◎ 范 萌，曹曉玲

（武漢生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430415）

蒲公英是多年生草本植物，菊科，別名黃花丁、婆婆丁等，產(chǎn)地分布極廣。蒲公英憑借資源豐富、藥食兩用等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在食品、化妝品等領(lǐng)域發(fā)展迅速[1]。蒲公英活性物質(zhì)繁多，其中黃酮類物質(zhì)是蒲公英中重要的抗氧化物質(zhì)，同時(shí)也能抑制癌細(xì)胞和腫瘤血管的生長(zhǎng)、抑制自由基和致癌因子的產(chǎn)生，具有提高機(jī)體免疫力等功能[2]。本文采用乙醇提取法，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，為蒲公英深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英：市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：合肥博美生物；氫氧化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；六水三氯化鋁：上海滬試化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XMTD-400電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；752PC紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取18 mg干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容至30 mL，得0.6 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備成不同濃度溶液，于425 nm處測(cè)吸光度[3]。

1.3.2 蒲公英黃酮提取率的測(cè)定

將蒲公英粉碎后，按照一定料液比用乙醇浸提，浸提液經(jīng)濾紙過(guò)濾。取2 mL濾液，依次加入3 mL 0.1 mol·L-1六水三氯化鋁溶液和 5 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，用50%乙醇溶液定容至10 mL，靜置40 min后于425 nm處測(cè)吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到黃酮濃度，按照下列公式計(jì)算蒲公英黃酮提取率[4-5]。

式中：C-黃酮提取濃度，mg·mL-1；V1-定容體積，mL；V2-取樣體積，mL；M-蒲公英質(zhì)量，mg；V-浸提液體積，mL。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）乙醇濃度。將蒲公英粉末分別與濃度為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液按液料比15∶1（mL∶g）混合，置于50 ℃水浴浸提40 min，過(guò)濾后測(cè)吸光度并計(jì)算黃酮提取率。

（2）浸提時(shí)間。將蒲公英粉末用60%的乙醇溶液按液料比15∶1（mL∶g）混合，置于50 ℃水浴鍋中，分別浸提20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，過(guò)濾后測(cè)其吸光度并計(jì)算黃酮提取率。

（3）提取溫度。將蒲公英粉末用60%的乙醇溶液按液料比15（mL∶g）混合，分別置于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴鍋中浸提30 min，過(guò)濾后測(cè)其吸光度并計(jì)算黃酮提取率。

（4）液料比。將蒲公英粉末用60%的乙醇溶液分別按液料比（mL∶g）12.5∶1、15.0∶1、17.5∶1、20.0∶1和22.5∶1混合，置于50 ℃的水浴浸提30 min，過(guò)濾后測(cè)其吸光度并計(jì)算黃酮提取率。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 12.0軟件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蒲公英黃酮提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)4因素3水平共29組實(shí)驗(yàn)[6-7]，因素水平參照表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述方法，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線方程：Y=1.488X-0.017，R2=0.999 1，由此計(jì)算蒲公英黃酮的提取率。

2.2 單因素對(duì)黃酮提取率的影響

由圖1（a）可知，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，測(cè)得吸光值為0.445，黃酮提取率為3.10%，增大乙醇濃度，黃酮提取率開始下降；由圖1（b）可知，當(dāng)浸提時(shí)間為30 min時(shí)，測(cè)得吸光度最高為0.556，黃酮提取率為3.85%，浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)過(guò)短，均會(huì)導(dǎo)致黃酮提取率下降；由圖1（c）可知，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，測(cè)得的吸光值為0.598，黃酮提取率為4.13%，由于溫度的升高使分子的擴(kuò)散能力增強(qiáng)，黃酮類化合物更容易溶出，而超過(guò)50 ℃后吸光度和提取率開始下降；由圖1（d）可知，當(dāng)液料比為20∶1（mL∶g）時(shí)，測(cè)得的吸光值為0.638，黃酮提取率為4.40%，繼續(xù)增大液料比，黃酮的吸光度和提取率不再增加。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照29組不同的提取流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)算黃酮提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

2.3.2 方差分析及其顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)面模型P＜0.000 1表明該模型良好，失擬項(xiàng)P=0.151 4表明不顯著，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值基本一致，R2=0.946 8，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)可操作性較好。確定系數(shù)R2Adj為0.893 7表明該模型能解釋89.37%響應(yīng)值的變化，用該模型分析蒲公英黃酮的提取率較為合適。

采用Design-Expert 12.0軟件，以蒲公英黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下回歸方程。黃酮提取率=-87.061 58+0.839 367A+0.419 917B+4.914 40C+0.560 017D-2.5×10-4AB+9.4×10-3AC+3.25×10-3AD+4.9×10-3BC+2.35×10-3BD-0.024 200×10-3CD-6.273×10-3A2-5.585×10-3B2-0.095 760C2-6.722×10-3D2。

回歸模型的一次項(xiàng)A顯著，二次項(xiàng)都顯著，交互項(xiàng)AD、CD顯著，說(shuō)明不同的提取工藝與黃酮提取率之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。在模型模擬范圍內(nèi)，各因素影響黃酮提取率的順序?yàn)椋阂掖紳舛龋ˋ）＞提取溫度（B）＞浸提時(shí)間（D）＞液料比（C）。

2.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

為確定4因素及其相互作用對(duì)黃酮提取率的影響，進(jìn)行響應(yīng)面分析。每?jī)蓚€(gè)因素的互相作用響應(yīng)面圖如圖2所示。由圖2（a）～（c）可知，酒精濃度不斷增加時(shí)，提取率提高趨勢(shì)平緩，隨后急劇減少，酒精濃度對(duì)提取率影響顯著，隨著時(shí)間增加，提取率減少，酒精濃度及時(shí)間對(duì)提取率影響顯著，而改變液料比或提取溫度時(shí)，提取率變化趨勢(shì)平緩；由圖2（d）、圖2（f）可知，僅改變浸提時(shí)間，提取率變化趨勢(shì)平緩，當(dāng)同時(shí)改變液料比時(shí)，提取率有較大變化，浸提時(shí)間與液料比對(duì)提取率影響顯著。通過(guò)分析得到的工藝參數(shù)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作的可行性，確定最佳工藝組合參數(shù)為：乙醇濃度53%，提取溫度51 ℃，液料比21∶1（mL∶g），浸提時(shí)間25 min。采用此組合參數(shù)重復(fù)試驗(yàn)3次進(jìn)行驗(yàn)證，黃酮平均提取率達(dá)到4.86%，與預(yù)測(cè)值接近度為98.9%，表明該工藝參數(shù)可行。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蒲公英為原料，利用乙醇浸提法進(jìn)行黃酮的提取，以黃酮的提取率作為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝組合參數(shù)為乙醇濃度53%、提取溫度51 ℃、液料比21∶1（mL∶g）、浸提時(shí)間25 min，黃酮提取率可達(dá)4.86%，相比于單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得工藝，提取率提高了10.4%，表明該工藝參數(shù)可行。