嚴婉盈 何敏恒 溫 恒 劉志鵬 余志聰

(1. 廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東 廣州 511447；2. 廣州匯標檢測技術中心，廣東 廣州 510700；3. 廣東省科學院生物工程研究所，廣東 廣州 510316)

乳制品是一種營養(yǎng)豐富、均衡的食物，富含蛋白質、脂肪、多種糖類及維生素等，是人類理想的營養(yǎng)補充品。但有研究[1]發(fā)現，乳制品中存在不同程度的農藥殘留，中國個別省份的牛奶中有機磷殺蟲劑檢出率達70.59%。殺蟲劑是畜牧業(yè)常用的農藥類型之一，然而施用后殺蟲劑可能在牛羊體內積累，導致乳制品中存在殺蟲劑殘留，危害食用者身體健康[2-3]。目前中國對于乳制品中殺蟲劑的限量要求和檢測方法并不完善，現行農藥殘留限量標準GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規(guī)定了生牛乳中54項殺蟲劑的最大殘留限量，其中有近50%的殺蟲劑無適用乳制品基質的國家標準檢測方法，為企業(yè)和檢測機構對乳制品的安全檢測帶來困難，對政府的安全監(jiān)管造成阻礙。目前市場上常用的殺蟲劑按化學結構可分成有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機氯類、新煙酰類、發(fā)酵抗生素類、雙酰胺類等，其來源、作用機理、化學性質均存在較大差異，而關于乳制品殺蟲劑檢測的報道集中在擬除蟲菊酯和有機氯類，且多為檢測某一類或兩類殺蟲劑[4]。乳制品作為高營養(yǎng)食品，基質復雜，準確定性定量其中的目標物有一定難度，建立一種適用多類型殺蟲劑同時測定的快速篩查方法將對乳制品生產和安全監(jiān)管具有重要意義。

目前殺蟲劑檢測的前處理技術主要包括固相萃取法[5]、分散固相萃取法[6]、液液萃取法[7]、凝膠滲透法[8]和低溫冷凍除脂法[9]等，其中分散固相萃取方法具有試劑消耗量少、快捷、高效的優(yōu)點，目前較多應用在蔬菜水果基質中[10-11]，在生乳基質中的應用相對較少。而殺蟲劑的檢測技術主要有液相色譜法[12]、液相色譜—串聯質譜法[13]、氣相色譜法[14]、氣相色譜—串聯質譜法[15]，其中液相色譜—串聯質譜法具有快速、高效、專一性好的特點，被廣泛用于農藥殘留量檢測，能顯著提高農藥痕量檢測的分析能力[16-17]。研究針對常見的乳制品基質(純乳、發(fā)酵乳、乳粉)，擬選擇8種目前無適用國家標準檢測方法的殺蟲劑作為研究對象，包括有機磷類的苯線磷，氨基甲酸酯類的滅多威和殺線威，新型煙酰類的吡蟲啉、呋蟲胺和噻蟲啉，發(fā)酵抗生素類的多殺霉素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，開發(fā)建立利用分散固相萃取凈化的超高效液相色譜—串聯質譜(UPLC-MS/MS)法，以期為后續(xù)開展乳制品中殺蟲劑殘留的風險監(jiān)測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

純乳、發(fā)酵乳、乳粉：市售；

苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉、殺線威標準品：100.0 mg/L，農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；

丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯：分析純，廣州化學試劑廠；

乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，德國默克公司；

氯化鈉(NaCl)、無水硫酸鎂(MgSO4)：分析純，廣州化學試劑廠；

弗羅里硅土(Florisil)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、十八烷基鍵合硅膠(C18)：分析純，廣州太瑋生物科技有限公司；

聚四氟乙烯(PTFE)微孔濾膜：0.22 μm，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

液相色譜串聯四級桿聯用儀：LC-30AD/TRIPLE QUAD 4500型，美國AB SCIEX公司；

電子分析天平：ME2002E型，瑞士梅特勒公司；

渦旋振蕩器：MS 3數顯型，德國IKA公司；

超聲波提取儀：KQ-118型，昆山舒美超聲儀器有限公司；

高速離心機：3K15型，德國Sigma公司；

自動氮吹濃縮儀：MV64型，美國LabTech公司；

超純水儀：Direct-Pure UP10型，上海樂楓生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取樣品(純乳10 g，發(fā)酵乳5 g，乳粉2 g)于50 mL離心管中，加入約45 ℃的超純水溶解混勻(純乳不需加，發(fā)酵乳中加5 mL，乳粉中加8 mL)，加入10 mL乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)、4 g無水MgSO4和1 g NaCl，超聲5 min后在5 500 r/min條件下離心5 min，吸取約5 mL上清液于15 mL離心管中，加入50 mg Florisil、100 mg PSA和400 mg無水MgSO4分散固相萃取凈化劑，渦旋混勻2 min，在5 500 r/min條件下離心5 min，吸取上清液過0.22 μm PTFE微孔濾膜，使用UPLC-MS/MS測定。同時做空白試驗。

1.2.2 標準溶液配置 分別準確移取1.00 mL苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉、殺線威的100.0 mg/L標準溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，得到10.0 mg/L 8種殺蟲劑的混合標準中間溶液。采用不含目標殺蟲劑殘留的陰性乳制品樣品，按1.2.1步驟處理，所得溶液為空白基質提取液。分別移取2.00，10.00，40.0，50.0，100.0 μL混合標準中間溶液至5個10 mL容量瓶中，用上述空白基質提取液定容，得2.00，10.0，40.0，50.0，100 μg/L的基質標準工作液曲線，現配現用。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Phenomenex Kinetex Biphenyl(100 mm×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫35 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈溶液；梯度洗脫(洗脫程序：0 min，90% A，10% B；3.00 min，40% A，60% B；7.00 min，5% A，95% B；7.10 min，90% A，10% B；10.00 min，90% A，10% B)；流速0.25 mL/min；進樣量10 μL。

1.2.4 質譜條件 電離方式為電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度350 ℃；多反應監(jiān)測模式(MRM)采集，8種農藥的保留時間、離子對等參數見表1。

表1 8種殺蟲劑的質譜參數?

2 結果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇 殺蟲劑的極性大多為中等極性或弱極性，利用有機物極性相似相溶的原理選擇合適的提取試劑。試驗比較了提取試劑乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯對生乳中8種殺蟲劑的提取效果，結果如圖1所示。乙腈作為提取溶劑時，回收率為78.1%～86.5%，符合試驗回收率要求；丙酮作為提取劑時，目標物易溶于溶劑中，回收率更高，但乳制品中脂肪含量較高，脂肪在丙酮中溶解度高，導致提取液顏色偏黃，色譜圖雜峰偏多；二氯甲烷作為提取劑時，乳化情況嚴重，試驗的重現性差；乙酸乙酯作為提取劑時，8種殺蟲劑回收率整體較低，均低于50%。而且乙腈適用于非極性或中等極性農藥的提取，適合的農藥極性范圍比其他溶劑廣，且提取出的脂類雜質較少，同時可快速沉淀蛋白[18]。綜合上述結果，試驗繼續(xù)嘗試在乙腈中加入小比例的丙酮，進一步增強目標物在試劑中的回收率，比較V乙腈∶V丙酮分別為90∶10，80∶20，70∶30時的提取情況，發(fā)現乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)可獲得最佳回收率，且樣品提取液顏色接近無色，色譜圖雜峰少，8種殺蟲劑的平均回收率為82.3%～93.1%(見圖1)。最終選擇乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)作為提取試劑。

圖1 提取劑對8種殺蟲劑回收率的影響

2.1.2 提取時間的優(yōu)化 試驗采用超聲方式提高提取目標物的效率，相比于機械振蕩或高速勻漿，超聲方式更易操作、耗時短、適合大批樣品同時處理。在以10 mL乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)為提取試劑的條件下，考察超聲時間(2，5，10，20 min)對8種殺蟲劑回收率的影響，結果(見圖2)表明，殺蟲劑在超聲處理5～10 min時回收率基本穩(wěn)定，均在80%以上，當超聲處理超過10 min后，個別殺蟲劑回收率有降低趨勢，分析是過長時間的超聲處理對殺蟲劑有降解作用[19-20]。因此，5 min為適宜的超聲時間。

圖2 超聲時間對8種殺蟲劑回收率的影響

2.1.3 凈化材料的確定 乳制品基質較復雜，需要凈化其中大量的蛋白質、脂肪、磷脂等干擾物，試驗采用分散固相萃取凈化。分散固相萃取常用的吸附劑主要有Florisil、PSA、GCB、C18與無水MgSO4等。Florisil能較好地吸附脂肪等雜質，是乳制品中使用最廣泛的凈化劑[21]；PSA主要吸附極性物質，包括糖、有機酸、脂肪酸、色素等；GCB能吸附色素和類固醇雜質，但對平面結構農藥有吸附作用，一般乳制品無明顯色素干擾；C18可以去除提取液中的脂類、糖類等親脂型雜質，在乳制品基質中作用與Florisil相近；無水MgSO4的吸水能力強，能保證其他吸附劑的凈化效果?；诖耍芯窟x擇三因素四水平正交試驗來優(yōu)化確定Florisil、PSA與無水MgSO4的最優(yōu)水平。正交試驗因素水平取值見表2，試驗設計及結果見表3。由表3可知，PSA的極差最大，其對凈化效果影響最大；3種吸附劑的最佳水平為Florisil 50 mg、PSA 100 mg、無水MgSO4400 mg。按照正交試驗所得最優(yōu)條件進行3次驗證實驗，測定其回收率分別為89.5%，92.3%，91.2%，平均值為91.0%，大于正交試驗中任意一組的殺蟲劑回收率，因此認為正交試驗結果為凈化材料的最優(yōu)條件。

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 質譜條件優(yōu)化 取8種殺蟲劑混合標準溶液，以20 μL/min的流速注入電噴霧離子源中，在正離子模式進行全掃描，選擇豐度比最強的離子作為檢測離子，8種目標物均能獲得穩(wěn)定高響應的[M+H]+作為母離子，對母離子進行二級質譜掃描，選擇豐度較高的兩個碎片離子為定性、定量離子，并對各個離子對的質譜參數進行優(yōu)化，使儀器的靈敏度、穩(wěn)定性處于最佳狀態(tài)，優(yōu)化后參數見表1。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗設計及結果

2.2.2 色譜條件優(yōu)化 流動相的選擇方面，乙腈體系洗脫能力中等，對殺蟲劑的分離度好，流動相中加入酸有利于目標化合物形成穩(wěn)定的[M+H]+，響應更穩(wěn)定，因此選擇乙腈/0.1%甲酸水溶液為流動相。進一步優(yōu)化梯度洗脫程序及流速(如“1.2.3 ”所述)，在100 mm的Biphenyl色譜柱上實現了8種殺蟲劑的良好分離，峰形對稱尖銳，信噪比高。圖3為空白純牛乳樣品中添加8種殺蟲劑的MRM色譜圖。

1. 呋蟲胺 2. 殺線威 3. 滅多威 4. 吡蟲啉 5. 噻蟲啉 6. 苯線磷 7. 多殺霉素 8. 甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽

2.3 方法學評價

2.3.1 線性方程、相關系數與方法檢出限 在2.00～200 μg/L 的質量濃度范圍內作苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉、殺線威的標準曲線。最佳條件下，目標物峰面積與濃度呈良好線性關系。根據儀器信噪比及前處理過程相關參數可得出該方法測得各組分的檢出限，見表4。

表4 8種殺蟲劑的線性方程、相關系數和檢出限

2.3.2 回收率和精密度 在10 g純乳、5 g發(fā)酵乳、2 g乳粉中準確加入一定量10.0 mg/L 8種殺蟲劑的混合標準溶液，得3個添加水平的陽性樣品(10，50，100 μg/kg)，在4 ℃冰箱冷藏放置12 h，按1.2.1步驟進行前處理，在最優(yōu)條件下測定8種組分在3種基質中的平均回收率，測定結果見表5。

表5 8種殺蟲劑的加標回收率和精密度值

2.3.3 基質效應的評價 在優(yōu)化后的前處理條件下對陰性樣品進行處理，按1.2.2配制基質混合標準工作溶液曲線，同時用純試劑配制同濃度的純試劑混合標準工作溶液曲線，依次進入HPLC-MS/MS檢測?；|效應(ME)主要通過計算分析物在同濃度的加標空白基質提取液和純溶劑標準溶液中的響應比值進行評價，計算公式如式(1) 所示。當ME>50%為強基質效應；20%～50%為中等基質效應；0～20%為弱基質效應。結果表明，在試驗條件下，8種殺蟲劑的基質效應在8%～17%，基質效應較弱，影響較小。

ME=(B/A-1)×100%，

(1)

式中：

ME——基質效應，%；

B——基質標準曲線斜率；

A——純溶劑標準曲線斜率。

2.4 實際樣品的測定

采用研究建立的方法對市售的10份純牛乳、10份酸牛乳、5份羊乳粉、5份牛乳粉樣品進行檢測，各樣品中均未檢出苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉和殺線威8種殺蟲劑殘留。

3 結論

研究建立了分散固相萃取—超高效液相色譜—串聯質譜法(HPLC-MS)測定乳制品(純乳、發(fā)酵乳、乳粉)中苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉和殺線威8種殺蟲劑殘留量的方法，該方法具有經濟簡便、靈敏度高、重現性好的優(yōu)勢，準確度和精密度均達到農藥殘留檢測的要求，適用于乳制品中殺蟲劑農藥殘留的快速確認和準確定量分析。