素的脂質(zhì)體的構(gòu)建，不僅能夠發(fā)揮植物甾醇和α-亞麻酸的雙重生理功效，降低α-亞麻酸的氧化速度，提高其穩(wěn)定性，而且可以提高植物甾醇的脂溶性，拓寬植物甾醇的應(yīng)用范圍。目前，國內(nèi)外關(guān)于使用植物甾醇酯構(gòu)建負(fù)載功能因子的脂質(zhì)體的研究尚處于初步探索階段。Hou等[17]以大豆磷脂為原料，采用薄膜—超聲法制備了植物甾醇丁酸酯脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)植物甾醇丁酸酯可以提高脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性、增加疏水烷基鏈的有序度及提高脂質(zhì)體膜的熱穩(wěn)定性等。

研究擬以植物甾醇和α-亞麻酸為原料制備植物甾醇α-亞麻酸酯，采用薄膜—超聲法，以大豆磷脂為主要膜材，構(gòu)建蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體，研究其包封率、粒徑大小及分布、zeta電位與微觀形貌等理化性質(zhì)，考察蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的潛在優(yōu)勢，為植物甾醇酯應(yīng)用于脂質(zhì)體的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

α-亞麻酸游離酸：純度80%，河南利諾生化有限責(zé)任公司；

植物甾醇：純度95%，宜春大海龜生命科學(xué)有限公司；

硅膠：60～100目，青島海洋化工有限公司；

蝦青素：純度98%，上海研域商貿(mào)有限公司；

大豆磷脂：純度98%，沈陽天峰生物制藥有限公司；

無水乙醇、正己烷、乙醚、石油醚：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

三氯甲烷：分析純，洛陽市化學(xué)試劑廠；

乙酸：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；

硫酸氫鈉：分析純，鄭州派尼化學(xué)試劑廠；

吐溫80：化學(xué)純，天津市鼎盛鑫化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子分析天平：AUY120型，島津國際貿(mào)易(上海)有限公司；

超導(dǎo)核磁共振儀：Bruker Avance 400 MHz型，瑞士布魯克公司；

氣相色譜儀：GC-2010型，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：PerkinElmer Spectrum TWO型，美國鉑金埃爾默股份有限公司；

超聲乳化分散器：JY92-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外可見分光光度計：T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

馬爾文激光納米粒度儀：Zetasizer Nano ZS90型，英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物甾醇α-亞麻酸酯的合成 參照張品[18]26-27的方法并稍作修改：稱取30 g質(zhì)量比為1∶2的植物甾醇和α-亞麻酸于250 mL的三口燒瓶中，油浴加熱至樣品溶解，加入2%的硫酸氫鈉，130 ℃恒溫反應(yīng)8 h后，冷卻至室溫，進(jìn)行水洗和醇洗，以除去催化劑和未反應(yīng)的α-亞麻酸。

1.2.2 植物甾醇α-亞麻酸酯的硅膠柱層析分離 采用硅膠柱層析法，濕法裝柱。洗脫劑為正己烷—乙醚—乙酸混合液(V正己烷∶V乙醚∶V乙酸=90∶10∶1)，填料高度為35 cm，洗脫速度為1.5 mL/min，每根試管的接收體積為10 mL。

1.2.3 植物甾醇α-亞麻酸酯的薄層色譜分析 薄層硅膠板在使用前置于烘箱中110 ℃活化1 h。將樣品用正己烷稀釋后，使用毛細(xì)管在薄層硅膠板上均勻點(diǎn)樣。在層析缸中加入配制好的洗脫劑，放入點(diǎn)樣后的薄層硅膠板，約20 min后取出，置于碘缸中顯色。

1.2.4 植物甾醇α-亞麻酸酯的氣相色譜測定 色譜柱為DB-5色譜柱；進(jìn)樣量1.0 μL；載氣(N2)流速50 mL/min；進(jìn)樣溫度300 ℃；檢測器溫度350 ℃；柱壓68 950 Pa；分流比50∶1；空氣流量400 mL/min；氫氣流量40 mL/min；升溫程序200 ℃保持1 min，30 ℃/min升至300 ℃，保持15 min。

1.2.5 植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照陳茂彬[19]的方法，以角鯊?fù)闉閮?nèi)標(biāo)物，分別得到植物甾醇中各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1。

1.2.6 植物甾醇α-亞麻酸酯純度測定 先對樣品進(jìn)行皂化處理：稱取0.150 0～0.200 0 g純化后的植物甾醇α-亞麻酸酯和0.030 0 g內(nèi)標(biāo)物角鯊?fù)橛?00 mL圓底燒瓶中，加入2 g氫氧化鈉和30 mL無水乙醇，置于磁力攪拌器中，79 ℃冷凝回流3 h，用超純水水洗并用正己烷萃取直至下層水相呈中性。取上層有機(jī)相清液進(jìn)行氣相色譜測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出植物甾醇α-亞麻酸酯的純度。

表1 植物甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程?

?y為植物甾醇中某甾醇的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比；

x為植物甾醇中某甾醇與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量之比。

1.2.7 植物甾醇α-亞麻酸酯紅外光譜分析 運(yùn)用傅立葉變換紅外光譜儀對植物甾醇和純化后的植物甾醇α-亞麻酸酯產(chǎn)品進(jìn)行分析。采用全反射光譜測定法，掃描范圍為4 000～400 cm-1，儀器分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16次。

1.2.8 植物甾醇α-亞麻酸酯核磁共振分析 取少量純化后的植物甾醇α-亞麻酸酯，溶解于氘代氯仿(CDCl3)中，利用核磁共振儀分析植物甾醇α-亞麻酸酯的核磁共振1H譜和13C譜。

1.2.9 蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的構(gòu)建

采用薄膜—超聲法構(gòu)建蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體，參照Pan等[20]的方法并稍作修改：稱取200.0 mg 大豆磷脂、20.0 mg植物甾醇α-亞麻酸酯和4.0 mg 蝦青素溶解于三氯甲烷中，避光旋蒸(50 ℃、60 r/min)除去三氯甲烷，加入含有Tween-80的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)洗膜15 min，形成脂質(zhì)體混懸液后迅速冷卻，進(jìn)行冰水浴超聲(180 W，5 s開，5 s關(guān))，超聲4 min 后即得蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體。

1.2.10 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照Pan等[20]的方法，采用分光光度計法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.140 3x-0.000 9(R2=0.999 9)。

1.2.11 包封率的測定 參照Pan等[21]的方法，按式(1)計算包封率。

EE=[(M0-M1)/M0]×100%，

(1)

式中：

EE——脂質(zhì)體對蝦青素的包封率，%；

M0——脂質(zhì)體中蝦青素的總質(zhì)量，mg；

M1——脂質(zhì)體中游離蝦青素的質(zhì)量，mg。

1.2.12 粒徑大小及分布、zeta電位的測定 采用馬爾文激光納米粒度儀測定蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑大小及分布、zeta電位。測定時將脂質(zhì)體樣品稀釋200倍，測定溫度為25 ℃。

1.2.13 透射電子顯微鏡觀察 參照Pan等[21]的方法運(yùn)用透射電子顯微鏡觀察蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的微觀形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物分離純化

薄層色譜法主要是根據(jù)混合物中各組分的極性間的差異，從而使極性不同的物質(zhì)能夠分離。以正己烷—乙醚—乙酸混合液(V正己烷∶V乙醚∶V乙酸=90∶10∶1)作為展開劑對反應(yīng)底物和反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析分離，結(jié)果如圖1所示。植物甾醇與α-亞麻酸進(jìn)行反應(yīng)后有新物質(zhì)生成，新物質(zhì)的擴(kuò)散速度比植物甾醇和α-亞麻酸快，說明新物質(zhì)的極性小，因此初步判定新物質(zhì)為植物甾醇α-亞麻酸酯[22]。從圖1可以看出，經(jīng)過數(shù)次醇洗已洗去大量未反應(yīng)的α-亞麻酸，得到的粗產(chǎn)品中只含有少量α-亞麻酸及一些因酯化反應(yīng)高溫而產(chǎn)生的雜質(zhì)。植物甾醇的斑點(diǎn)顏色較淺，這是由于植物甾醇的溶解度低。經(jīng)過柱層析分離純化后得到的目標(biāo)產(chǎn)物基本不含其他雜質(zhì)，且斑點(diǎn)顏色較深，說明經(jīng)過柱層析純化后大大提高了植物甾醇α-亞麻酸酯的純度。

A. α-亞麻酸 B. 植物甾醇 C. 粗產(chǎn)品 D. 植物甾醇α-亞麻酸酯純化產(chǎn)品

2.2 樣品純度分析

植物甾醇?xì)庀嗌V圖如圖2所示。植物甾醇各組分的結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)相近，區(qū)別主要是側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同。菜籽甾醇極性相對較強(qiáng)，最先出峰；β-谷甾醇極性最弱，最后出峰；豆甾醇和菜油甾醇的極性接近，因此出峰時間也較為接近[18]34-35。通過查閱文獻(xiàn)[23]，確定圖2中峰號1～4分別為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。圖3為皂化后植物甾醇α-亞麻酸酯純化產(chǎn)品(含角鯊?fù)?的氣相色譜圖，峰號5～9分別為角鯊?fù)椤⒉俗宴薮?、菜油甾醇、豆甾醇和?谷甾醇。將各甾醇與角鯊?fù)榈姆迕娣e比分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出植物甾醇α-亞麻酸酯的純度為(90.72±2.09)%。

1. 菜籽甾醇 2. 菜油甾醇 3. 豆甾醇 4. β-谷甾醇

5. 角鯊?fù)?6. 菜籽甾醇 7. 菜油甾醇 8. 豆甾醇 9. β-谷甾醇

2.3 植物甾醇α-亞麻酸酯的紅外光譜分析

紅外光譜可以用于鑒定植物甾醇及其酯衍生物的分子結(jié)構(gòu)。圖4中的曲線a，在1 055 cm-1和3 427 cm-1處分別是植物甾醇的C—O鍵的伸縮振動吸收峰和—OH鍵伸縮振動吸收峰[24]106-114；2 865 cm-1和2 934 cm-1分別是—CH2和—CH3的碳?xì)渖炜s振動吸收峰，1 375 cm-1和1 461 cm-1處分別是—CH3和—CH2的碳?xì)鋸澢駝游辗錥25]。在圖4中觀察到植物甾醇α-亞麻酸酯的紅外光譜中不存在—OH鍵的伸縮振動吸收峰，表明純化后的產(chǎn)品不含醇或者有機(jī)酸；同時，圖4中的曲線b在1 734 cm-1處出現(xiàn)了強(qiáng)烈的酯羰基(C═O)的特征吸收峰，1 171 cm-1處存在C—O—C的強(qiáng)吸收峰，說明有酯鍵生成[26]。以上結(jié)果表明純化后的產(chǎn)品是植物甾醇α-亞麻酸酯。

a. 植物甾醇 b. 植物甾醇α-亞麻酸酯

2.4 植物甾醇α-亞麻酸酯的核磁共振波譜分析

圖5為植物甾醇α-亞麻酸酯的1H譜圖。在δ=0.5×10-6～2.5×10-6范圍內(nèi)存在許多重疊的亞甲基氫吸收信號，低于1.0×10-6的信號峰主要是由于甲基基團(tuán)的共振引起[27]。查閱文獻(xiàn)[18]37-38[24]3-20得知δ=7.26×10-6處是CDCl3的溶劑峰位置，觀察圖5植物甾醇α-亞麻酸酯1H譜圖可知，樣品中含有烯氫(δ=4.5×10-6～6.5×10-6)，不含羧基氫(δ=9.0×10-6～12.0×10-6)、醛基氫(δ=9.5×10-6～10.0×10-6)及烯醇?xì)?δ=11.5×10-6～13.5×10-6)，說明樣品中不含羥基。

圖5 植物甾醇α-亞麻酸酯的1H譜

圖6為植物甾醇α-亞麻酸酯的13C譜圖。查閱文獻(xiàn)[24]35-42得知，酯碳δ為165×10-6～175×10-6，不飽和碳δ為100×10-6～155×10-6，飽和碳δ<55×10-6，CDCl3δ=77.019×10-6。由圖6可知，樣品中含有酯碳(δ=173.283×10-6)，次甲基與氧結(jié)合(δ=73.669×10-6)，表明植物甾醇和α-亞麻酸反應(yīng)后生成了酯并且酯化位點(diǎn)在植物甾醇六圓環(huán)上的一個羥基上。綜合以上分析，產(chǎn)物為植物甾醇α-亞麻酸酯。

圖6 植物甾醇α-亞麻酸酯的13C譜

2.5 蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的包封率

蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的包封率為(95.00±0.66)%，表明蝦青素可以有效地包埋到脂質(zhì)體中，這可能是因?yàn)橹参镧薮鸡?亞麻酸酯的摻入擴(kuò)大了脂質(zhì)體囊泡的內(nèi)部空間，并且與磷脂雙分子層相互作用，使脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，因此制得的脂質(zhì)體包封率較高[28-29]。

2.6 蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑大小及分布

根據(jù)粒徑大小可將脂質(zhì)體分為普通脂質(zhì)體(1～1 000 nm)和納米脂質(zhì)體(1～200 nm)，納米脂質(zhì)體具有細(xì)胞穿透性、靶向作用等優(yōu)點(diǎn)[30]，可以提高芯材穩(wěn)定性，控制釋放，提高生物利用度。測得復(fù)合脂質(zhì)體的平均粒徑為(158.70±9.70) nm，粒徑較小，為納米脂質(zhì)體。沈雪[31]制備的蝦青素乳狀液粒徑較大，為194～287 nm，可能是采用的制備方法不同導(dǎo)致的。

多相分散系數(shù)(PDI)可以用來表征脂質(zhì)體的粒徑分布均勻性，較小的PDI值表示脂質(zhì)體樣品分布更加均勻[32]。當(dāng)PDI值大于0.5時，表明脂質(zhì)體囊泡分布不均勻，體系中可能存在較大的囊泡[33]。粒徑大的脂質(zhì)體囊泡范德華吸引力強(qiáng)，更容易發(fā)生聚集和融合，因此體系不穩(wěn)定[34]。測得復(fù)合脂質(zhì)體PDI值為0.35±0.02，表明制得的蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體囊泡分布較為均勻。復(fù)合脂質(zhì)體的粒徑分布圖(圖7)為單峰形態(tài)且呈正態(tài)分布，表明該復(fù)合脂質(zhì)體分布均勻、分散性好。

圖7 復(fù)合脂質(zhì)體粒徑分布圖

2.7 蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的zeta電位

zeta電位的絕對值越高，表明脂質(zhì)體體系越穩(wěn)定。這是因?yàn)楫?dāng)電位絕對值較大時，脂質(zhì)體的表面電荷高，粒子之間的靜電斥力大，因此體系更加穩(wěn)定，不易發(fā)生聚集或融合。一般認(rèn)為當(dāng)zeta電位的絕對值大于30 mV時體系是穩(wěn)定的[35]。測得復(fù)合脂質(zhì)體的平均zeta電位為(-33.87±2.48) mV，表明制得的復(fù)合脂質(zhì)體具有穩(wěn)定性，脂質(zhì)體囊泡之間的靜電斥力可以有效避免聚集、融合。

2.8 蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡觀察

如圖8所示，蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體粒徑大小約為160 nm，脂質(zhì)體囊泡呈球形，分散均勻，形狀規(guī)則，與馬爾文激光納米粒度儀的測定結(jié)果一致。

圖8 復(fù)合脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡圖

3 結(jié)論

以植物甾醇和α-亞麻酸為原料制備植物甾醇α-亞麻酸酯，通過柱層析法和薄層層析法進(jìn)行分離純化，獲得了純度較高的產(chǎn)物，紅外光譜法和核磁共振法證實(shí)產(chǎn)物為植物甾醇α-亞麻酸酯。采用薄膜—超聲法構(gòu)建蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體，測得該復(fù)合脂質(zhì)體的包封率較高[(95.00±0.66)%]，馬爾文激光納米粒度儀測定結(jié)果顯示復(fù)合脂質(zhì)體粒徑較小并且分布較為均勻。透射電子顯微鏡觀察顯示蝦青素—植物甾醇α-亞麻酸酯復(fù)合脂質(zhì)體的微觀形貌呈近似球形，形狀規(guī)則且分散性好，與馬爾文激光納米粒度儀測定結(jié)果一致。研究表明植物甾醇α-亞麻酸酯可用于構(gòu)建脂質(zhì)體，這為植物甾醇酯應(yīng)用于負(fù)載脂溶性功能因子的脂質(zhì)體中的構(gòu)建提供了理論指導(dǎo)。植物甾醇α-亞麻酸酯保留了甾醇的剛性環(huán)狀結(jié)構(gòu)和烴鏈分支，摻入脂質(zhì)體中還可能會引起脂質(zhì)體穩(wěn)定性和釋放特性等性能的改變，因此，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步開展相關(guān)研究。